國家市場監督管理總局國家標準化管理委員會IGB/T40268—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由全國生化檢測標準化技術委員會(SAC/TC387)提出并歸口。本文件起草單位：北京市理化分析測試中心、中國檢驗檢疫科學研究院、深圳市易瑞生物技術股份管理技術中心。GB/T40268—2021體或抗原等生物活性分子，可以與目標物特異性結合。本文件包含了材料學、磁學和生物學等專業的內容和分析技術。本文件涉及的免疫磁性材料主要應用于生物醫藥、食品安全、體外診斷等領域的分離、純化和檢測等過程。本文件提出了免疫磁性材料基本性能的各項指標，確定了檢測該材料性能的方法。主要指標包括性和捕獲率穩定性。1GB/T40268—2021免疫磁性材料性能檢測方法本文件適用于50nm～100μm粒徑范圍內，具有超順磁性且表面固定有抗體或抗原等生物活性分子的復合材料的性能檢測。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T13888在開磁路中測量磁性材料矯頑力的方法GB/T15445.6粒度分析結果的表述第6部分：顆粒形狀和形態的定性及定量表述GB/T19077粒度分析激光衍射法GB/T21649.1粒度分析圖像分析法第1部分：靜態圖像分析法GB/Z26082納米材料直流磁化率(磁矩)測量方法GB/T29022粒度分析動態光散射法(DLS)GB/T38431顆粒分散體系穩定性評價靜態多重光散射法3術語和定義3.1表面固定有抗體或抗原等生物活性分子，在一定條件下能夠與目標物特異性結合的一類具有超順磁性的復合材料。3.2免疫磁性材料在分散體系中分散狀態隨時間發生的變化。3.3小于臨界尺寸具有單疇結構的鐵磁物質的磁化性質。注：當溫度低于居里溫度高于轉變溫度時表現為順磁性特點，但在外磁場作用下其順磁性磁化率遠高于一般順磁3.4在給定溫度下免疫磁性材料所能達到的磁化強度最大值。2GB/T40268—20213.5矯頑力coercivity通過單調降低外加磁場強度，免疫磁性材料的磁化強度從磁飽和狀態值降為零時，其矯頑磁場3.6磁回收率recoveryrateofmagneticmaterials在一定的捕獲體系中，免疫磁性材料均勻分散后，在磁場作用下分離回收得到的量與原體系中總量的百分比。3.7單位質量的免疫磁性材料捕獲目標物時，隨著捕獲體系中目標物增加，磁分離獲得的目標物不再增加時所得到的目標物結合量。3.8在一定的捕獲體系中加入一定量的目標物，經過免疫磁性材料結合并分離到的目標物與原體系中目標物總量的百分比。3.9捕獲特異性capturespecificity3.10捕獲率穩定性stabilityofcaptureefficiency免疫磁性材料在一定的儲存條件下或一定的捕獲體系內，保持原捕獲率的能力。4一般要求4.1試劑除非有特殊說明，所用的試劑均為分析純，水為GB/T6682規定的一級水。磷酸二氫鉀溶于1L水中。亦可根據免疫磁性材料的使用要求確定。4.2設備4.2.2磁力架(磁分選器):根據免疫磁性材料的使用要求確定，磁感應強度不小于0.3T。4.3樣品的準備進行各項性能檢測時，應將待測免疫磁性材料樣品用渦旋混合器振蕩30s以上，均勻分散后，立即吸取相應體積進行各項性能檢測。5質量濃度5.1檢測原理在真空2.67kPa(20mmHg)條件下，水的沸點降低至21℃左右，免疫磁性材料在56℃能快速干3GB/T40268—2021燥，且干燥過程中該材料不發生質量變化，以干燥至恒重時的稱量值作為該材料的質量來計算質量濃度。5.2儀器設備和器具5.2.1天平：感量0.1mg。5.2.2真空干燥箱：溫度精度±1℃,壓力能保持在2.67kPa(20mmHg)以下。5.2.3玻璃稱量瓶：規格35mm×25mm。5.2.4干燥器：內附有效干燥劑。5.3試驗步驟和結果計算準確吸取一定體積(Va,0.5mL～5.0mL)的免疫磁性材料樣品，用緩沖液清洗該材料兩次，加入到已烘干至恒重的玻璃稱量瓶(mw)中；置于磁力架上，將該材料磁分離，待上清液澄清后棄去上清，磁分離后該材料濕重需達到30mg～150mg。