CCSB50T/ZNZ浙江省農產品質量安全學會發布IT/ZNZ234—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由浙江省農產品質量安全學會提出并歸口。本文件起草單位：浙江省水產技術推廣總站（浙江省漁業檢驗檢測與疫病防控中心）。本文件主要起草人：周欽、李詩言、王揚、何輝、柯慶青、王鼎南、丁雪燕、陸煒、牟哲松。1T/ZNZ234—2023水產養殖環境中五氯酚殘留量測定液相色譜串聯質譜法本文件規定了水產養殖環境中五氯酚殘留量的液相色譜串聯質譜測定方法。本文件適用于水體和底泥等水產養殖環境中的五氯酚殘留的測定。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法SC/T9102.1漁業生態環境監測規范第1部分：總則SC/T9102.2漁業生態環境監測規范第2部分：海洋SC/T9102.3漁業生態環境監測規范第3部分：淡水3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4原理在酸性條件下，試樣中的五氯酚用正己烷萃取，提取液經過濃縮，經固相萃取小柱凈化，用液相色譜-串聯質譜儀測定，內標法定量。5試劑和材料5.1乙腈（CH3CN）：色譜純。5.2正己烷（C6H14）：色譜純。5.3甲醇（CH3OH）：色譜純（同時作為流動相B）。5.4甲酸銨（CH5NO2）：色譜純。5.5硫酸（H2SO4ρ=1.83g/mL。5.6五氯酚標準物質（CAS87-86-5）。純度≥96%5.713C6-五氯酚（CAS85380-74-1）：純度≥96%。5.880%乙腈溶液：乙腈（5.1）和水按體積比8：2混合。5.910%硫酸溶液：硫酸（5.3）和水按體積比1：9混合。5.105mmol/L甲酸銨溶液：同時作為流動相A。稱取0.315g甲酸銨，加入水溶解于燒杯中，用水定容到1000mL容量瓶，混合均勻，現配現用。2T/ZNZ234—20235.11五氯酚標準儲備液（以五氯酚計，10.0μg/mL）：取五氯酚（5.5）標準物質適量（相當于五氯酚1mg用甲醇溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，混勻，將溶液轉移至棕色玻璃儲存瓶中，-18℃下避光保存，有效期6個月。5.12五氯酚標準工作液（以五氯酚計，100ng/mL）：準確量取1mL五氯酚標準儲備液（5.10），置于100mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，混勻，將溶液轉移至棕色玻璃儲存瓶中，-18℃下避光保存，有效期3個月。5.13五氯酚內標工作溶液（以13C6-五氯酚計，1μg/mL）：準確稱取10mg13C6-五氯酚（5.6），用甲醇溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，混勻成1mg/mL母液。量取適當體積母液，用甲醇逐級稀釋至1μg/mL五氯酚內標溶液，-18℃下避光保存，有效期3個月。5.14固相萃取小柱：EMR-Lipid小柱（3cc，300mg），或者使用性能相當固相萃取柱。5.15親水性聚四氟乙烯濾膜：0.22μm。6儀器和設備6.1液相色譜-串聯質譜儀：配有電子噴霧離子源。6.2電子天平：感量0.01g和0.1mg。6.3離心機：轉速不低于5000r/min。6.4旋轉蒸發儀。6.5渦旋振蕩儀：最大轉速3000r/min。6.6固相萃取裝置。6.7微量移液器。6.8采泥器。6.9冷凍干燥機：冷凍溫度≤-50°C，真空度＜20Pa。6.10雞心瓶：50mL。7樣品采集、制備及保存7.1按照SC/T9102.1、SC/T9102.2和SC/T9102.3規定的方法采集樣品，棕色玻璃瓶儲存水樣，樣品無需過膜，將500mL采樣瓶完全注滿，避光室溫保存，7天內分析完成。7.2底泥先在-20°C預冷凍24h，經冷凍干燥機（-50°C，真空度＜20Pa，冷凍干燥10h）冷凍干燥后，剔除石塊和植物體，用研缽研磨后過100目篩網，常溫避光干燥保存，1個月內完成分析。8測定步驟8.1樣品萃取及凈化8.1.1水樣處理準確移取50mL水樣樣品于100mL離心管，加入五氯酚內標溶液（5.13）200μL，加入1mL10%硫酸溶液（5.9），加入正己烷（5.2）20mL，振搖5min，5000r/min離心5min。