第第頁植物產品品質分析5.1蛋白質和氨基酸的測定蛋白質是生命的物質基礎，它的含量是衡量農、畜、水產品品質的緊要指標，在育種、食品和飼料等工作中常常需要測定蛋白質的含量。氨基酸是構成蛋白質的基本單位，也是蛋白質的分解產物。全氨基酸和個別氨基酸的分析測定是討論蛋白質、酶的化學構成及性質的緊要手段。生物學及農業科學的很多領域都需要分析氨基酸。在評價谷物的蛋白質營養價值時需要測定游離氨基酸及蛋白質的氨基酸構成，動植物產品中的氨基酸以多種形式存在，大致可分為兩種，即構成蛋白質的氨基酸和游離的氨基酸，另外，還有少量的由肽鍵連接的幾個氨基酸，以及與糖或脂結合在一起的，在入類和動物營養學上，各種氨基酸含量的高處與低處是很緊要的，特別是有幾個限制性氨基酸，如稱為“**、**限制氨基酸”的賴氨酸和色氨酸，是必需氨基酸，即必需從食物中直接汲取，而不能由入與動物利用食物中的其它成分自身合成，卻又對入和動物的生長發育起側緊要作用的氨基酸；若缺乏這些氨基酸，入和動物不僅不能正常發育，還會引起某些**，而這些氨基酸在貯存和加工的過程中極易損失破壞，因此它們的實際含量已成為衡量谷物、飼料蛋白質的緊要標準之一5.1.1蛋白質的測定蛋白質的分析方法很多，可分為兩類，即間接法和直接法。間接法是利用蛋白質中含有肯定量的氮，通過測定樣品中的含氮量再乘以換算系數，計算出蛋白質的含量，如開氏法；直接法是依據蛋白質的理化性質，測定蛋白質的方法，如染料結合法、雙縮脲法和螢光法等，*常用的方法是開氏法，但開氏法測定的氮中還包含有氨基酸、酰氨等非蛋白質氮，故稱由此而計算出的蛋白質為“粗蛋白質”。假如蛋白質用重金屬鹽等沉淀分別以后，進行全氮測定，由氮換算而成的蛋白質的含量，則稱為“純蛋白質”。開氏法是測定全氮量的經典方法，被用于測定各種形態的有機氮。由于設備簡單易得，結果牢靠，為一般試驗室所采納。開氏法測定籽粒中粗蛋白質的方法原理是，依據同類植物籽粒中蛋白質的含氮量基本上是固定不變的。氮是蛋白質中的重要成分。因此，可用開氏法消煮定氮（參見土壤全氮的測定），再將測得的含氮值乘以蛋白質換算系數，即得粗蛋白質含量。氮含量換算成蛋白質的系數，一般采納6.25，這是由蛋白質平均含氮16％為依據導出的值，但不同植物籽粒中蛋白質的含氮量有差異，故由氮換算為蛋白質的因數也稍有不同，如大麥、黑麥、燕麥籽粒的系數為5.83、大豆5.71、其他豆類6.25、但開氏法操作手續較繁，分析的速度較慢，試劑費用較高。近年，已經顯現幾種以開氏法原理為基礎的全自動或半自動的開氏定氮儀、蛋白質分析儀。這些儀器雖然自動化程度較高，但價錢昂貴。在生產和科研工作中，為了完成大批樣品的分析，需要采納快速、簡易的分析方法，例如染料結合法、雙縮脲法、水合茚三酮法、亮磺化黃素螢光法、紅外光譜法、核磁共振法、測定開氏消煮液中銨的靛酚藍比色法法和納氏比色法。5.1.2同類種子中蛋白質的測定（染料結合法，DBC法）方法原理蛋白質中的堿性氨基酸（賴氨酸、精氨酸和組氨酸）的—NH2、咪唑基和胍基，以及蛋白質未端自由氨基在pH2～3的酸性緩沖液體系中呈陽離子狀態存在，可以和偶氮磺酸染料類物質如桔黃G，酸性橙12等的陰離子結合，形成不溶于水的蛋白質—染料絡合物而沉淀下來。通過測定肯定量樣品與肯定量體積的已知濃度染料溶液反應前后溶液中染料濃度的變化，可計算出樣品的染料結合量，即每克樣品所結合的染料的毫克數。染料結合量的大小反映出樣品中堿性氨基酸的多少。在小麥、大麥、水稻、大豆、花生等種子中，蛋白質的含量與堿性氨基酸的含量之間有很好的相關性。因此，可以用染料結合量來評比同種作物種子大量原始材料之間蛋白質含量的高處與低處。假如要從染料結合量來計算樣品的粗蛋白質的含量，則需要用開氏法測定同類種子的一批樣品的粗蛋白質，同時也用染料結合法測定其染料結合量，然后求出粗蛋白質對染料結合量的回歸方程或繪出回歸曲線。這樣，測定未知樣品的染料結合量，就可以從回歸方程計算或查回歸曲線得到粗蛋白質了。若只需比較蛋白質含量的高處與低處（如在篩選同種作物種子的大批樣品時），則不必知道蛋白質的**含量，而只要測定樣品的染料結合量即可進行比較。此法簡單、快速，與開氏法的相關性較好但精準性較差，適用于大批樣品的篩選工作。操作步驟1.樣品的測定稱取0.25mm篩子的谷物樣品0.2～0.7g（x.xxx），放入30mL試管中，加入染料溶液20mL，蓋緊試管口，振蕩60min，使樣品和染料溶液充分反應，取反應后的渾濁液（8～10mL即可）注入離心管中以3000rmin—1的速度離心8～12min，至上部溶液澄清為止，以下操作步驟同標準曲線。