然后將裝有該材料的稱量瓶放置于真空干燥箱中，玻璃稱量瓶蓋子稍微錯開與試樣同時干燥，溫度設置為56℃±1℃,壓力應保持在2.67kPa(20mmHg)以下，干燥約1h,將玻璃稱量瓶和蓋子迅速移至干燥器中冷卻，冷卻15min后蓋好蓋子，稱重，精確至0.1mg。然后再次放入真空干燥箱中干燥約30min,之后冷卻，稱重，重復以上操作至恒重(ma)。免疫磁性材料樣品的質量濃度按式(1)計算： (1)式中：Po——免疫磁性材料樣品的質量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);md———免疫磁性材料樣品置于稱量瓶中烘干至恒重的質量，單位為毫克(mg);mw——烘干至恒重的稱量瓶質量，單位為毫克(mg);Vd——吸取的免疫磁性材料樣品的體積，單位為毫升(mL)。計算出3次平行測定結果的算術平均值和標準偏差，結果精確至0.1mg/mL。注：恒重為進行重復干燥后，連續兩次稱量值之差不大于0.3mg。6粒度6.1光學分析法微米級材料按GB/T19077的要求執行；納米級或亞微米級材料按GB/T29022的要求執行。6.2顯微圖像法本方法適用于粒徑范圍小于10:1的窄分布的免疫磁性材料樣品，按GB/T21649.1的要求執行。按GB/T15445.6的要求對表面形貌進行描述，并附照片。如光學分析法測量出的平均粒徑(D)和顯微圖像法測量出的平均粒徑(d)差距較大，可按式(2)計算團聚指數(T):…………(2)式中：D———光學分析法測量出的平均粒徑，單位為納米(nm);4GB/T40268—2021d——顯微圖像法測量出的平均粒徑，單位為納米(nm)。7分散穩定性用緩沖液將免疫磁性材料稀釋至使用濃度(一般為0.05mg/mL～50mg/mL),按GB/T38431的要求執行，得到不穩定性指數和遷移速度隨時間的變化關系曲線；或計算出一段時間內(一般為5min~30min,根據此樣品使用要求確定)不穩定性指數和遷移速度。計算出3次平行測定結果的算術平均值，不穩定性指數保留兩位有效數字，遷移速度保留至1mm/h。8超順磁性制磁化曲線和磁滯回線(進一步的操作細節參照JY/T0591.1—2020),得到飽和磁化強度；按GB/T138889磁回收率9.1檢測原理根據比爾定律，免疫磁性材料樣品的吸光度與該材料的濃度呈正比，通過測量免疫磁性材料樣品的吸光度以及經過磁分離回收得到的材料在相同緩沖液中重懸后的吸光度，計算磁分離后該材料濃度與磁分離前濃度的比值，即可得到磁回收率。9.2儀器設備和器具9.2.1分光光度計：波長范圍360nm～800nm。9.2.3離心管。9.3試劑料的使用要求確定種類和體積。9.4試驗步驟和結果計算9.4.1確定測試波長緩沖液稀釋免疫磁性材料樣品至0.1mg/mL～0.5mg/mL,渦旋振蕩，使均勻分散，加入比色皿中，通過可見光分光光度計進行全光譜波長掃描，選擇最大吸光度所對應的波長為測試波長。調整樣品濃度使其在測試波長下的吸光度落在0.3～0.8之間，此濃度記為pa,對濃度為p。的樣品按表1進行稀釋，將稀釋后的5個樣品振蕩混勻，分別在測試波長下檢測吸光度，建立磁回收率與吸光度之間的標準曲線，線性相關系數R應不低于0.99。5GB/T40268—2021表1稀釋樣品的制備及其吸光度值對應的磁回收率濃度為p。樣品與緩沖液比例磁回收率%將濃度為pa的樣品轉移至離心管置于磁力架中進行磁分離，3min左右至溶液變澄清，棄去上清根據此樣品使用要求確定)至磁分離測試液變澄清，棄去測試液。用緩沖液清洗該樣品材料2次以上，再加入與棄去上清液相同體積的緩沖液，渦旋振蕩，重懸，再次測定吸光度。進行3次平行試驗，3個吸光度的相對標準偏差允許5%以內，計算平均值，通過上述建立的標準曲線計算磁回收率(Pm)。結果保留兩位有效數字。10目標物飽和結合量在一定條件下，免疫磁性材料特異性結合目標物，并在一定磁場下將目標物分離出來，通過目標物的回收率來表示該材料的捕獲率；隨著目標物濃度的增加，當其結合目標物達到飽和后捕獲率會顯著下降，此時以該材料結合目標物的量作為目標物飽和結合量。目標物溶液：目標物標準品用緩沖液稀釋制備一系列濃度梯度的目標物溶液。注：目標物為細胞或微生物時，目標物溶液由標準細胞系或標準菌株純培養取得。10.3.2離心管。離心管中加入一定體積(V?,一般為0.1mL～1mL,根據使用要求確定)不同濃度(p:,i=1…n)的目標物溶液(最小的目標物濃度p?