1《動物疫病診斷技術第2部分：α皰疹病毒》編制說明一、工作簡況本標準根據(jù)山東省市場監(jiān)督管理局2022年下達的《全省標準化創(chuàng)新發(fā)展項目計劃的通知》立項，魯市監(jiān)標函本標準由山東省畜牧業(yè)標準化技術委員會歸口。馬，驢等大動物疫病防控的權威科研人員和基層從業(yè)人員，對全省規(guī)模化豬場，雞場，牛場，驢場以及馬場的疫病情況比較熟悉。同時，也積累了可靠的數(shù)據(jù)和具有實際應用價值的技術經(jīng)驗，為此標準的制定奠定了基礎。（二）起草單位、起草人及任務分工（1）起草單位聊城大學、山東農(nóng)業(yè)大學、青島農(nóng)業(yè)大學、青島立見生物科技有限公司、山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院、山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院、德州市農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法支隊、聊城市東昌府區(qū)畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心、煙臺市農(nóng)村經(jīng)濟經(jīng)營管理站、陽信縣畜牧獸醫(yī)管理服務中心、山東鳳祥股份有限公司、臨沂澤潤2牧業(yè)有限責任公司、東阿阿膠股份有限公司和隆銘牛（日照）肉牛養(yǎng)殖有限公司。（2）起草人及任務分工1234567893（三）起草過程2022年11月-2023年1月標準制定小組廣泛查閱國內(nèi)外有關豬，雞，牛，馬和驢α皰疹病毒研究的相關文獻、標準和權威部門出版物，對相關研究成果進行了全面匯總，準備申報工作。2023年2月-2023年3月標準制定小組結合山東省內(nèi)規(guī)模化養(yǎng)豬企業(yè)，養(yǎng)雞企業(yè)，養(yǎng)牛企業(yè)，養(yǎng)馬企業(yè)，養(yǎng)驢企業(yè)α皰疹病毒病發(fā)生的實際情況，編制了《動物疫病診斷技術2023年4月-2023年6月以函審的方式廣泛征求來自東北農(nóng)業(yè)大學，中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所，中國農(nóng)科院上海獸醫(yī)研究所，山東畜牧總站，安徽農(nóng)業(yè)大學，山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆畜牧科學院畜牧研究所等高校科研院所的專家和陽谷榮發(fā)牧業(yè)，高唐縣阿多寶畜禽養(yǎng)殖專業(yè)合作社等有關企業(yè)技術人員的意見，先后發(fā)出30條，回函的單位或?qū)＜覕?shù)為22個，通過意見反饋，進行對標準內(nèi)容和編制說明進一步修改和完善，形成送審稿。42023年7月-2023年9月，進行企業(yè)回歸驗證；9月7日在省畜牧局在濟南召開了山東省地方標準組織專家審查會議，省市場監(jiān)督管理局對審查會進行監(jiān)督指導，來自山東師范大學、山東省動物疾病與控制中心等單位的9名專家提出標準內(nèi)容刪減，格式修改等意見，起草小組根據(jù)審查意見對標準文本進行修改完善，審查委員會對修改內(nèi)容確認無誤，最終形成報批稿。二、地方標準制定目的和意義皰疹病毒（herpesviruses）是一類有囊膜、基因組為雙鏈DNA的病毒。主要分為α皰疹病毒、β皰疹病毒、γ皰疹病毒3種亞型。其中α皰疹病毒對動物的危害程度最大。該類病毒宿主廣泛，包括豬、雞、牛、馬和驢等多種動物，且在國內(nèi)外均有分布。