2.標準曲線與樣品測定的同時，取1000mgL—1的染料溶液10、30、50、60、70、80mL放入100mL容量瓶中，用水定容，即得濃度系列為100、300、500、600、700、800mgL—1的染料標準溶液，可用GXD—201型蛋白質分析儀測定，繪制標準曲線；也可以把染料溶液用水稀釋50倍后，用0.5cm比色槽和482nm的波長測定，繪制標準曲線。3.回歸方程選取粗蛋白質含量從低到高（如小麥種子粗蛋白質含量可從7～17％）的同一類谷物樣品35個左右，用開氏法測其粗蛋白質，并用上述方法測定各樣品的染料結合量。依據所得的結果，計算出染料結合量與蛋白質之間的回歸方程。從測得的未知樣品的染料結合量，求出蛋白質的含量。結果計算樣品的染料結合量B=V*10—3*（C0—C）/m式中：B：每克樣品所結合的染料的毫克數mgg—1；V：加入染料溶液的總體積mL；10—3：將mL換算成L的系數C0：染料溶液的初始濃度，mgL—1；C：染料結合反應后殘余溶液中的染料濃度，mgL—1；m：樣品的質量，g。注意事項1.在偶氮磺酸染料中，除桔黃G外，也可以使用酸性12（AcidOrangel2，縮寫AO12，C16H11O4N2SNa，分子量305.37），它的分子結構與桔黃G基本相同，也含有一個偶氮發色基團，但只有一個磺酸基，即一個結合堿基的位置（桔黃G二個），后者每個堿基結合點引起的顏色變化約是桔黃G的兩倍。故其更適合于在染料結合法中應用，它們在482nm左右有一個較寬的汲取峰，便于比色測定。2.樣品稱樣量按蛋白質含量的高處與低處而定，水稻、小麥、大麥等樣品可稱取0.5g，玉米稱取0.7g，大豆稱取0.2g，花生及魚粉等可少一些。3.染料結合反應的條件，如染料的pH、樣品的粒度、振蕩反應的時間和溫度等都會影響測定的結果，故每次測定應力求反應條件一致，特別是在測定樣品與測定回歸方程的樣品時，反應條件尤需一致。5.1.3氨基酸的測定氨基酸分析包括測定氨基酸的總含量及氨基酸中每個氨基酸的含量兩個方面。測定氨基酸總量的方法與蛋白質分析有緊密的關系，很多測定蛋白質全氮含量的方法如開氏定氮法及各種比色法均可用于測定氨基酸的總含量。此外，測定氨基酸總含量的方法還有氨基氮的甲醛滴定法，測定ａ—氨基氮的范司克萊法及茚三酮比色法等。近代進展起來的各種色譜法是分析全氨基酸的有力工具。薄層層析是60時代進展起來的分析方法，它操作簡便、設備簡單、層析速度快、靈敏度高，已廣泛應用于分別和測定氨基酸。近二十年來，應用氣相色譜法分析氨基酸已進行了大量的工作。氣相色譜法具有分析速度快、靈敏度高的特點，儀器的成本也比氨基酸自動分析儀低。尤其是在分析氨基酸的對映異構物及超微量（ng）樣品時，氣相色譜有特別的作用。氨基酸自動分析儀是應用*廣泛的分析氨基酸的專用儀器5.1.3.1谷物和飼料中賴氨酸的測定[染料結合法（DBL法）]賴氨酸是一種入與動物必需氨基酸，缺乏賴氨酸不僅不能正常發育，還會引起某些**。在絕大多數谷物中，賴氨酸是*缺乏的氨基酸，被稱為“**限制氨基酸”。它在谷物貯存、加工過程中，又很不穩定，易于脫去氨基、被氧化或是發生變質而損失破壞，或變成營養上的“無效”。因此賴氨酸的實際含量已成為衡量谷物、飼料蛋質白品質的緊要指標。測定賴氨酸的方法很多，屬于化學的方法有2，4，6，三硝基苯磺酸（TNBS法），1—氟2，4—二硝基苯法（FDNB法）和2—氯—3，5—二硝基吡啶法（CNPY法）等，這些方法的共同缺點是操作手續冗長費時，還需要某些特別的試劑，不適用于成批樣品的分析。離子交換色譜法（氨基酸自動分析儀法）仍被認為是標準法，但儀器昂貴不能普及。現在國內外應用較廣泛的是簡便易行的賴氨酸測定法。方法原理染料結合法可用于測定樣品中蛋白質的堿性氨基酸，包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸。假如先將樣品用丙酸酐處理，丙酸酐便將賴氨酸的—NH2酰化掩蔽，使其失去了和染料結合的本領。然后，分別測定酰化前后的DBC值。酰化前的測定值為賴氨酸、組氨酸、精氨酸的總和。而酰化后只是組氨酸和精氨酸，以上兩項測定結果的差值，就可計算出賴氨酸的含量。操作步驟1.標準曲線配制濃度分別為1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9mmolL—1的標準溶液（工作液）。