關于菌種擴大培養緒論發酵的定義：利用微生物、動物和植物細胞的酶合成目的產物的過程。發酵工程的兩個里程碑：顯微鏡和通氣發酵罐第2頁,共63頁，星期六，2024年，5月第一節、概述第二節、種子制備的一般流程第三節、菌種生物活性檢測第四節、實驗室種子擴大培養第五節、種子質量控制措施

主要內容

第3頁,共63頁，星期六，2024年，5月第一節、概述1、定義：菌種的擴大培養就是把保藏的菌種，即砂土管，冷凍干燥管中處于休眠狀態的生產菌種接入試管斜面活化，再經過茄氏瓶和種子罐逐級擴大培養，滿足發酵所需種子的數量和質量的純種培養過程。這些純種的培養物稱為種子。

第4頁,共63頁，星期六，2024年，5月2、目前的發展趨勢菌種的擴大培養與發酵相分離——種子生產形成工業化：酒精工業釀造工業生物轉化某些特除代謝物菌體細胞固定化發酵無細胞發酵體系第5頁,共63頁，星期六，2024年，5月

目的：1）.生理適應：讓菌種從固體試管、液體試管……，逐步適應發酵罐的要求。如：啤酒酵母

2）.質量滿足：提供大量而新鮮的、具有較高活力的菌種。

a、縮短發酵周期、降低能耗、減少染菌的機會

b、為了使培養菌在數量上取得絕對的優勢，抑制雜菌的生長。

3).可以提高生產的成功率，減少“倒罐”現象。要求：純種。3、菌種擴大培養的目的及要求：第6頁,共63頁，星期六，2024年，5月

4.作為種子必備的條件：1）生命旺盛有活力，移種后，能迅速生長，縮短延滯期。2）菌體總量適宜，保證發酵罐的接種量。3）遺傳表現性要穩定；4）菌種要純。無雜菌污染。5）保持穩定的生產能力返回第7頁,共63頁，星期六，2024年，5月第二節、從保存菌種到生產用種子的一般流程第8頁,共63頁，星期六，2024年，5月確定流程的原則：1、保證發酵罐的菌種質和量；2、盡量縮短流程、以防治染菌。考慮因素：1、發酵罐的體積2、菌種的特性3、工藝上菌種量的要求第9頁,共63頁，星期六，2024年，5月主要步驟菌種生物活性檢測實驗室種子制備階段：瓊脂斜面至固體培養基擴大培養（如茄子瓶斜面培養等或液體搖瓶培養）生產車間種子制備階段：種子罐擴大培養返回第10頁,共63頁，星期六，2024年，5月第二節、菌種生物活性檢測返回第11頁,共63頁，星期六，2024年，5月第三節、實驗室種子擴大培養一、固體種子制備二、液體種子制備第12頁,共63頁，星期六，2024年，5月概念：種子罐的級數：種子在種子罐中擴大培養的次數。發酵罐的級數：種子罐數加一。接種量：是指移入的種子液體體積和接種后培養液體積的比例。或移入的種子液體積占接種前培養液體積的百分數。種齡：生產種子時的培養時間。孢子制備：用固體培養的種子叫孢子制備。種子制備：用液體培養的種子叫種子制備。第13頁,共63頁，星期六，2024年，5月種子制備的工藝流程通常有兩種方法：固體法：用于釀造業（醬油、白酒等），也是源于釀造業，有霉菌的純培養，也有混合培養如：大曲液體法：液體深層培養，適合于眾多發酵行業液體培養為主導方式。第14頁,共63頁，星期六，2024年，5月

斜面孢子孢子米粒孢子種曲菌體

一、固體菌種（一）固體菌種制備第15頁,共63頁，星期六，2024年，5月1、斜面菌種的制備定義：在試管或扁瓶（茄子瓶）內，以瓊脂固化的培養基表面生長的菌種培養物。斜面種子制備流程：培養基→分裝→滅菌→冷卻→擺斜面→接種恒溫培養→斜面種子制備中應注意的問題：1、瓊脂的用量2、裝量3、減少冷凝水4、不含有沉淀的固體物，用蒸餾水或去離子水5、微量元素先配成一定的，用移液管定量加入第16頁,共63頁，星期六，2024年，5月2、米粒孢子（米孢子）