隨著國內(nèi)畜牧業(yè)規(guī)模化、集約化發(fā)展，畜禽疫病發(fā)病率逐年上升，疫病防控仍是現(xiàn)階段的一大難題。動物疫病的診斷作為動物疫病防控的重要組成部分，是控制疫病發(fā)生的主要手段。因此，針對主要動物疫病的病原制定相應的診斷標準，有利于推動相關動物疫病的監(jiān)測與管理，尤其是疫病診斷標準的實施，可降低疫病在本區(qū)發(fā)生概率。山東作為國內(nèi)畜牧業(yè)生產(chǎn)大省，生豬、雞、牛、以及特色畜種驢、馬的飼養(yǎng)量年位居全國前列。近年來，以豬偽狂犬病毒，雞皰疹病毒2型，牛皰疹病毒1型，以及馬皰疹病毒1/4/8型為代表的α皰疹病毒在規(guī)模化養(yǎng)殖場肆虐，給畜禽養(yǎng)殖場帶來巨大5牛皰疹病毒1型，以及馬皰疹病毒1/4/8型制定診斷標準，用于指導基層生產(chǎn)實踐。本文件旨在規(guī)定豬、雞、牛以及馬屬動物皰疹病毒的臨床特征和實驗室診斷方法。可用于指導規(guī)模化畜禽養(yǎng)殖場該類病毒的診斷和檢測。標準的制定和推廣應用有助于在規(guī)模化養(yǎng)殖場有效診斷該病，做到及早發(fā)現(xiàn)，盡早采取干預措施，減少經(jīng)濟損失，以利于提高動物生產(chǎn)性能，增加企業(yè)的經(jīng)濟效益。有利于提高我省對該類動物皰疹病的綜合防治水平，最終推動我省畜牧業(yè)經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展。綜上所述，根據(jù)前期山東省多地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖場α皰疹病毒發(fā)病率統(tǒng)計，基于養(yǎng)殖場生物安全規(guī)范和預防為主的原則，有針對性制定《動物疫病診斷技術第二部分：α皰疹病毒》的地方標準，涵蓋偽狂犬病毒，雞皰疹病毒2型，牛皰疹病毒1型以及馬皰疹病毒1/4/8型等的診斷方法，來規(guī)范規(guī)模化畜禽養(yǎng)殖場對該類病毒的診斷與防控，最大限度地減少此類皰疹病毒感染造成的巨大危害，提高企業(yè)的經(jīng)濟效三、地方標準編制原則、主要技術內(nèi)容和確定依據(jù)（一）標準編制原則《標準編寫規(guī)則第4部分：試驗方法標準》的規(guī)定起草，6主要遵循：先進性、規(guī)范性、實用性、統(tǒng)一性和協(xié)調(diào)性等原則。結合山東省規(guī)模化畜禽場豬偽狂犬病，雞馬立克氏病，牛傳染性鼻氣管炎，馬鼻肺炎等發(fā)病情況，特編制針對豬，牛和馬，驢皰疹病毒的診斷技術規(guī)范，填補了我省這方面的空白。同時對于基層臨床疾病的防控具有指導意義。（二）主要技術內(nèi)容1.術語與定義本標準沒有需要界定的術語和定義。2.1豬偽狂犬病該病由豬偽狂犬病毒（Porcinepseudorabiesvirus，PRV）引起豬的一種急性傳染病。豬是偽狂犬病毒的貯存宿主，患病豬、帶毒豬以及帶毒鼠類為本病重要傳染源。本病最主要的傳播途徑為空氣傳播，另外，在豬群中也存在鼻分泌物傳播為狂犬病毒的現(xiàn)象。該病流行具有季節(jié)性，常發(fā)生在寒冷2.2雞馬立克氏病該病由雞皰疹病毒2型（GallidAlphaherpesvirus2，GaHV-2即馬立克氏病病毒（Marek’sdiseasevirus,MDV）引起雞的一種淋巴細胞增生性疾病。病雞和帶毒雞是傳染來源，本病主要通過空氣傳播，另外污染的飼料和飲水，以及飼養(yǎng)人員流動也可傳播帶毒。本病主要是2-5月齡雞常發(fā)。2.3牛傳染性鼻氣管炎7引起牛的一種接觸性傳染病。