吸取各工作液20.00mL分別加入半飽和乙酸鈉溶液2.00mL及磷酸鹽緩沖液0.20mL，充分混勻，在GXD—201型蛋白質分析儀上測定，繪制工作曲線。也可以用磷酸鹽溶液稀釋50倍后，用0.5cm比色槽和482nm波長，以分光光度計測定，繪制工作曲線。2.樣品的測定稱取0.1xx～0.8xxg（因樣品蛋白質含量高處與低處而定）已粉碎過60目篩四份，供制酰化和不酰化樣品各兩份。分別加入30～35mL具塞玻璃的或聚四氟乙烯的試管中，標明為A、B管（酰化樣品）和C、D管（不酰化樣品）。同時應另稱樣品測定水分含量。（1）丙酰化反應各管分別加入160gL—1乙酸鈉溶液2.00mL，然后加丙酸酐0.20mL于A、B管中，加磷酸鹽緩沖溶液0.20mL于C、D管中。蓋緊塞子，放置在往復振蕩機上振蕩10min。（2）染料結合反應向A、B、C、D管中各加入染料溶液20.00mL，蓋緊塞子，置于振蕩機上振蕩1h，使染料結合反應達到平衡。（3）離心將以上反應液在3000～4000rmin—1下離心10min。（4）測定在GXD—201型蛋白質分析儀或分光光度計上測測。結果計算賴氨酸％（干基）={[3.89—（1.11*CC.D）]/mC.D—[3.89—（1.11*CA.B）]/mA.B}*20/1000*146.2/1000*100式中：CA.B、CC.D：各為酰化與不酰化樣品的剩余染料溶液濃度，mmolL—1；mA.B、mC.D：各為酰化與不酰化樣品質量，g；20：為加入染料溶液量，mL；1.11：為（20+2+0.2）與20之體積比；3.89：酸性橙紅染料溶液初始濃度，mmolL—1；146.2：賴氨酸的摩爾質量，gmol—1、5.2碳水化合物的分析碳水化合物是綠色植物光合作用的重要產物，又是入類和動物體能量的重要來源，它在新陳代謝中起側緊要的作用。在植物整個生命活動中碳水化合物是僅次于蛋白質、氨基酸的另一類緊要物質，在農產品評價利用中，很多都與碳水化合物緊密相關。碳水化合物重要包括水溶性糖、淀粉、纖維索等。農產品中的水溶性糖重要有單糖（葡萄糖和果糖）及雙糖（蔗糖），由于它們都溶于水也溶于酒精，統稱水溶性糖或可溶性糖。其分析意義，可分為三類：①為討論植物不同生長期體內碳氮代謝；②分析水果、蔬菜中糖分，以評價其品質及其在貯運過程中含糖量的變化；③對甜菜、甘蔗等糖用作物以及動物飼料中糖的分析等以鑒定其質量。由于樣品中糖分的構成、含量不同和精度要求的不同，應選擇不同方法進行分析。淀粉作為植物的貯藏物質，大量地存在于禾谷類作物種子和薯類作物塊根、塊莖中，例如禾本科種子中淀粉含量可高達于重的50～80％，塊根、塊莖中可達鮮重的20～30％。淀粉是人們食品及家畜、禽飼料的重要成分，也是食品加工工業及輕工業的緊要原材料之一，對它們的分析，無疑是非常緊要的。纖維素是植物細胞壁的重要成分，它常和半纖維索及木質素在一起，是碳水化合物中較難分解的成分。現代醫學認為，纖維素有助于腸的蠕動作用，因而對入類健康大有裨益，主張多食用富含纖維索的果蔬類；而飼料中纖維素含量又和粗、精飼料的搭配有關，所以分析纖維素對食品及飼料皆有緊要意義。5.2.1水溶性糖的測定農產品中水溶性糖包括單糖（葡萄糖、果糖）、雙糖（蔗糖）。單糖是指用水解方法不能加以分解的碳水化合物，具有還原的特性，稱為還原糖；蔗糖不具有還原性，稱非還原糖。但蔗糖（雙糖）經水解為單糖后，也具有還原性，糖的還原性質與測定方法緊密相關。測定水溶性糖首先須用水（80oC）將其從試樣中浸提出來；也可以用乙醇浸提，后者是在樣品中含有大量淀粉和菊糖時采納。雙糖須經水解轉化為還原糖后再測定。測定還原糖的方法很多，有質量法、容量法、比色法及旋光法等。重量法是以還原糖將費林試劑還原產生Cu2O稱其質量為基礎的經典法。容量法按所用氧化劑不同可分為銅還原法和鐵還原法兩類，前者常用費林試劑為氧化劑；后者用鐵氰化鹽的堿性溶液為氧化劑。還原糖與氧化劑的反應很多而雜，常隨反應條件（如加熱溫度和時間、試劑的濃度和堿度以及糖的濃度）而更改，不能按單一的反應式來定量計算。因此全部的測定方法都是通過試驗所得的閱歷式或查閱歷表來計算結果的。所以測定時必需極嚴格地遵奉操作規程進行，否則將產生相當大的誤差。銅還原—直接滴定法，操作簡便，適用于含糖量較高瓜果、蔬菜等樣品；銅還原碘量法（半微量法），適用于含糖量低的牧草、蔬菜等樣品。另外，水溶性糖總量（包括還原糖和非還原糖），可以在浸提后經稀HCl轉化測定水溶性糖總量。