1駱駝奶樣布魯氏菌檢測技術規范4縮略語BHQ1：無熒光猝滅基團(Blackholequencher-1)Ct值：每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值所經歷的循環DNA：脫氧核糖核苷酸（DeoxyribonucleicacFAM：6-羧基熒光素（6-carboxyfluorescein)PCR：聚合酶鏈式反應（polymerase25.1超凈工作臺。5.3微流控系統。5.4高速臺式冷凍離心機，可控溫至4℃,離心速度可達12000g以上。5.6渦旋震蕩儀。5.11高壓滅菌鍋。播。感染的母駱駝可能在分娩時將布魯氏菌垂直傳播傳給新生駱駝。目前，已知有馬耳他布魯氏菌1為隱蔽，增加了診斷的難度，因此通常需要結合多種檢測39病原學鑒定9.1細菌的分離：取15mL乳樣，2000xg離心15min，用10μL接種環取奶油層2環，接種于TSA或選擇9.2菌落觀察9.3微流控qPCR采用引物BrqPCR-F/BrqPCR-R、探針BrqPCRprobe對），4），9.3.2.4質控標準9.3.2.5結果判定且出現典型擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果仍9.3.3微流控檢測流程將處理后奶樣、磁珠、內標、qPCR摸索后的引物9.4.1主要儀器9.4.2主要耗材9.4.3材料與試劑9.4.4操作步驟9.4.4.1抗原包被9.4.4.2封閉酶標板9.4.4.3加入待檢奶樣59.4.4.4加入HRP標記兔抗駱駝IgG加入工作濃度的HRP標記兔抗駱駝IgG抗體，100μL/孔，掉封口膜，棄掉孔內液體，每孔加300μL洗滌液，洗滌3次，每次1min，最后一次拍干。9.4.4.5加入底物溶液加入TMB底物溶液，100μL/孔，37℃避光孵育109.4.4.6加入終止液9.4.5質控標準9.4.6結果判定S/P＞0.29，判為奶樣布魯氏菌抗體陽性，S/6A.1基礎培養基瓊脂15g～20g；蛋白胨10g；氯化鈉加水1000mL上述成分混合，加熱使瓊脂溶化，然后調pH至7.8，再將培養基分裝三角瓶中，然后置20磅(1磅≈0.00689MPa)高壓滅菌A.2血清葡萄糖培養基A.3選擇培養基在1000mL血清葡萄糖培養基中加入下列成分，即為選擇若培養羊種布魯氏菌，需1000ml血清葡萄糖培養基中加入7A液和B液充分混合后即為儲備液。儲備液應在密封瓶中4℃避光保存，可使用3個月。使用時用蒸餾水按1:40比例將儲備液稀釋，8引物BrZL-F/MSZL-R（25pmol/μL）、膠回收試劑盒、質粒純化試劑盒、pMD-19T質粒、感受態上游引物BrZL-F：5'-TGGCTCGGTTGC下游引物BrZL-R：5'-CGCGCTTGCCTT用膠回收試劑盒回收PCR產物，與pMD-19T克隆載體連接，布于含100mg/L氨芐青霉素的LB培養基平板上，37℃培養12~16h。篩選出C.5.2根據擴增情況從中選取5~6個點制作適合標準曲線要求的標準9超聲波細胞破碎儀，恒溫搖床，制冰機，紫外可見分光光度引物（25pmol/μL）,BamHI限制性內切酶，XhoI限制性內切基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），His標簽蛋白純化試劑盒，LB培養基，一次性針頭濾器（孔徑D.3序列合成及表達載體的構建D.4.1取A.3中的菌液，以1:100的00r/min震蕩培養至菌液OD600值0.6～0.8，加入終濃度為1.0mmol/L的IPTG，誘導培養5h。/min離心10min，棄上清。D.4.4用15mLpH7.4PBS重懸沉淀，充分吹散混勻，將離心管置于碎冰中，再放到超聲波細胞破碎儀中，以超聲5s，間隔1s的程序，超聲破碎30D.4.7純化后的蛋白溶液，用0.45μm一次性針頭濾器過濾除菌。D.4.8用紫外可見分光光度計測定蛋白的濃度，蛋白濃度達到0.D.4.9用高效液相色譜法進一步純化并分析蛋白純度，純度達到90%以上符合要求。Na2CO3NaHCO3200mL將Na2CO3和NaHCO3加入去離子水中，完全溶解后，用0.45μm一次性針頭濾器過濾除菌，室溫保