病牛和帶毒牛是主要傳染源，病毒主要存在于鼻、眼、陰道分泌物和排泄物中。本病主要由飛沫經(jīng)呼吸道傳播，另外可通過生殖道黏膜、眼結膜傳播。該病常發(fā)于秋、冬寒冷季節(jié)。2.4馬鼻肺炎type,EHV-1/4/8）感染引起的一種急性、熱性傳染病。該病的主要傳染源是病馬或驢和恢復后的帶毒馬或驢,病毒可存在于患病動物的血液、鼻液及流產(chǎn)的胎膜和胎兒組織中,部分公馬或驢的精液中也可帶毒。本病主要經(jīng)呼吸道傳染，另外，消化道及交配也可傳染。該病多發(fā)生于秋冬和早春。3.1臨床診斷3.1.1豬偽狂犬病該病的潛伏期一般為2～6天，剛配種的母豬發(fā)病時易出現(xiàn)隱形流產(chǎn)；母豬發(fā)病早期無顯著癥狀，妊娠母豬分娩前或后1周出現(xiàn)食欲下降甚至廢絕，且出現(xiàn)早產(chǎn)、流產(chǎn)，產(chǎn)死胎或弱胎；公豬出現(xiàn)睪丸萎縮、陰囊腫大，精子活力低。哺乳仔豬感染以后出現(xiàn)高熱，抽搐、震顫和共濟失調(diào)等神經(jīng)癥狀。3.1.2雞馬立克氏病該病的潛伏期一般為3～4周，可根據(jù)皰疹病毒侵害部8位的不同分為四種類型。①神經(jīng)型患病雞出現(xiàn)站立不穩(wěn)，呈“劈叉”姿勢，為典型癥狀。翅膀下垂；低頭或斜頸等。②內(nèi)臟型常見于50～70日齡的雞，病雞精神萎頓，食欲減退，消瘦，羽毛松亂，雞冠蒼白或黑紫色、皺縮，伴有黃白色或黃綠色下痢常因脫水導致死亡。③眼型病雞出現(xiàn)瞳孔縮小，虹膜邊緣不整齊，顏色常為灰白色。輕者對光線強度的反應遲鈍，重者失明。④皮膚型病雞常出現(xiàn)毛囊腫大或皮膚結節(jié)。3.1.3牛傳染性鼻氣管炎本病潛伏期為7天左右，將本病根據(jù)皰疹病毒侵害部位的不同分為四種類型：①呼吸道型病牛體溫升至40℃以上，鼻粘膜充血，出現(xiàn)散出現(xiàn)咳嗽，呼吸困難，咽下障礙。②結膜角膜炎型病牛出現(xiàn)結膜和角膜充血，眼瞼腫大，流淚，角膜渾濁，有壞死性斑點。③生殖器型母牛病牛體溫升高，精神沉郁，食欲廢絕，外陰腫脹有小膿皰；出現(xiàn)子宮炎導致流產(chǎn)，產(chǎn)死胎。公牛感染出現(xiàn)傳染性膿皰型包皮龜頭炎，喪失配種能力。④腦膜炎型以6月齡以內(nèi)的犢牛已發(fā)，體溫升高，出現(xiàn)驚厥，共濟失調(diào)，角弓反張等現(xiàn)象。3.1.4馬鼻肺炎9本病潛伏期為2-10天左右，主要導致馬屬動物出現(xiàn)鼻肺炎，孕畜流產(chǎn)，以及神經(jīng)癥狀。患病動物初期體溫升高，流鼻液，鼻黏膜，眼結膜充血，下頜淋巴結腫大，同時血液中白細胞數(shù)量明顯減少，感染嚴重者因呼吸困難而死亡。孕馬或驢出現(xiàn)流產(chǎn)，或驢駒死亡。以1～2歲馬或驢多發(fā),3歲后呈隱性3.2實驗室診斷3.2.1豬偽狂犬病病料樣品采集采集患病豬的鼻拭子、血液、肺組織、淋巴結、腦和扁桃體等組織，參考NY∕T541要求進行。聚合酶鏈式反應（PCR）檢測與電泳分析取200uL鼻拭子或病料組織的上清液借助商品化試劑盒制備DNA，鑒于PRV的檢測需要鑒別是自然野毒感染還是人工疫苗免疫。利用特異性引物分別進行PCR擴增（引物序列參見表1，其中gE引物用于野毒鑒別，gB引物用于常規(guī)檢測）,具體操作步驟參照附錄A。目的片段大小為368bp或480bp。