蔗糖含量可從水溶性糖總量減去水解前還原糖含量乘以0.95系數而求得。測定糖用作物（甘蔗、甜菜）中蔗糖的含量多用旋光法。5.2.1.1單糖（還原糖）的測定銅還原—直接滴定法（常量法）方法原理用待測液滴定肯定量的費林試劑，依據肯定量的費林試劑所消耗的標準葡萄糖量，計算出待測液中的還原糖的含量。還原糖與費林試劑的作用如下：①費林試劑（A）與（B）等體積混合后，產生下列反應，形成銅的酒石酸絡鹽：Cu2＋＋2OH—十2C4H4O62—→[Cu（C4H3O6）2]4—+2H2O②在煮沸的條件下，銅的酒石酸絡鹽與還原糖作用，將還原糖氧化和降解：6[Cu（C4H3O6）2]4—+CH2OH（CHOH）4CHO+2OH—+4H2O→3CuO↓+CH2OH（CHOH）3COOH+CO3—+12C4H4O62—在用待測液滴定肯定量的費林試劑時，以亞甲基藍作為氧化還原指示劑。在滴定過程中，稍過量的還原糖可使氧化型亞甲基藍的藍色消失還原成無色的還原型亞甲基藍，即達滴定點。還原糖與費林試劑反應的完全程度與滴定時的條件（如加熱強度、溫度、時間等）有關，必需嚴格依照規程操作。由于指示劑也能消耗肯定量還原糖，所以每次滴定時須按規定加入相同數量的亞甲基藍。本法適合于含糖量高的樣品（15～50mL待測液中含糖50mg）。操作步驟1.待測液制備（1）水提取法：**新鮮水果、蔬菜樣品外來污染的雜質，盡可能快地磨細或切碎，混勻，稱取樣品25.00～50.00g（含糖約2.5g），置高速組織搗碎機中，加適量水后搗碎（或置研缽中加少量純石英砂共同研磨），然后當心移入250mL容量瓶中，加水至約150mL；或已風干磨細的樣品則可稱取0.500～5.00g，洗入250mL容量瓶中，亦加水至約150mL。然后加入粉狀CaCO30.5～1.5g中和樣品中的酸（防止浸提過程中蔗糖水解），搖動1min，置于80℃水浴中保溫浸提30min，其間搖動數次以利糖分浸提完全。冷卻，滴加中性乙酸鉛溶液至產生白色絮狀沉淀（約2～5mL），充分搖動混合，靜置15min，再滴加幾滴中性乙酸鉛溶液于上部清液中檢查是否沉淀完全。假如還有沉淀形成，再搖動，靜置，直至不產生白色絮狀沉淀為止，用水稀釋定容。用干濾紙過濾。加入足量固體草酸鈉到濾液中，使鉛沉淀完全，再用干濾紙過濾，再加少許固體草酸鈉到濾液中，檢查鉛是否沉淀完全，確認無鉛后，濾液待用。（2）乙醇提取法：稱取剪碎、混勻的新鮮植株樣品（含大量淀粉或菊糖的樣品）25.00g或干樣0.500～5.00g，放入400mL燒杯中，加入85％乙醇150mL浸泡過夜（另測樣品水分），倒入高速組織搗碎機的杯中搗碎，再倒回原燒杯中，用80％乙醇將杯壁上的樣品洗凈，一同倒入燒杯中，過濾入250mL容量瓶中，再用80％乙醇少量多次洗滌殘渣，直至濾液無糖反應為。*后以80％乙醇定容。吸取乙醇浸出液25.00～50.00mL（吸取量視含糖量與方法而定），放入瓷蒸發皿中，如溶液呈酸性，用固體CaCO3中和，在60～80℃水浴上蒸干乙醇后，加入少量無CO2水，用橡皮頭玻棒將干物質洗下，邊攪邊加入Ba（OH）2飽和溶液2～10mL，至溶液呈淡黃色（堿性），此時絮狀蛋白質沉淀物浮在液面。加入酚酞指示劑1滴，在不斷攪動下加入硫酸鋅溶液以沉淀過量的Ba2+，直到溶液呈微紅色時為止。過濾入50mL容量瓶中，用少量水洗滌沉淀后定容，待測。2.還原糖測定（1）約測：精準吸取費林試劑（A）和B各5mL（或吸取混合費林試劑10mL），放入250mL角瓶中，由滴定管加入待測液約15mL，置于石棉網上用酒精燈加熱、煮沸，趁沸連續滴加待測液，滴加速度約為10～15s之內加入1mL直至溶液藍色即將消失，加入亞甲基藍指示劑3滴，連續滴加待測液，直至藍色褪盡為止，記下待測液的用量（mL）。（2）準測：精準吸取費林試劑（A）和（B）各5mL（或吸取混合費林試劑10mL），放入250mL角瓶中，加入待測液，其用量比約測時滴定量約少0.5～1.0mL，置于石棉網上用酒精燈加熱、煮沸，使之2min內沸騰，維持沸騰2min后，加入亞甲基藍指示劑3滴，再逐滴地加入待測液，直至藍色褪盡。前后總沸時間為3min。精準記下待測液的消耗量（V1），待測液的消耗量須在15～50mL范圍內（含糖量近50mg），否則應加添或削減稱樣量，重新制備待測液。3.費林試劑的標定同上操作條件，用葡萄糖標準溶液也分“約測”及“精準測定”兩步進行。精準記下消耗標準糖液用量（V0）（測定3次取平均值）。