米孢子：霉菌的孢子培養，接種到滅菌后的大米或小米顆粒上，恒溫培養一段時間后所產生的孢子。優點：⑴保存期較長，可用半年以上。⑵孢子量大，107-108個孢子/g米粒。質量標準：1.無雜菌污染，每500瓶抽樣檢查1-2瓶；2.足夠孢子數，發芽率80%；3.生產能力高；4.真空干燥后含水率小于8%；第17頁,共63頁，星期六，2024年，5月大米或小米↓水洗↓瀝干↓分裝↓混勻↓滅菌↓接種（搖勻）↓培養↓米孢子制備工藝流程：斜放，且搖翻動注意事項：1、浸泡時間及加營養液的量應掌握在滅菌后米粒熟透而不粘連。2、分裝量2-3厘米厚度3、米粒不要碰在瓶口4、前期搖動，后期不要再動5、米粒可存放半年，冰箱4℃、真空干燥蠟封。無菌蒸餾水↓斜面孢子↓孢子懸浮液第18頁,共63頁，星期六，2024年，5月3、種曲培養材料：麩皮、米糠、木屑、稻殼等檸檬酸、醬油、醋、糖化酶放線菌孢子的制備：瓊脂斜面培養基，碳源和氮源不要太豐富，干燥和限制營養可誘發孢子形成。培養溫度28℃，少數37℃；培養時間5-14天。霉菌孢子的制備：一般采用米孢子或種曲，培養溫度25℃-28℃，培養時間4-14天。細菌孢子的制備：瓊脂斜面培養基，碳源限量而氮源豐富的配方，牛肉膏、蛋白胨。培養溫度37℃，少數28℃；培養時間一般1-2天，產芽孢的細菌5-10天。第19頁,共63頁，星期六，2024年，5月（二）、固體種子質量控制措施影響孢子以及斜面質量的因素及控制影響孢子質量的因素通常有：原材料的質量滅菌條件培養條件培養時間冷藏時間接種量有害氣體和揮發物第20頁,共63頁，星期六，2024年，5月

1、原材料的質量麩皮：蛋白胨：無機離子含量不同：微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會影響孢子的質量。水質的影響菌種在固體培養基上可呈現多種不同代謝類型的菌落，氮源品種越多，出現的菌落類型也越多，不利于生產的穩定。第21頁,共63頁，星期六，2024年，5月解決措施（1）培養基所用原料要經過發酵試驗合格才可使用；（2）嚴格控制滅菌后培養基的質量；（3）斜面培養基使用前，需在適當溫度下放置一定時間；（4）供生產用的孢子培養基要用比較單一的氮源，作為選種或分離用的培養基則采用較復雜的有機氮源。第22頁,共63頁，星期六，2024年，5月2、培養條件（1）溫度（2）濕度（培養基內濕度，培養基外濕度）不同相對濕度對龜裂鏈霉菌斜面生長的影響第23頁,共63頁，星期六，2024年，5月

3、培養時間和冷藏時間（1）培養時間解決措施：孢子培養的時間應該控制在孢子量多、孢子成熟、發酵產量正常的階段終止培養。（2）冷藏時間冷藏時間對孢子的生產能力也有影響。例如慶大霉素生產中，孢子4℃冷藏15天，發酵單位比不冷藏的提高12－14％，孢子在鏈霉素生產中，斜面孢子在6℃冷藏兩個月后的發酵單位比冷藏一個月降低18%，冷藏3個月后降低35%。第24頁,共63頁，星期六，2024年，5月接種量大小影響到培養基中孢子的數量，進而影響菌體的生理狀況。第25頁,共63頁，星期六，2024年，5月二次生長

孢子斜面制備過程中由于營養過于豐富，或者濕度過大引起斜面上剛長出的孢子萌發形成菌絲體。同步生長(synchronousculture)：同步培養是一種培養方法，它能使群體中不同步的細胞轉變成能同時進行生長或分裂的群體細胞。以同步培養方法使群體細胞能處于同一生長階段，并同時進行分裂的生長方式稱為同步生長。通過同步培養方法獲得的細胞被稱為同步細胞或同步培養物。第26頁,共63頁，星期六，2024年，5月