名稱序列（5’→3’）片段大小PRV-gE-FTTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTGPRV-gE-RTTTGAATTCTTACGACACGGCGTCGCAPRV-gB-FAGGTGTCGTTGGTGGTGT480bpPRV-gB-RACGGCGACCTGGACG實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測鑒于PRV的檢測需要區(qū)分野毒感染還是疫苗免疫，以純化的DNA為模版，利用特異性引物分別進PCR（引物序列參見表2，gE引物用于鑒別野毒，gB引物用于常規(guī)檢測）,qRT-PCR具體操作步驟參照附錄B。表2.熒光定量PCR引物信息名稱序列（5’→3’）片段大小qPRV-gE-FCTGTACGTGCTCGTGATGACqPRV-gE-RCTCCTTGRTGACCGTGACGqPRV-gB-FGTCCGTGAAGCGGTTCGTGATqPRV-gB-RACAAGTTCAAGGCCCACATCTAC野毒分離與檢測：將判定為豬偽狂犬病陽性的腦，肺臟或淋巴結等病料借助研磨儀勻漿后，經(jīng)反復凍融3次后，5000rpm/min離心10min。收集上清借助0.22μm濾膜除菌后，接種至PK-15細胞中，同時添加1000IU/mL青霉素和1000μg/mL鏈霉素，設置空白對照組。37℃吸附后1h，換成3%FBSDMEM細胞培養(yǎng)液，放置培養(yǎng)箱3d～5d，每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細胞病變（CPE）。數(shù)據(jù)處理分析：①將PCR產(chǎn)物借助1.0%核酸膠進行分析，參照DNA標準分子量，若待測樣品中擴增出片段大小分別368bp或480bp符合預期，且空白對照沒有條帶，將陽性片段克隆至pMD-18T載體，送生物公司測序，若測序的序列與NCBI公布的標準序列（參考附錄C）同源性大于95%，則可以確診為豬偽狂犬病毒感染陽性，否則判定為陰性。②qRT-PCR結果顯示待檢測樣品Ct值大于35且無“S”型擴增曲線時判定為陰性，Ct值小于35且出現(xiàn)“S”型擴增曲線時判定為陽性。③若PK-15細胞出現(xiàn)CPE，即細胞出現(xiàn)變圓、聚集、拉絲，并最終全部脫落。需進一步收取細胞提取DNA，借助上述特異性引物，進行PCR或qRT-PCR檢測和測序確定，若易感細胞未出現(xiàn)CPE，應將細胞培養(yǎng)物凍融后盲傳3代，若盲傳后沒有CPE出現(xiàn)，則判定為未分離到病毒。3.2.2雞馬立克氏病采集病料樣品采集患病雞的血液、淋巴組織、脾臟組織或腫瘤細胞或羽髓勻漿等，參考NY∕T541要求進行。PCR檢測與電泳分析將待測病料樣品借助試劑盒提取DNA作為模版，借助特異性引物（序列參見表3）進行PCR檢測，具體操作步驟參照附錄A。將PCR產(chǎn)物利用1.0%核酸膠進行電泳分析,目的片段大小為434bp。qRT-PCR檢測以純化的DNA為模版，利用特異性引物分別進qRT-PCR檢測（序列參見表3）,qRT-PCR具體操作步驟參照附錄B。表3.引物信息名稱序列（5’→3’）片段大小MDV073-FATTTGATTCAGATTTTGTTTCT360bpMDV073-RGCTGTTGTACATTCCGTTCGCGCqMDV073-FGTTTCTCCAGATTCCACCTCqMDV073-RTGCAACAATGCGTTCTTAT野毒分離與檢測：將判定為雞皰疹病毒2型陽性的病料組織借助研磨儀勻漿后，經(jīng)反復凍融3次后，5000rpm/min離心10min。收集上清借助0.22μm濾膜除菌后，接種至雞胚胎纖維細胞（DF-1）中，同時添加1000IU/mL青霉素和1000μg/mL鏈霉素，設置空白對照組。37℃吸附后1h，換成3%FBSDMEM細胞培養(yǎng)液，放置培養(yǎng)箱3d～5d，每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細胞病變（CPE）。