結果計算還原糖，%=C*V0*V*10—3/（m*V1）*100式中：C：糖標準溶液濃度，mgL—1；V。：滴定10mL費林試劑所消耗標準葡萄糖液的量，mL；V：滴定10mL費林試劑所消耗待測液的量，mL；V1：待測液的總體積，mL；10—3：將mL換算成L的系數；m：樣品質量，g。注意事項無色的還原型亞甲基藍極易被大氣中的O2所氧化，恢復原來的藍色，故整個滴定過程中三角瓶不能離開燈火，使瓶中的溶液始終保持沸騰狀態，液面覆蓋水蒸汽，不與空氣接觸。銅還原碘量法（半微量法）方法原理索姆吉試劑與還原糖作用生成Cu2O沉淀，將沉淀用H2SO4酸化時，Cu2O即溶解成Cu+，而索姆吉試劑中的KIO3與KI在酸化時生成I2：KIO3+5KI+3H2SO4→3K2SO4+3H2O+3I23CuO↓試劑中的KIO3是定量加入的，所以生成的I2也是肯定量的。生成的I2與Cu+發生氧化還原反應，消耗一部分I2：2Cu++I2→2Cu++2I—溶液中與Cu+反應后所剩余的I2以淀粉為指示劑，用Na2S2O3標準溶液滴定：I2+2S2O32—→S4O62—+2I—在測定同時做空白標定，以水代替糖試液。由空白標定消耗的Na2S2O3毫升數減去實測待測液消耗的Na2S2O3毫升數，通過查表即得待測液中還原糖的毫克數。本方法適用于含糖少的蔬菜、牧草等樣品。操作步驟1.糖溶液的提取同銅還原—直接滴定法。2.還原糖的測定。吸取5mL（約0.5～2.5mg還原糖）待測液放入25x200mm試管中，加索姆吉試劑5mL，搖動混勻。試管口蓋以漏斗，在沸水浴中加熱15min，當心將試管平穩地置于流動冷水浴中4min；去蓋，沿管壁加入KI—K2C2O42Ml（溶液為堿性時不要搖動）及硫酸溶液3mL，充分搖動混勻，使CuO完全溶解；再于冷水浴中放5min，并搖動2次，然后用硫代硫酸鈉標準溶液滴定，至淺黃色時，加入淀粉5～10滴為指示劑，連續滴定至藍色消失為盡頭。按同樣的操作進行空白標定。由空白標定與樣品測定所用毫升數之差，從表查得相當的還原糖毫克數，用已知量的標準糖溶液同樣進行測定，可以校驗表的數值。結果計算還原糖，％=m1*10—3/m*100式中：m1：查表所得還原糖質量，mg；10—3：將mg換算成g的系數；m：吸取的待測液中相當的樣品質量，g。兩次平行測定結果允許相對偏差為5％。5.2.1.2水溶性總量和蔗糖的測定植物水溶性糖包括葡萄糖、果糖和蔗糖。其中，蔗糖須經稀HCl水解生成轉化糖（生成等量的葡萄糖和果糖）后與其它的還原糖一起測定，即為水溶性總糖。蔗糖的含量用差減法計算出。計算式如下：蔗糖％=（水溶性糖總量％—還原糖％）*0.95式中：0.95為還原糖轉化為蔗糖的因數。5.2.1.3糖料作物中蔗糖的測定（旋光法）糖料作物重要指甘蔗和糖用甜蘋等，它們所含糖分幾乎全是蔗糖，前者可直接壓汁測定蔗糖含量，后者則須用水浸提后測定。測定蔗糖的的方法有旋光法、折光法和容量法等，其中廣泛采納的是旋光法，其特點是簡單、快速、精準，但需用旋光計或檢糖計。比重法和折光法不夠精準。沒有檢糖（旋光）計時，可以選用適于常量測定的化學方法，例如，蔗糖經HCl水解轉化后，用銅還原—直接滴定法測定還原糖，再計算蔗糖的含量。旋光法測糖的原理是基于糖類分子具有不對稱碳原子，可使通過的光的偏振面旋轉。當光的波長、溫度和液層厚度肯定時，溶液中蔗糖的濃度與偏振光面旋轉角度成正比，因此，可用旋光計或檢糖計測定蔗糖的含量。各種糖類都有其特定的比旋，例如蔗糖水溶液的比旋為+66.5，葡萄糖是+52.8，果糖是—92.8，麥芽糖是+118等。5.2.3淀粉的測定淀粉可直接被酸水解生成葡萄糖；或被酶水解生成麥芽糖和糊精，再經酸水解生成葡萄糖，可測定葡萄糖含量（還原糖）再計算出淀粉含量。酸水解法不僅使淀粉水解，而且也能分解半纖維素，結果產生了具有還原力的木糖、阿拉伯糖等單糖，使淀粉測定結果偏高。另外，淀粉經分散和酸解后具有肯定的旋光性，也可用旋光法測定淀粉含量。淀粉是多糖聚合物，可用CaCl2—HOAc（相對密度1.3，pH2.3）為分散和液化劑，在肯定的酸度和加熱條件下，使淀粉溶解和部分酸解，生成具有肯定旋光性的水解產物，可用旋光計測定。用此法時，各種淀粉的水解產物的比旋指定為203、國內谷物淀粉分析方法標準化討論協作組認為，本法結果的重復性好，操作簡便、快速。上帶有空氣冷凝管的塞子，使淀粉經酶水解生成的糊精和麥芽糖再經酸水解為葡萄糖。