關于蛋白質組與蛋白質組學蛋白質組學DNAmRNA蛋白質轉錄翻譯基因蛋白質細胞特異性基因表達生理狀態蛋白質相互作用溫度應激狀態培養條件藥物作用數量有限結構相對穩定復雜性多變性直接反應生命現象復雜的調控第2頁,共49頁，星期六，2024年，5月蛋白質組與蛋白質組學的定義

蛋白質組

protein+genomeproteome

一種基因組所表達的全套蛋白質一個細胞或一個機體的基因所表達的全部蛋白質第3頁,共49頁，星期六，2024年，5月蛋白質組學旨在闡明生物體全部蛋白質的表達模式與功能模式從整體的角度分析、鑒定細胞內動態變化的蛋白質的組成、結構、性質、表達水平與修飾狀態,了解蛋白質之間、蛋白質與大分子之間的相互作用與聯系,揭示蛋白質的功能與細胞生命活動的規律

一、蛋白質組與蛋白質組學的定義第4頁,共49頁，星期六，2024年，5月蛋白質組及其質點的分離與分析

第5頁,共49頁，星期六，2024年，5月

根據蛋白質溶解度、分子大小及形狀、電離性質、生物學功能的差異進行：

1、根據溶解度

2、根據分子量透析和超濾平衡離心凝膠過濾層析

（三）蛋白質混合物的分離方法一、分離純化第6頁,共49頁，星期六，2024年，5月第7頁,共49頁，星期六，2024年，5月第8頁,共49頁，星期六，2024年，5月3、根據電荷毛細管電泳離子交換層析一、分離純化第9頁,共49頁，星期六，2024年，5月4、根據蛋白質的親和能力親和層析第10頁,共49頁，星期六，2024年，5月（四）蛋白質分離純化的條件緩沖液鹽、金屬離子和螯合劑還原劑去垢劑蛋白酶抑制劑表面效應蛋白質的環境因素溫度儲存

一、分離純化第11頁,共49頁，星期六，2024年，5月二、分析鑒定（一）Western印跡技術基本操作步驟：蛋白樣品的制備

SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質的電轉移蛋白質與抗體的結合反應目標蛋白質的顯示western印跡基本步驟圖示第12頁,共49頁，星期六，2024年，5月Western免疫印跡用于測定特定蛋白質的大小和含量

基本原理將經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白組分從凝膠轉移至固相支持體上，以針對特定蛋白質的抗體作為探針，與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現的抗原表位進行特異性反應，結合上的抗體可用二抗檢測。常用的二抗是與辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶偶聯的抗免疫球蛋白或A蛋白；實際應用中常常還需要設置適當的對照。第13頁,共49頁，星期六，2024年，5月常需要內參蛋白量化蛋白量；GAPDH、ACTIN、ALBUMIN……第14頁,共49頁，星期六，2024年，5月

將SDS的高分辨能力與抗原抗體反應的特異性、敏感性相結合(靈敏度達到ng級)

蛋白電泳在變性條件下進行，消除了蛋白溶解、聚集以及與外來蛋白共沉淀等問題

特點第15頁,共49頁，星期六，2024年，5月免疫熒光法(immunofluorescence)主要用于檢測目的蛋白在細胞內的定位。

基本原理將待檢的目的蛋白作為抗原，固定在載玻片上，先加上針對目的蛋白的抗體(第一抗體)進行反應，再加上針對第一抗體的熒光素標記抗體(第二抗體)進行反應，稱作間接免疫熒光法。如果將熒光素標記在第一抗體上，則不用再加第二抗體，稱作直接免疫熒光法。

特點

需要在熒光顯微鏡下觀察結果；

無法檢測目的蛋白的大小；操作簡便，但需設立必要的對照；第16頁,共49頁，星期六，2024年，5月免疫熒光法(immunofluorescence)例1例2第17頁,共49頁，星期六，2024年，5月免疫沉淀(immunoprecipitation)技術

將抗體加入蛋白混合溶液，使之與相應抗原結合；

加入固定的抗體結合蛋白(如:ProteinA-瓊脂糖珠)；

經離心后，與ProteinA結合的抗原-抗體復合物便可沉淀；

將樣品變性后即可獲得游離的抗原蛋白；

基本步驟

基本原理利用一種可離心沉淀的抗體結合蛋白(如ProteinA,ProteinG等)，將抗原-抗體復合物從蛋白混合溶液中分離，進行定量或定性研究。為方便后續分析，在免疫沉淀前，常會對抗原進行標記。第18頁,共49頁，星期六，2024年，5月免疫共沉淀(co-IP)技術

基于與蛋白質X的生理性相互作用，如果用蛋白X的抗體免疫沉淀X，則蛋白質Y也可能沉淀下來。Y的這種免疫沉淀被稱為免疫共沉淀(co-immunocipitation,Co-IP)，此法最常用于測定兩種目標蛋白質在體內的結合。YABY裂解細胞免疫共沉淀蛋白質X第19頁,共49頁，星期六，2024年，5月（二）二維凝膠電泳（2-DE)

是目前蛋白質組研究中最有效的分析鑒定技術之一由兩相組成：第一相：等電聚焦凝膠電泳根據蛋白質電荷差異第二相：SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳根據蛋白質分子量差異二、分析鑒定第20頁,共49頁，星期六，2024年，5月二維雙向電泳(2Delectrophoresis)