數(shù)據(jù)處理分析①PCR產(chǎn)物借助1.0%核酸膠進行分析，參照DNA標準分子量，若待測樣品中擴增出片段大小分別434bp符合預送生物公司測序，若測序的序列與NCBI公布的標準序列（參考附錄C）同源性大于95%，則可以確診為雞皰疹病毒2型感染陽性，否則判定為陰性。②qRT-PCR結果顯示待檢測樣品Ct值大于35且無“S”型擴增曲線時判定為陰性，Ct值小于35且出現(xiàn)“S”型擴增曲線時判定為雞皰疹病毒2型感染陽性。并最終全部脫落。需進一步收取細胞提取DNA，借助上述特異性引物，進行PCR或qRT-PCR檢測和測序確定，若易感細胞未出現(xiàn)CPE，應將細胞培養(yǎng)物凍融后盲傳3代，若盲傳后沒有CPE出現(xiàn)，則判定為未分離到病毒。3.2.3牛傳染性鼻氣管炎病料樣品采集采集鼻拭子，血液，流產(chǎn)胎兒肺臟，生殖道分泌物等病料，按NY∕T541要求進行。PCR檢測將待測病料樣品借助試劑盒提取DNA作為模版，借助特異性引物（序列參見表4）進行PCR檢測，具體操作步驟參照附錄A。將PCR產(chǎn)物利用1.0%核酸膠進行電泳分析,目的片段大小為479bp。qRT-PCR檢測以純化的DNA為模版，利用特異性引物分別進qRT-PCR檢測（序列參見表4）,qRT-PCR具體操作步驟參照附錄B。表4.引物信息名稱序列（5’→3’）片段大小BoHV-1gB-FTACGACTCGTTCGCGCTCTCBoHV-1gB-RGGTACGTCTCCAAGCTGCCCqBoHV-1gB-FCTGGCACACGACGGACGATGqBoHV-1gB-FCGCCTCCACTTCTTCCACGATG野毒分離與檢測：將判定為牛皰疹病毒1型陽性的組織病料借助研磨儀勻漿后，經(jīng)反復凍融3次后，5000rpm/min離心10min。取上清用0.22μm濾膜除菌后，接種至牛腎細胞（MDBK）中，同時加入1000IU/mL青霉素和1000μg/mL鏈霉素，設置空白對照組。37℃吸附后1h，換成3%FBSDMEM細胞培養(yǎng)液，放置培養(yǎng)箱3d～5d，每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細胞病變（CPE）。數(shù)據(jù)處理分析①PCR產(chǎn)物借助1.0%核酸膠進行分析，參照DNA標準分子量，若待測樣品中擴增出片段大小為479bp，符合預期，且空白對照沒有條帶，將陽性片段克隆至pMD-18T載體，送生物公司測序，若測序的序列與NCBI公布的標準序列（參考附錄C）同源性大于95%，則可以確診為牛皰疹病毒1型感染陽性，否則判定為陰性。②qRT-PCR結果顯示待檢測樣品Ct值大于35且無“S”型擴增曲線時判定為陰性，Ct值小于35且出現(xiàn)“S”型擴增曲線時判定為牛皰疹病毒1型感染陽性。③若MDBK細胞出現(xiàn)CPE，即細胞出現(xiàn)變圓、聚集、拉絲，并最終全部脫落。需進一步收取細胞提取DNA，借助上述特異性引物，進行PCR或qRT-PCR檢測和測序確定，若易感細胞未出現(xiàn)CPE，應將細胞培養(yǎng)物凍融后盲傳3代，若盲傳后沒有CPE出現(xiàn)，則判定為未分離到病毒。3.2.4馬鼻肺炎病料樣品采集采集鼻拭子，血液，馬或驢的流產(chǎn)胎盤，肺臟和腦等病料組織，按NY∕T541要求進行。PCR檢測將待測病料樣品借助試劑盒提取DNA作為模版，借助特異性引物（序列參見表5）進行PCR檢測，具體操作步驟參照附錄A。將PCR產(chǎn)物利用1.0%核酸膠進行電泳分析,目的片段大小為792bp,482bp或316bp。