5.2.4粗纖維的測定（酸性洗滌劑法，ADF）長期以來，測定粗纖維常用酸（H2SO4）堿（NaOH）交替浸煮法。該法操作手續冗長，測定條件不易掌控，而且試樣經沸熱NaOH溶液處理時，木質素有不等比例的溶解，使粗纖維的測得值偏低，從而使“無氮浸出物”含量偏高。酸性洗滌劑法（ADF）操作簡便，是一個快速的方法。測得的“酸—洗滌劑纖維”較前法為高。酸—洗滌劑法對纖維素的回收率以及它的結果與樣品的消化率之間相關系數都高于前法。采納酸性洗滌劑法，必要時還可以接著分別測定酸不溶性木質素。此法現已得到美、英等國的公認。方法原理季按鹽（例如十六烷基**基溴化銨（CTAB），是一種表面活性劑，在硫酸溶液（0.5molL—1）中能有效地使動物飼料、植物樣品中蛋白質、多糖、核酸等組分水解、濕潤、乳化、分散，而纖維素及木質素則很少變化。酸—洗滌劑法就是利用這個原理，將試樣用CTAB的H2SO4溶液（酸—洗滌劑）煮沸1h，過濾，洗凈酸液后烘干，依據殘渣的質量計算酸性洗滌劑纖維（％）。本法適用于谷物及其加工品、飼料、牧草、果蔬等植物莖稈，葉、果實以及經測定粗脂肪后的任何試樣中粗纖維的測定。操作步驟稱取通過1mm篩的風干試樣1.000g或相當量的鮮樣，放入250mL三角瓶中，在室溫下加入酸性洗滌劑溶液100mL加熱，使之在5～10min內煮沸。剛開始沸騰時計算時間，裝上冷凝管回流60min。注意調整加熱溫度，使整個回流過程始終維持微沸狀態。取下三角瓶，轉動內容物，用已知質量（m1）的玻璃坩堝式濾器或古氏坩堝減壓抽濾。過濾時，先用傾瀉法過濾，將酸性洗滌劑溶液濾干后，用玻棒將殘渣攪散，加入90～100oC的熱水傾洗3～4次，減壓抽濾，洗凈酸液后將殘渣轉移入濾器中，重復水洗，認真沖洗濾器的內壁，至酸—洗滌劑洗盡為止。用丙酮同樣洗滌濾器2、3次，直到濾出液無色為止。抽干濾渣中的丙酮，放入100oC鼓風式干燥箱中干燥3h，冷卻后稱其質量（m2）。結果計算粗纖維（酸性洗滌纖維）％=（m2—m1）/m*100式中：m2：粗纖維和空坩堝質量，g；m1：空坩堝質量，g；m：烘干樣品質量，g。5.3油料作物和谷類作物籽粒中油脂的測定脂類在植物細胞和組織中存在形態可分為兩類，一類為游離態，另一類為結合態。游離態油脂常常大量聚積于植物的貯藏器官中，以小滴形狀而存在。所以當細胞被破壞并施以壓力，可以將個別小滴聯成大滴，而聚集到充足的大滴時就得到了液體油。這就是榨油工業的基礎。另一種類則是與其它成分相結合的脂類。例如，存在于谷物等淀粉顆粒中以及植物營養組織中結合態的脂類。種子的含油量因不同作物而不同，在同一作物的不同品種之間差異也很大，如大豆種子的含油量變動在10～25％，一般約在15～18％。磷肥對提高植物含油量有良好的作用。在農業利用上為了評價谷類和油料作物種子的品質時，常常要測定游離態油脂含量；在評價動、植物脂類品質時往往還需要鑒定其脂肪酸構成及其有關理化性質。測定作物種子中游離態袖脂的方法有油重法（直接法）和殘余法（間接法）。乙醚提取—直接測定油重法，結果精準、穩定，廣為國內外所采納，我國國家標準中將油重法作為仲裁法，但此法所用儀器每次只能測定一個樣品，不適合于大批樣品的測定。間接測定殘余法適合于大批樣品的分析，分析效率較高，測定結果與油重法較為一致。在有精密折光儀的條件下，大批同種油料作物種子樣品含油量的測定，采納簡單快速而精準的折光法，*為便利。油重法（索氏提取法）方法原理油脂不溶于水，但能溶于乙醚（沸點35℃）、石油醚（30～60℃）、二硫化碳（46.3℃）、丙酮（56.5℃）、四氯化碳（70℃）、三氯甲烷（61℃）、苯（80℃）等有機溶劑中，因此可以用這些溶劑將植物樣品中油脂浸提出來，然后加熱趕去溶劑即可求得油脂含量。常用的溶劑為無水乙醚及石油醚，因其有低沸點的優點，便于提取；但又有易著火爆炸等缺點，測定時務須嚴防著火爆炸。這些溶劑除提取出游離態脂肪外，也能提出“類脂肪”，如磷脂、**醇、色索、蠟以及脂肪酸等脂溶性物質，故稱之為“粗脂肪”。操作步驟1.試樣制備選取代表性種子（小粒種子≥25g，大粒種子≥30g）。小粒種子，如油菜、芝麻，大粒種子如大豆、花生仁等。將樣品預先在80℃烘箱中干燥約2h。谷類、大豆等經粉碎后通過40目篩。帶殼油料種子如花生果、蓖麻籽、向日葵籽等，取樣量不得少于50g，通過剝殼，分別稱重，計算出仁率。再用切片機或小刀片切成0.5mm以下薄片，籽仁粉碎至均勻粉狀。芝麻、油菜子用粉碎機或研缽細心研碎，注意不要留有整粒。