二、液體種子制備——好氧培養

對于產孢子能力不強或孢子發芽慢的菌種，如產鏈霉素的灰色鏈霉菌（S.griseus）、產卡那霉素的卡那鏈霉菌（S.Kanamuceticus）可以用搖瓶液體培養法。將孢子接入含液體培養基的搖瓶中，于搖瓶機上恒溫振蕩培養，獲得菌絲體，作為種子。其過程如下：試管→三角瓶→搖床→種子罐第27頁,共63頁，星期六，2024年，5月

液體種子培養——厭氧培養

對于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其種子的制備過程如下：試管→三角瓶→卡式罐→種子罐第28頁,共63頁，星期六，2024年，5月制備過程中注意事項：⑴營養比斜面要豐富，保持pH穩定⑵裝量要適當，保持良好的通氣；好氧培養三角瓶40-50mL/250mL、60~80mL/500mL、90-110mL/750mL、120-150mL/1000mL。厭氧培養時裝液量增加一倍。⑶滅菌時要注意棉塞不要被打濕。⑷搖床轉速。⑸注意搖床上下、邊緣、中心的溫差。第29頁,共63頁，星期六，2024年，5月三、實驗室菌種質量標準無污染,菌落形態一致。性能穩定第30頁,共63頁，星期六，2024年，5月實例：生產啤酒的酵母菌制作返回第31頁,共63頁，星期六，2024年，5月實驗室制備的孢子斜面或搖瓶種子移接到種子罐進行擴大培養種子罐培養作用①、使菌種獲得足夠的數量，②、種子罐中的培養基更接近發酵罐培養的醪液成分和培養條件，譬如通無菌空氣，攪拌形式等等，以使菌體適應發酵環境

③、使孢子發芽，生長繁殖成菌（絲）體，接入發酵罐能迅速生長。

第四節、生產車間種子制備第32頁,共63頁，星期六，2024年，5月第33頁,共63頁，星期六，2024年，5月第34頁,共63頁，星期六，2024年，5月第35頁,共63頁，星期六，2024年，5月1、種子罐接種常用接種方法火圈保護法壓差法接種第36頁,共63頁，星期六，2024年，5月第37頁,共63頁，星期六，2024年，5月2、種子罐級數確定種子罐級數的因素：

（1）菌種生長特性、孢子發芽及菌體繁殖速度；（2）所采用發酵罐的容積。確定種子罐級數需注意的問題（1）種子級數越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機會（2）種子級數太少，接種量小，發酵時間延長，降低發酵罐的生產率，增加染菌機會（3）雖然種子罐級數隨產物的品種及生產規模而定。但也與所選用工藝條件有關。如改變種子罐的培養條件，加速了孢子發芽及菌體的繁殖，也可相應地減少種子罐的級數第38頁,共63頁，星期六，2024年，5月細菌：生長快，種子用量比例少，級數也較少，二級發酵。茄子瓶→種子罐→發酵罐霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發酵孢子懸浮液→一級種子罐（27℃,40小時孢子發芽，產生菌絲）→二級種子罐（27℃，10~24小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）→發酵罐放線菌：生長更慢，采用四級發酵酵母：比細菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用二級種子第39頁,共63頁，星期六，2024年，5月3、影響種子罐種子質量的因素1、培養基：逐步接近發酵培養基2、培養條件：溫度、溶氧3、種齡：對數生長期的菌絲細菌霉菌放線菌

7-24h16-50h21-64h.4、接種量；第40頁,共63頁，星期六，2024年，5月

接種種齡的影響

第41頁,共63頁，星期六，2024年，5月接種量的影響通常采用的接種量細菌1~5%酵母菌5~10%霉菌7~15%，有時20~25%植物細胞：30－50％第42頁,共63頁，星期六，2024年，5月接種量影響接種量的因素：菌種生長速度一般情況下：以大接種量較為適合適合的接種量的重要性：過大：菌絲生長過快，粘稠，營養基質缺乏，溶氧不足過小：菌絲體生長緩慢，發酵周期延長，產生菌絲團第43頁,共63頁，星期六，2024年，5月培養基的影響種子培養基成分要滿足以下要求：（1）營養成分適合種子培養的需要（2）選擇有利于孢子發芽和菌體生長的培養基；（3）營養上要易于被菌體直接吸收和利用；（4）營養成分要適當豐富和完全，氮源和維生素含量要高，并且成分盡可能與發酵培養基成分一致。（5）營養成分、液體環境（滲透壓、氧化還原電極電位、pH、水的離子活度等）要盡可能與發酵培養基相近。