宜比該目標物檢測方法的定量限大2個數量級),再分別加入一定體積(V?,一般為0.01mL～0.1mL)的免疫磁性材料。然后進行免疫磁分離試驗：在適宜的溫度下(一般為室溫，根據使用要求確定)混勻一段時間(一般為10min～60min,根據使用要求確定),將離心管置于磁力架中進行磁分離，3min左右(根據使用要求確定)至溶液變澄清，取上清液檢測目標物的濃度(p?,s=1…n)。6目標物濃度的測定根據目標物種類的不同，參照的標準方法也不同。三大類別的目標物分別按照以下方法進行測定：a)目標物為藥物、毒素、激素、抗體、細胞因子等化合物時，按照相應的分析化學或免疫學等方法進行濃度的測定，如黃曲霉毒素B1參照GB/T36858—2018,單位為微克每毫升(μg/mL);b)目標物為細胞時，按照流式細胞儀或血球計數法進行細胞密度的測定，如CD4+T細胞參照GB/T38506—2020,單位為個每毫升(cells/mL);c)目標物為微生物時，按照平板培養法進行微生物濃度的測定，如沙門氏菌按照GB4789.2—2016,單位為菌落形成單位每毫升(CFU/mL)。10.5結果計算目標物濃度為p;時的捕獲率按式(3)計算：………………式中：CE;——目標物濃度為pi時的捕獲率；Ps——磁分離后上清液目標物的濃度，單位為微克每毫升(μg/mL)或個每毫升(cells/mL或CFU/mL);V?--——免疫磁性材料的體積，單位為毫升(mL);V?-—目標物溶液的體積，單位為毫升(mL);p;——目標物的濃度，單位為微克每毫升(μg/mL)或個每毫升(cells/mL或CFU/mL)。結果取3次平行試驗的算術平均值(3個結果的相對標準偏差允許5%以內),結果保留兩位有效數字。………………式中：w———單位質量免疫磁性材料的目標物飽和結合量，單位為微克每毫克(μg/mg)或個每毫克(cells/mg或CFU/mg);Pi-1——免疫磁性材料飽和前目標物的濃度(pi-1<pi),單位為微克每毫升(μg/mL)或個每毫升(cells/mL或CFU/mL);CEi-1-——目標物濃度為pi-1時的捕獲率；V?--—目標物溶液的體積，單位為毫升(mL);p?--——免疫磁性材料樣品的質量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);V?——免疫磁性材料的體積，單位為毫升(mL)。結果保留兩位有效數字。11目標物捕獲率11.1檢測原理免疫磁性材料對中等濃度目標物的回收率為目標物捕獲率。11.2儀器設備和器具同10.3。7GB/T40268—202111.3試驗步驟和結果計算11.3.1制備中等濃度的目標物溶液中等濃度為免疫磁分離試驗中最小的目標物濃度與飽和結合時目標物濃度的幾何平均值所處的濃度水平，按式(5)計算：Pm=√P?×Pi-1…………(5)式中：Pm——中等濃度，單位為微克每毫升(μg/mL)或個每毫升(cells/mL或CFU/mL);p?——最小的目標物濃度，單位為微克每毫升(μg/mL)或個每毫升(cells/mL或CFU/mL);Pi-1——目標物飽和結合量檢測中材料樣品達到飽和時目標物的濃度，單位為微克每毫升(μg/mL)或個每毫升(cells/mL或CFU/mL)。根據中等濃度的計算結果，用緩沖液制備目標物溶液。當測試液(見9.3)中目標物濃度可按照標準方法進行定量檢測時，也可用測試液代替緩沖液制備中等濃度的目標物溶液。11.3.2捕獲率的測定按10.4的步驟進行免疫磁分離試驗，并按式(3)計算目標物捕獲率(CEm)。12捕獲特異性12.1檢測原理免疫磁性材料的特異性體現為對等量目標物和非目標物捕獲率的比值。12.2.1中等濃度的目標物溶液：同11.3.1。12.2.2中等濃度的非目標物溶液：非目標物標準品用緩沖液稀釋至與目標物溶液相同濃度。12.3儀器設備和器具同10.3。12.4試驗步驟和結果計算按10.4的步驟進行免疫磁分離試驗，并按式(3)計算免疫磁性材料對目標物捕獲率(CEm)和非目標物捕獲率(CEa),然后按式(6)計算捕獲特異性：式中：S——捕獲特異性；CE?！庖叽判圆牧蠈Ψ悄繕宋锊东@率；CEm———免疫磁性材料對目標物捕獲率。結果保留兩位有效數字。8GB/T40268—202113