樣品處理完畢，立刻混勻，裝入磨口瓶中備用。2.測定稱取經105℃烘干1h后粉碎試樣2～5g（**至0.001g）兩份，全部移入干燥濾紙筒內（如無濾紙筒時也可使用濾紙包），試樣上面用脫脂棉塞住，以防試樣漂流，然后移入浸提筒內。事先將干凈的接受器燒瓶100～105℃烘箱內干燥0.5～1h，烘至恒重（m1），加入約占瓶體2／3體積的無水乙醚，把索氏提取器各部分連接起來，打開冷凝水流，在水浴上進行抽提。調整水浴溫度（夏天約65℃，冬天約80℃，切忌明火，注意室內通風），使冷凝下滴的乙醚速度為120～180滴／min，使乙醚不斷回流提取，一般浸提時間需8～10h。提取結束后，取下浸提筒，用鑷子取出圓筒濾紙，連接好浸提筒，在水浴中加熱蒸餾回收接受器燒瓶中的乙醚，用紗布擦凈燒瓶外部，取下燒瓶，在沸水浴上蒸去殘余的乙醚。將盛有脂肪的燒瓶放入105℃烘箱中，烘干1h，移入干燥器中冷卻至室溫后稱重，**至0.001g。再烘30min，冷卻，稱重，直至恒重（m2）。結果計算粗脂肪，%（干基）（m2—m3）/（m2—m1）*100式中：m1：接受燒瓶的質量，g；m2：接受燒瓶和脂肪的質量，g；m3：樣品的質量，g。帶殼油料種子粗脂肪％=籽仁粗脂肪％／出仁率％平行測定的結果用算術平均值表示，保留小數后兩位。平行測定結果的相對相差，大豆不得大于2％，油料作物種子不得大于1％。5.4有機酸和維生素分析有機酸廣泛存在于植物體中，如在果蔬中重要含有蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸和草酸等。它們屬于弱酸類，常以游離態及鉀、鈉、鈣鹽的形式存在于植物體內，其成分及含量與植物品種、培養條件及生長情形緊密相關。有機酸作為酸味成分，其適合的含量可加添果蔬的風味，但過量時又顯示出**的品質。因此，測定果蔬的酸度及其與糖含量的比值，能判定果蔬的成熟度和品質；而且有機酸在食品的加工、貯存、品質管理、評價以及生物化學等領域，被認為是緊要的成分，常要對農產品中的總酸量、特定的有機酸進行定量測定，乃至分析全部有機酸的構成。有機酸量的多少、強弱常用酸度來表示。酸度的測定包括總酸度（可滴定酸度）、有效酸度（氫離子活度、pH值）和揮發性酸。總酸度是全部酸性成分的總量，通常用標準堿來測定并以樣品中所含重要酸的百分數表示，但有的農產品由于緩沖作用和色素的影響，往往難以判定滴定盡頭，在這種情況下，可以使用電位滴定法。但是人們味覺中的酸度，重要不取決于酸的總量，而是取決于離子狀態的那一部分酸（游離酸），一般以氫離子活度（pH值）來表示，稱為有效酸度。測定pH值的方法很多，其中以pH計較為精準、簡便。至于各種有機酸的分別和定量，通常用柱層析法、紙層析法、氣相色譜法和羧酸分析儀法。5.4.1總酸度的測定中和滴定法方法原理樣品中的有機酸用堿滴定時，被中和生成鹽類。用酚酞作指示劑，它在pH約8.2時達到盡頭。*后以NaOH的毫摩爾數來計算有機酸的含量。操作步驟在小燒杯中稱取搗碎均勻試樣10～20g，用約150mL水將其移入250mL容量瓶中，充分搖勻后稀釋定容。用干濾紙過濾，取濾液50mL，加入酚酞指示劑3～4滴，用氫氧化鈉標準溶液滴定至微紅色1min內不褪色為盡頭。結果計算酸度％=C*V*10—3*K*k/m*100式中：C：標準溶液NaOH的濃度，molL—1；V：NaOH標準溶液的用量，mL；K：換算為適當酸的系數，gmol—1：蘋果酸67，檸檬酸64，含1分子水的檸檬酸70，乙酸60，酒石酸75，乳酸90；10—3：將mL換算成L的系數；k：分取倍數；m：樣品的質量，g。注意事項1.本試驗所用的蒸餾水應經煮沸除去二氧化碳。2.若顏色過深，可先加入等量蒸餾水稀釋后再滴定，或改用電位或電導滴定法。5.4.2有效酸度（pH值）的測定（電位法）果蔬食品pH值的變動不僅取決于原材料品種和成熟度，而且取決于加工方法。其pH值與總酸度之間沒有嚴格的比例關系，pH值的大小不僅僅取決于酸的數量和性質（種類），而且受其中的酸、果膠、某些鹽類和蛋白質緩沖本領的影響。測定pH值的方法有pH試紙法、標準色管比色法和pH計測定法。其中以pH計法*精準，操作也簡便。5.4.3水果、蔬菜中有機酸組分的測定高效液相色譜法有機酸是果、蔬的重要構成分之一、果、蔬中有機酸的種類和含量變化很大。這些變化決議于品種、成熟度、氣候條件及其它因素，常用氣相色譜法、薄層色譜法、高效液相色譜法來測定有機酸。