表5.PCR引物信息名稱序列（5’→3’）片段大小EHV-1gB-FGAACCTCAGCCAACCCAEHV-1gB-RGCACTTTGCGGACGAACEHV-4gB-FTTGCCGCAACTCGCTCGTCAAG482bpEHV-4gB-FCTTAATCGCATTTAGACCGAEHV-8gG-FTCAGACTGTCACTCGTGGGAEHV-8gG-RCCTGAAGGCCGTTTAACACAqRT-PCR檢測：以純化的DNA為模版，利用特異性引物分別進qRT-PCR檢測（序列參見表6）,qRT-PCR具體操作步驟參照附錄B。表6.qRT-PCR引物信息名稱序列（5’→3’）片段大小qEHV-1gB-FGCCATACGTCCCTGTCCGACAAqEHV-1gB-RCCTCCACCTCCTCGACGATGCqEHV-4gB-FCGCAGAGGATGGAGACTTTTACAqEHV-4gB-FCATGACCGTGGGGGTTCAAqEHV-8gG-FGACGCGTAACGTTGGATGTGqEHV-8gG-RAATGTAACGTTTGCCCACGC野毒分離與檢測：將判定為馬皰疹病毒（EHV-1/4/8）陽性的組織病料借助研磨儀勻漿后，經(jīng)反復凍融3次后，5000rpm/min離心10min。取上清用0.22μm濾膜除菌后，接種至兔腎細胞（RK-13）中，同時加入1000IU/mL青霉素和1000μg/mL鏈霉素，設置空白對照組。37℃吸附后1h，換成3%FBSDMEM細胞培養(yǎng)液，放置培養(yǎng)箱3d～5d，每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細胞病變（CPE）。①PCR產(chǎn)物借助1.0%核酸膠進行分析，參照DNA標準分子量，若待測樣品中擴增出片段大小為792bp,482bp或316bp，符合預期，且空白對照沒有條帶，將陽性片段克隆至pMD-18T載體，送生物公司測序，若測序的序列與NCBI公布的標準序列（參考附錄C）同源性大于95%，則可以確診為EHV-1，EHV-4或EHV-8感染陽性，否則判定為陰性。②qRT-PCR結果顯示待檢測樣品Ct值大于35且無“S”型擴增曲線時判定為陰性，Ct值小于35且出現(xiàn)“S”型擴增曲線時判定為馬皰疹病毒1型，馬皰疹病毒4型或馬皰疹病毒8型感染陽性。并最終全部脫落。需進一步收取細胞提取DNA，借助上述特異性引物，進行PCR或qRT-PCR檢測和測序確定，若易感細胞未出現(xiàn)CPE，應將細胞培養(yǎng)物凍融后盲傳3代，若盲傳后沒有CPE出現(xiàn)，則判定為未分離到病毒。3.2.5綜合判定若患病動物（豬，雞，牛，馬或驢）出現(xiàn)呼吸困難，流產(chǎn)和神經(jīng)癥狀等，則可判定為疑似α皰疹病毒感染，需借助PCR，熒光定量PCR進行檢測，最后結合病原分離和測序等方法進行確診。（三）確定依據(jù)本標準成員主要針對豬偽狂犬病病毒（PRV），雞皰疹病毒2型（GaHV-2），牛皰疹病毒1型（BoHV-1）以及馬皰疹病毒1型，4型或8型（EHV-1/4/8）等α皰疹病毒診斷開展系統(tǒng)的研究。1.病毒的基因組和復制特點毒亞科，是該病毒屬中基因組最短的病毒亞科。基因組大小在125kb左右。主要特點是宿主范圍廣，病毒復制周期短，增殖速度較快，易誘發(fā)細胞病變，并在周圍神經(jīng)系統(tǒng)潛伏感2.流行特點和致病性PRV）引起豬的一種急性傳染病。豬是偽狂犬病毒的貯存宿主，患病豬、帶毒豬以及帶毒鼠類為本病重要傳染源。本病最主要的傳播途徑為空氣傳播，另外，在豬群中也存在鼻分泌物傳播為狂犬病毒的現(xiàn)象。該病流行具有季節(jié)性，常發(fā)生在寒冷的季節(jié)。