基本原理基于等電點與分子量分離蛋白質IEF-focusedproteinsSDS-chargedproteinsinIPGstripSDS-chargedproteinsresolvedaccordingtosizesinSDSgel第21頁,共49頁，星期六，2024年，5月2-DE原理示意圖二、分析鑒定第22頁,共49頁，星期六，2024年，5月2-DE分析的基本步驟蛋白質溶解變性還原去除蛋白質雜志利用不同pK固定化電解質可配置不同pH范圍的凝膠或利用商業化軟件設計

第一相電泳：IPG－IFE平衡第二相電泳：SDS－PAGE考馬斯亮藍染色、銀染色、銅染色樣品制備IPG膠制備雙相電泳染色二、分析鑒定第23頁,共49頁，星期六，2024年，5月2-DE獲得的蛋白質圖譜

二、分析鑒定第24頁,共49頁，星期六，2024年，5月優點：可以同時直觀顯示數千個蛋白質點；缺點：耗時，耗力，目前無法自動化；難以分離疏水、具極端分子量或等電點的蛋白質（如膜受體蛋白、組蛋白等）。二維雙向電泳(2Delectrophoresis)silverstaining(~3000spots)第25頁,共49頁，星期六，2024年，5月蛋白質染色考馬斯亮藍染色銀染：靈敏度高；“雪崩”效應；末端封閉銅染第26頁,共49頁，星期六，2024年，5月

通過2-DE得到的蛋白質分離圖譜，需要經過攝像或掃描轉換為以像素為基礎的、具有不同灰度強弱和一定邊界方向的斑點電腦信號。

(三)圖像分析技術二、分析鑒定第27頁,共49頁，星期六，2024年，5月2-DE圖像分析軟件包操作過程：

圖像采集斑點檢測背景消減獲得蛋白質相關信息圖像內及圖像間的比較二、分析鑒定第28頁,共49頁，星期六，2024年，5月

放射性核素標記親和標簽法正常細胞D0親和標簽病理細胞D8親和標簽混合并消化生物素親和純化液相色譜－質譜聯用分析測量兩個不同樣品中蛋白質的相對豐度二、分析鑒定第29頁,共49頁，星期六，2024年，5月蛋白芯片(proteinchip)技術

將一系列“誘餌”蛋白以陣列方式固定在經過特殊處理的底板上，然后將其與待分析的樣品雜交，只有那些和“誘餌”結合的蛋白才被保留在芯片上。其實質是酶聯免疫吸附測定。基于蛋白質表面化學及質譜檢測的高通量蛋白質分析技術第30頁,共49頁，星期六，2024年，5月蛋白芯片(proteinchip)技術

基本方法

蛋白質的結合：未經處理的樣品(如血清，尿液等)直接點在芯片上，根據芯片表面不同的化學或生物特性結合相應的蛋白質；

清洗減少非特異性蛋白(如鹽及其它污染物)的結合；

加能量吸收分子(EAM)：EAM能有效的吸收激光的能量，使樣品分子進入氣相并得到電離；

用表面增強的激光解吸電離法(SELDI)將保留在芯片上的蛋白質洗脫下來；

電離的蛋白質可以通過飛行時間質譜儀精確地測定它們的質量；第31頁,共49頁，星期六，2024年，5月蛋白芯片(proteinchip)技術從未經提純的生物或臨床樣品中直接捕獲、檢測和分析蛋白質不需任何標記或加尾

超高的檢測靈敏度(1-50fmole的蛋白質)

從超小樣品體積(0.5μl)到大體積(400μl)

快速獲取實驗結果第32頁,共49頁，星期六，2024年，5月蛋白芯片(proteinchip)技術

ProteinChip的應用第33頁,共49頁，星期六，2024年，5月蛋白質芯片第34頁,共49頁，星期六，2024年，5月原理樣品分子離子化后，根據不同離子間的質量和電荷比值（質荷比，m/e）的差異確定分子量。應用蛋白質的序列分析研究蛋白質的修飾（五）質譜技術二、分析鑒定

第35頁,共49頁，星期六，2024年，5月（六）其它方法Edman降解法測定蛋白質多肽的排列順序。核磁共振（NMR）、熒光光譜法測定溶液中蛋白質分子的結構。X射線衍射分析法、小角中子衍射法測定晶體蛋白質的分子結構等。二、分析鑒定第36頁,共49頁，星期六，2024年，5月蛋白質數據庫及其應用

第37頁,共49頁，星期六，2024年，5月蛋白質數據庫及其應用二、蛋白質數據庫的應用

一、蛋白質數據庫(ProteinDatabase)第38頁,共49頁，星期六，2024年，5月一、蛋白質數據庫（一）蛋白質序列數據庫（二）蛋白質結構數據庫（三）蛋白質直系同源簇數據庫（四）DIP數據庫第39頁,共49頁，星期六，2024年，5月一、蛋白質數據庫（一）蛋白質序列數據庫

SWISS-PROT數據庫：

http://www.ebi.ac.uk/swissprotPIR和PSD數據庫

//pir第40頁,共49頁，星期六，2024年，5月

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