方法原理試樣經處理后，直接將試樣液注入反相化學鍵合相色譜體系，用磷酸氫二銨溶液（5gL—1）為流動相，有機酸在兩相中調配分別，依照其碳原子數由少到多的次序從色譜柱中洗脫下來。用紫外檢測器（214nm）或示差折光檢測器檢測并與標準樣品比較定量。操作步驟1.有機酸標準溶液的制備分別取適量有機酸單個標準樣，如酒石酸、蘋果酸、檸檬酸等于25mL容量瓶中，用氫氧化鈉溶液溶解后定容，配制標準濃度系列。2.樣品溶液的制備對于液體試樣需經合適倍數稀釋，用Sep—PAKC18凈化柱處理，收集餾出液，經0.45mm微孔濾膜過濾后備用；對于固體或半固體試樣，要將其搗碎，均質后，加入肯定量的氫氧化鈉溶液提取。經離心分別或過濾后收集提取液，用Sep—PAKC18凈化柱處理，收集餾出液，經0.45mm微孔濾膜過濾后備用。3.色譜條件：固定相：C18鍵合相；流動相：磷酸氫二銨溶液pH2.5；流速：2mlmin—1；進樣量：10mL；檢測器：紫外檢測器，214nm，0.1AUFS。測定和計算1.將待測樣10mL注入色譜儀，依據其峰高或峰面積設定有關*佳參數如*小峰面積；2.注入有機酸標準系列溶液10mL，進行色譜分析；3.以各標準溶液的保留時間定性；4.依據有機酸標準系列溶液各響應值（峰高或峰面積）作一響應值與濃度的標準曲線；5.分別注入待測樣10mL，進行色譜分析；6.依據各待測樣的響應值，在標準曲線上查出其相應的含量。若高效液相色譜儀配有微處理機，則不必配制系列標準溶液，只要選擇與待測分析樣品濃度相近的（±10％以內）標準溶液注入色譜儀，仍以保留時間定性，依據標準樣品的響應值由計算機計算出校正因子，再由計算機用比例計算法作定量計算。5.4.4維生素的測定維生素廣泛存在于各種生物體中，其種類繁多，化學結構與生理功能各異。因此無法依照結構或功能分類，按其溶解性可分為脂溶性（VA、VD、VE、VK）和水溶性（VB1、VB2、VB6、VB12、VP、VPP、VC）兩大類。維生素是人體生命活動不可缺少的營養物質，它們一般在動物和人體內不能合成或合成數量少，充足不了動物和人體的需要，必需依靠從食物中攝取。在食物中缺乏了任何一種維生素，人和動物都會發生特有的缺乏癥狀，如缺乏維生素A、B和C時，可分別引起夜盲癥、**和壞血病等，嚴重時足以致命。某些維生素含量的高處與低處，是評價農產品品質的緊要指標之一、測定維生素是一項比較多而雜的工作。一般測定程序是：①用酸、堿或酶分解試樣，使其中的維生素游離出來；②用溶劑進行提取；③分別子擾物質，對樣液進行分別提純；④用適當的方法進行定量等。測定維生素的方法有微生物學測定法、生物學測定法等；儀器分析的方法有分光光度法、熒光分析法、薄層層析法、高效液相色譜法等。選用方法時應依據試樣的品種、類型、待測維生素的性質、含量以及干擾物質多少等因素來決議。維生素C又稱抗壞血酸，其純品為白色無臭結晶，熔點為190～192℃，溶于水或乙醇，不溶于油劑，在水溶液中易被氧化，在堿性條件下易分解，在弱酸條件下較穩定。還原型（L—抗壞血酸）可被氧化為氧化型（L—脫氫抗壞血酸），但仍有肯定的生理作用，假如進一步水解則生成2，3—二酮古樂糖酸，便失去生理作用。通常所說的總抗壞血酸包括還原型、氧化型抗壞血酸和2，3—二酮古樂糖酸。測定維生素C含量的方法有2，6—二氯靛酚法、2，4—二硝基苯肼法、鉛—硫化氫法、碘量法、熒光分光光度法。2，6—二氯靛酚法用于測定還原型Vc，其它方法多用于測定總Vc的含量。還原型維生素C的測定（2，6—二氯靛酚滴定法）方法原理還原型抗壞血酸的分子中有烯二醇結構存在，因此具有還原性，它能將藍色染料2，6—二氯靛酚還原為無色的化合物，而Vc則被氧化為脫氫Vc。2，6．二氯靛酚具有酸堿指示及氧化還原指示的兩種特性，在堿性介質中呈深藍色，而在酸性介質中呈淺紅色（變色范圍pH4～5），其于氧化態時呈深藍色（堿介質中）或淺紅色（酸性介質），還原態時為無色。依據這個特性，用堿性藍色染料的標準溶液滴定植物樣品酸性浸出液目的是保持反應時肯定的酸度，避開Vc在高pH時被空氣氧化。由于此染料不能氧化待測液中非Vc的還原性物質，所以，對Vc有肯定的選擇性。本法適用于測定一般水果、蔬菜樣品的還原型Vc（不包括脫氫Vc）。如試樣中含有Fe2+、Sn2+、Cu2+、SO32—、S2O32—、SO2等還原性雜質，則有干擾。操作步驟1.試樣處理（1）新鮮果蔬試樣稱取鮮樣50～100g，放入組織搗碎機的杯中，加入等重量的草酸浸提劑，快速搗碎1min，將試樣打成漿狀。