該病主要導致發(fā)熱及腦脊髓炎，成年豬表現(xiàn)為一種亞臨診感染；妊娠母豬可見流產(chǎn)、死胎；育肥豬可見呼吸困難；仔豬以神經(jīng)癥狀為主。Alphaherpesvirus2，GaHV-2）引起雞的一種淋巴組織增生性疾病。病雞和帶毒雞是傳染來源，本病主要通過空氣傳播，另外污染的飼料和飲水，以及飼養(yǎng)人員流動也可傳播帶毒。本病主要是2-5月齡雞常發(fā)。該病主要導致雞外周神經(jīng)、內(nèi)臟器官、肛膜、肌肉及皮膚內(nèi)發(fā)生淋巴樣細胞浸潤，并發(fā)展成淋巴瘤。從而造成雞肢體麻痹、不食、拉稀、脫水、貧血2.3牛傳染性鼻氣管炎：該病由牛皰疹病毒1型（Bovineherpesvirus1，BoHV-1）引起牛的一種接觸性傳染病。病牛和帶毒牛是主要傳染源，病毒主要存在于鼻、眼、陰道分泌物和排泄物中。本病主要由飛沫經(jīng)呼吸道傳播，另外可通過生殖道黏膜、眼結膜傳播。該病常發(fā)于秋、冬寒冷季節(jié)。該病導致牛出現(xiàn)呼吸道及氣管黏膜發(fā)炎、呼吸困難、流鼻汁等癥狀，還可引起生殖道感染、結膜炎、腦膜腦炎、流產(chǎn)、乳房炎等多種病型。herpesvirustype,EHV-1/4/8）感染引起的一種急性、熱性傳染病。該病的主要傳染源是病馬或驢和恢復后的帶毒馬或驢,病毒可存在于患病動物的血液、鼻液及流產(chǎn)的胎膜和胎兒組織中,部分公馬或驢的精液中也可帶毒。本病主要經(jīng)呼吸道傳染，另外，消化道及交配也可傳染。該病多發(fā)生于秋冬和早春。該病主要導致馬屬動物出現(xiàn)呼吸道癥狀，孕馬或驢流產(chǎn)，神經(jīng)癥狀等。3.前期相關試驗數(shù)據(jù)本標準通過比對GenBank公布的PRV，GaHV-2，基因序列相對保守，而且臨床上主要應用PRV-gE基因缺失疫苗，該疫苗免疫雖能阻止臨床發(fā)病,但難以完全阻止野毒感染。序列比對發(fā)現(xiàn)GaHV-2的MDV073基因比較保守。和EHV-8的保守區(qū)域設定特異性PCR引物（詳見表1）和qPCR引物（詳見表2）。TTTGAATTCTTACGACACGATTTGATTCAGATTTTGTTACAAGTTCAAGGCCCACATC為了驗證本標準檢測引物的有效性，我們分別借助普通PCR引物分別現(xiàn)存的病毒進行檢測和規(guī)模化畜禽養(yǎng)殖場采集的待測血樣進行檢測。結果如下：3.1PRV檢測引物有效性測試，臨床樣本檢測，病原分離與①PRVgE引物濃度篩選②PRVDNA倍比稀釋PRVgE引物用10.0μM，對提取病配置相同PCR體系，不同稀釋度模板體積等量）。③PRVgB引物濃度篩選④PRVDNA倍比稀釋PRVgB引物用10.0μM，對提取病配置相同PCR體系，不同稀釋度模板體積等量）。⑤豬場臨床血液樣品檢測借助DNA提取試劑盒獲取將收集血液樣品的DNA，以此為模板進行PCR檢測。⑥臨床血液樣品測序比對⑦野毒分離和鑒定易感細胞MDBK出現(xiàn)CPE，即細胞出現(xiàn)變圓、聚集、拉絲，并最終全部脫落（圖7）。進一步收取細胞提取DNA，借助特異性引物進行PCR檢測。⑧實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測3.2GaHV-2檢測引物有效性測試，臨床樣本檢測，病原分離與鑒定①GaHV-2MDV073引物濃度篩選②GaHV-2DNA倍比稀釋GaHVM，對提取病毒DNA模板進行10倍數(shù)稀釋10-1，10-2,10-3,③雞場臨床血液樣品檢測：將待測血樣分別借助DNA提取試劑盒獲取將收集血液樣品的DNA，以此為模板進行PCR④臨床血液樣品測序比對:選取PCR陽性的樣品，將其克隆至pMD18-T載體送華大基因測序。