取一半上清液到玻璃雞心瓶中，待凈化。8.1.2底泥處理3T/ZNZ234—2023稱取5.00g的底泥樣品，準確到0.01g，加入五氯酚內標溶液（5.13）100μL，加入10mL硫酸溶液（5.9），旋渦后加入20mL正己烷（5.2）溶液，振搖5min，5000r/min離心5min，再用20mL正己烷重復提取一次，移取全部上清液到玻璃雞心瓶中，待凈化。8.2凈化在40°C下旋轉蒸發至近干，向雞心瓶中加入2mL的乙腈溶液（5.8），漩渦復溶，在自然重力下過EMR-Lipid小柱，收集全部濾出液，經過0.22μm親水性聚四氟乙烯濾膜過濾，供液相色譜-串聯質譜儀測定。8.3儀器參考條件8.3.1液相色譜參考條件液相色譜參數設置應滿足以下條件：a)色譜柱：C18，2.6μm，2.1mm×50mm（內徑或相當者；b)流動相：5mmol/L甲酸銨溶液(5.10)，甲醇(5.3)，梯度洗脫條件見表1；c)柱溫：40°C；d)進樣量：2μL；表1液相色譜的梯度洗脫條件5mmol/L甲酸銨溶液8.3.2質譜參考條件質譜參考條件：a）離子源：電噴霧離子源；b）掃描模式：電噴霧電離負離子模式（ESI-）；c）監測方式：多重反應監測（MRM）；d）電噴霧電壓（IS）：4500V；e）離子源溫度（TEM）：550℃;f）氣簾氣壓力（CUR）：35psi；g）霧化氣壓力（GS1）：40psi；h）輔助氣壓力（GS2）：50psi；i）碰撞氣流速（CAD）：Medium。j）質譜參數見表2。4T/ZNZ234—2023表2五氯酚及13C6-五氯酚的定性離子、定量離子、去簇電壓及碰撞能量8.4標準曲線的制備精密量取標準工作液（5.12）和內標工作液（5.13）適量，經氮氣吹干后，用80%乙腈水溶液配制成五氯酚濃度為0.1ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL系列標準工作液（13C6-五氯酚內標濃度為50ng/mL）。分別以五氯酚濃度為橫坐標（x），五氯酚的峰面積和內標13C6-五氯酚峰面積比值為縱坐標（y）繪制標準曲線，求回歸方程和相關系數。8.5測定8.5.1定性測定在相同實驗條件下，樣品中待測物質的保留時間與基質標準溶液的保留時間的偏差在±2.5%之內，且樣品中各組分定性離子的相對豐度與濃度接近的基質混合標準工作溶液中對應的定性離子的相對豐度進行比較，偏差不超過表3規定的范圍，則可判定為樣品中存在對應的待測物。表3定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差>50±20±25±30±508.5.2定量測定取試樣溶液和標準工作液，作多點校準，五氯酚以13C6-五氯酚為內標，以色譜峰峰面積定量，內標 法計算。標準溶液及試樣溶液中目標藥物的特征離子質量色譜峰峰面積均應在儀器檢測的線性范圍之內。標準溶液特征離子質量色譜圖見附錄A。8.6空白實驗除不加試樣外，均按測定條件和步驟執行。9結果計算和表述9.1水體樣品結果計算按式（1）計算水體樣品中五氯酚殘留量。5T/ZNZ234—2023式中：X1—水體樣品中五氯酚殘留量，單位為納克每升（ng/Lc0—試劑空白結果，單位為納克每毫升（ng/mL）；c1—從標準曲線上得到的樣液中五氯酚的含量，單位為納克每毫升（ng/mL）；V1—樣品的最終定容體積，單位為毫升（mLV2—水體樣品的取樣體積，單位為毫升（mL）。9.2底泥樣品結果計算按式（2）計算底泥樣品中五氯酚殘留量。（2）式中：X2—底泥樣品中五氯酚殘留量，單位為微克每千克(μg/kgc0—試劑空白結果，單位為納克每毫升（ng/mL）；c2—從標準曲線上得到的樣液中五氯酚的含量，單位為納克每毫升（ng/mLV3—樣品的最終定容體積，單位為毫升（mL）；m—底泥樣品取樣質量，單位為克（g）。9.3結果表述測定結果保留小數點后一位。10檢測方法靈敏度、精密度、準確度10.1檢出限和定量限本方法水體樣品中五氯酚的檢出限為0.3ng/L，定量限為1.0ng/L；底泥樣品中五氯酚的檢出限為0.3μg/kg，定量限為1.0μg/kg。10.2準確度本方法在水體樣品中五氯酚加標濃度為1ng/L~500ng/L時，回收率為70.0%~120%；底泥樣品中五氯酚加標濃度為1μg/kg~10