正文抗生素抗性基因（ARG）是廣泛存在的污染物，對環(huán)境和公眾健康構(gòu)成嚴重威脅，尤其是廢水中的ARG是環(huán)境中ARG的重要來源。因此，監(jiān)測和評估廢水中的ARG豐度對于環(huán)境管理具有重要意義。這里，將LAMP與CRISPR/Cas12a結(jié)合，建立了用于檢測大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermB的便攜式視覺平臺，首先設(shè)計了LAMP的6個引物和CRISPR/Cas12a的crRNA，用LAMP進行預(yù)擴增，并通過堿基配對引導(dǎo)Cas12a識別ermB。由于CRISPR/Cas12a在擴增子識別后具有反式切割活性，使用報告分子修飾的ssDNA探針通過側(cè)流試紙條和熒光進行可視化檢測。經(jīng)過磁珠簡單的核酸提取后，所構(gòu)建的生物傳感器具有優(yōu)異的靈敏度和選擇性，使用熒光和廢水中的流條可以低至2.75×103

copies/μL，實現(xiàn)了快速、靈敏的可視化現(xiàn)場檢測。如Fig.1a所示，該生物傳感器的檢測過程包括以下步驟：過濾和裂解預(yù)處理、磁珠提取、LAMP預(yù)擴增、CRISPR/Cas12a系統(tǒng)識別和轉(zhuǎn)導(dǎo)、熒光和橫向檢測。作者首先設(shè)計了針對

ermB

基因的LAMP引物，接下來，設(shè)計了Cas12crRNA來特異性識別和檢測LAMP預(yù)擴增的ermB基因。以一段crRNA為指導(dǎo)RNA，Cas12a可以識別與crRNA識別片段互補的ermB片段。目標序列被識別后，其對ssDNA探針進行非特異性切割的反式切割活性被激活。之后，設(shè)計了用熒光和相應(yīng)的猝滅劑修飾的單鏈DNA探針(5′?6-FAM-TTATT-BHQ1–3′)和用熒光和生物素分子修飾的單鏈DNA探針(5′?6-FAM-TTATTATT-Biotin-3′)分別用于熒光和側(cè)流裝置中的可視化檢測。在熒光檢測中，在Cas12a反式切割存在的情況下，ssDNA熒光探針解離，釋放猝滅劑以恢復(fù)熒光信號。結(jié)果可以通過熒光讀數(shù)裝置或特定光源激發(fā)來直觀地讀取（Fig.1b）。相反，在沒有靶標的情況下，由于缺少激活的Cas12a，ssDNA探針不會被切割,因此，沒有產(chǎn)生熒光信號。在可視化的側(cè)流檢測中，側(cè)流探針的每一側(cè)都用FAM和生物素進行了預(yù)修飾。比色側(cè)流試紙條通常由帶有g(shù)t抗FAM抗體修飾的金納米顆粒(AuNP)的樣品墊、一條用鏈霉親和素標記以捕獲生物素的對照線和一條帶有標記的抗gt抗體以捕獲gt抗體的測試線組成。如果沒有特異性的LAMP產(chǎn)物，ssDNA探針保持完整，并且由于生物素和鏈霉親和素的結(jié)合，AuNP可以固定到對照線上，導(dǎo)致紅色沉積。相反，AuNPs復(fù)合物通過AuNPs和生物素的分離以及gt抗體與抗gt抗體的結(jié)合而固定在測試線上，形成紅色條帶。為了評估LAMP在檢測ermB基因時的靈敏度，將PCR擴增產(chǎn)生的目標DNA片段以10倍梯度稀釋。結(jié)果Fig.2所示，熒光LAMP成功檢測到ARG

ermB，LOD為2.75×10

3

copies/μL。DNA濃度與循環(huán)閾值時間（CT）之間存在良好的線性關(guān)系，線性范圍跨越8個數(shù)量級，最高可達2.75×10

10

copies/μL。為了進一步提高分析方法的特異性，研究人員將CRISPR/Cas12a系統(tǒng)引入檢測中，以解決潛在的假陽性問題并提高靈敏度（Fig

3.a,b）。接著，為了滿足復(fù)雜現(xiàn)場條件下可視化的各種可能要求，使用熒光和側(cè)流試紙進行可視化檢測分析(Fig

3.c,d)。之后，為了驗證構(gòu)建的基于CRISPR/Cas12a的視覺平臺的準確性和可靠性，對原廢水進行了現(xiàn)場檢測（Fig.4）。結(jié)果表明，構(gòu)建的CRISPR/Cas12a可視化平臺能夠?qū)崿F(xiàn)廢水中ARGs的快速現(xiàn)場檢測。總結(jié)：開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas12a的便攜式可視化生物傳感器，用于快速現(xiàn)場檢測和評估廢水中的ARG。從取樣到出結(jié)果的檢測過程在2小時內(nèi)完成，不需要復(fù)雜的儀