⑤野毒分離和鑒定將組織病料粉碎過濾后，接種DF-1細胞，48h后，觀察細胞結果如圖15所示。分別收取細胞樣品提取DNA進行PCR檢測。⑥實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測3.3BoHV-1檢測引物有效性測試，臨床樣本檢測，病原分離與鑒定①BoHV-1gB引物濃度篩選②BoHV-1DNA倍比稀釋BHV-1gB引物用10.0μM，對提配置相同PCR體系，不同稀釋度模板體積等量）。③牛場臨床血液樣品檢測將待測血樣分別借助DNA提取試劑盒獲取將收集血液樣品的DNA，以此為模板進行PCR④臨床血液樣品測序比對選取PCR陽性的樣品，將其克隆至pMD18-T載體送華大基因測序。⑤野毒分離和鑒定將組織病料粉碎過濾后，接種MDBK細胞，48h后，觀察細胞結果如圖20所示。分別收取細胞樣品提取DNA進行PCR檢測。⑥實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測3.3EHV-1/EHV-4/EHV-8檢測引物有效性測試，臨床樣本檢測，病原分離與鑒定①EHV-1/EHV-4/EHV-8引物濃度篩選②EHV-1/EHV-4/EHV-8DNA倍比稀釋相應的引物為10.010-4，10-5，配置相同PCR體系，不同稀釋度模板體積等量。③EHV-1/EHV-4/EHV-8臨床血液樣品檢測將待測血樣分別借助DNA提取試劑盒獲取將收集血液樣品的DNA，以此為模板進行PCR檢測。④測序分析選取PCR陽性的樣品，將其克隆至pMD18-T載體送華大基因測序。⑤野毒分離與鑒定將組織病料粉碎過濾后，接種RK-13細胞，48h后，觀察細胞結果如圖26所示。分別收取細胞樣品提取DNA，借助不同病原引物進行PCR檢測。⑥EHV-1/EHV-4/EHV-8實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢本標準制定的皰疹病毒診斷方法涵蓋普通PCR和熒光定上述實驗數(shù)據(jù)證實本標準提供的PCR和定量PCR檢測引物和方法具有良好的敏感性、特異性、以及操作簡便等優(yōu)點，等病原的早期檢測、流行病學調(diào)查等提供一種有效的規(guī)范參EHV-1/EHV-4/EHV-8野毒分離的方法，為病原的檢測和溯源分析奠定基礎。4.第三方檢測機構驗證結論本標準涉及檢測內(nèi)容分別由山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所檢測中心，山東潤達檢測技術有限公司，和冠縣冠康動物檢測服務有限公司等3家檢測機構進行檢測驗證。檢測結果均與《動物疫病診斷技術第2部分：α皰疹病毒》編制說明提供的實驗數(shù)據(jù)保持一致（詳細內(nèi)容參見附件）。三、制定本標準的主要依據(jù)GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T18641偽狂犬病診斷方法GB/T18643雞馬立克氏病診斷技術GB/T16548病害動物和病害動物產(chǎn)品生物安全處理規(guī)程GB/T27621馬鼻肺炎病毒的PCR檢測方法NY∕T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范NY/T575牛傳染性鼻氣管炎診斷技術本標準編制團隊成員參考上述相應的診斷技術等研究成果，并結合我省規(guī)模化豬、雞、牛、馬或驢養(yǎng)殖場α皰疹病毒發(fā)病和流行情況。同時走訪山東省不同地區(qū)的規(guī)模化養(yǎng)殖場，調(diào)查當?shù)刎i，雞，牛，馬以及驢的疾病發(fā)生情況，采集血樣、鼻拭子以及流產(chǎn)病料等進