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pH通過影響細胞質膜的透性、膜結構的穩定性和物質的溶解性或電離性來影響營養物質的吸收，從而影響微生物的生長速度。質子是一種唯一不帶電子的陽離子，它在溶液里能迅速地與水結合成水合氫離子(H3O+等)。在偏堿性條件下，0H-占優勢，水合氫離子和0H-對營養物質的溶解度和解離狀態，細胞表面電荷平衡和細胞的膠體性質等方面均會產生重大影響；在酸性條件下，H＋可以與營養物質結合，并能從可交換的結合物或細胞表面置換出某些陽離廣，從而影響紉胞結構的穩定性；同時由于pH值較低，CO2溶解度降低，某些金屬離子如Mn2＋、Ca2+等溶解度增加，導致它們在溶液中的濃度增加，從而對機體產生不利的作用。培養基的pH的影響第45頁,共63頁，星期六，2024年，5月第46頁,共63頁，星期六，2024年，5月圖：原核生物細胞膜上的電子傳遞鏈第47頁,共63頁，星期六，2024年，5月圖：與膜結合的ATP合成酶的結構和功能第48頁,共63頁，星期六，2024年，5月第49頁,共63頁，星期六，2024年，5月

pH通過影響細胞質膜的透性、膜結構的穩定性和物質的溶解性或電離性來影響營養物質的吸收，從而影響微生物的生長速度。質子是一種唯一不帶電子的陽離子，它在溶液里能迅速地與水結合成水合氫離子(H3O+等)。在偏堿性條件下，0H-占優勢，水合氫離子和0H-對營養物質的溶解度和解離狀態，細胞表面電荷平衡和細胞的膠體性質等方面均會產生重大影響；在酸性條件下，H＋可以與營養物質結合，并能從可交換的結合物或細胞表面置換出某些陽離廣，從而影響細胞結構的穩定性；同時由于pH值較低，CO2溶解度降低，某些金屬離子如Mn2＋、Ca2+等溶解度增加，導致它們在溶液中的濃度增加，從而對機體產生不利的作用。培養基的pH的影響第50頁,共63頁，星期六，2024年，5月培養的工藝條件的影響培養溫度攪拌溶氧通氣第51頁,共63頁，星期六，2024年，5月溫度對微生物生長的影響具體表現在：①影響酶活性，微生物生長過程中所發生的一系列化學反應絕大多數是在特定酶催化下完成的，每種酶都有最適的酶促反應溫度，溫度變化影響酶促反應速率，最終影響細胞物質合成。②影響細胞質膜的流動性，溫度高流動性大，有利于物質的運輸，溫度低流動性降低，不利于物質運輸，囤此溫度變化影響營養物質的吸收與代謝產物的分泌。③影響物質的溶解度，物質只有溶于水才能被機體吸收或分泌，除氣體物質以外，溫度升高，物質的溶解度增加，溫度降低物質的溶解度降低，最終影響微生物的生長。返回第52頁,共63頁，星期六，2024年，5月

第五節、種子質量的控制措施

菌種穩定性的檢查：將保藏菌株溶于無菌的生理鹽水中，逐級稀釋，然后在培養皿瓊脂固體培養基上劃線培養，長出菌落，選擇形態優良的菌落接入三角瓶進行液體搖瓶培養，檢測出生產率高的菌種備用

種子液生化分析項目：營養消耗的速度，pH變化，溶氧利用情況，色澤、氣味是否異常等。雜菌檢查：顯微鏡觀察，或平板培養試驗，即將種子液涂在平板培養皿上劃線培養，觀察有無異常菌落，定時檢查，防止漏檢

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1.種子質量標準

1）．細胞或菌體指標：菌體形態、菌體濃度以及培養液的外觀。形態：單細胞菌體－－－菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態。霉菌、放線菌－－－菌絲粗壯，對某些染料著色力強、生長旺盛、菌絲分枝情況和內含物情況良好。生長量：常用離心沉淀法、光密度法和細胞計數法等進行測定。外觀：如顏色、粘度等。

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