微生物工程重點第一章微生物工程的組成部分：（1）上游工程（2）生物反應過程（3）下游工程微生物工業產品類型：（1）代謝產物初級代謝產物、次級代謝產物、基因工程外源蛋白（2）菌體活性微生物、富含有用物質的微生物（3）酶制劑α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果膠酶、纖維素酶等（4）轉化產品甾體激素、抗生素、前列腺素（5）機能利用凈化環境、生態平衡、探礦、采礦等發酵工業概念：發酵工業是傳統發酵技術和現代DNA重組、細胞融合等新技術相結合并發展起來的現代生物技術，并通過現代化學工程技術，生產有用物質或直接用于工業化生產的一種大工業體系。次級代謝：是指微生物在一定的生長時期，以初級代謝產物為前體，合成一些對微生物的生命活動無明確功能的物質的過程。次級代謝產物：通過次級代謝合成的產物，是微生物在生長的穩定期合成具有特定功能的代謝產物，與菌體的生長繁殖無明確關系，它們的生物合成具有特異性。如抗生素，植物堿等。微生物工程的特點是什么？發展趨勢如何？特點：（1）原料廣，價格低（2）微生物種類多，分布廣，具有可變異性（3）反應條件溫和（4）發酵途徑多樣化，產品多樣化（5）生長繁殖速度快，生產周期短（6）需要控制生產環境，避免雜菌污染發展趨勢：微生物工程結合了基因工程、酶工程、細胞工程技術，現代生物技術的快速發展給微生物工程提供了巨大的發展空間。如：1、菌種技術：菌種的篩選（極端微生物、轉基因菌種)2、發酵技術：發酵培養基制備技術、發酵路線的優化和控制3、微生物工程下游分離、純化技術。第二章簡要分析工業微生物菌種的基本要求？（1）具備高產目的代謝產物的能力（2）生長繁殖力強，較高的生長速率，發酵周期短（3）能利用低價格、來源廣的農副產品原料，發酵成本低（4）培養條件要求不高，培養條件易于控制（5）無副產品或少副產品（6）有穩定的遺產性狀，不易變異和退化。以保證產品的穩定性（7）非病源微生物。第三章工業微生物的代謝調節和代謝工程微生物的代謝：代謝是細胞內所有的生物化學過程的總稱，包括物質代謝和能量代謝兩個方面。微生物代謝調節的方式：1、細胞透性的調節：細胞質膜的透性直接影響物質的吸收和代謝產物的分泌，從而影響到細胞內代謝的變化。2、限制基質與酶的接近：細胞具有復雜的膜結構使其代謝活動只能在特定的部位上進行，代謝活動是區域化的，其實質是控制酶與底物接觸，使各個反應有序地進行。（1）原核微生物：細胞結構雖然簡單，但也劃分出不同的區域，與某一代謝途徑有關的酶系則集中某一區域，以保證這一代謝途徑的酶促反應順利進行，避免了其他途徑的干擾。（2）真核微生物：細胞里，各種酶系被細胞器隔離分布。3.控制代謝流;處于一定環境條件下的微生物培養物中，參與代謝的物質在代謝網絡的有關代謝途徑中按一定規律流動，形成微生物代謝的物質流。微生物控制代謝流的方法：（1）調節現有酶的量（2）改變已有酶分子的酶活性調節：酶活性調節是指通過改變已有酶分子的活性來調節代謝速度的調節方式。特點：是在蛋白質水平上的調節，直接，見效快。1、酶的激活：在激活劑的作用下，使原來無活性的酶變成有活性，或使原來活性低的酶提高了活性的現象。激活劑：凡是能提高酶活性的物質稱為激活劑；激活劑大多數是金屬離子：Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+、Co2+、Ni2+代謝調節的激活作用：代謝物對酶的激活。（1）前（體）饋激活：指代謝途徑中后面的酶促反應可被該途徑中較前面的一個中間產物所促進。（2）代謝中間產物的反饋激活：指代謝中間產物對該代謝途徑的前面的酶起激活作用。2、酶的抑制抑制:由于某些物質的存在，降低酶活性的現象；抑制可以是可逆或不可逆的。在代謝調節過程中所發生的抑制現象主要是可逆的，而且大多屬于反饋抑制（即末端產物對酶活性的抑制）3、酶活性調節的機制（1）變構調節：有些酶除了活性中心（結合部位和催化部位）外，還存在一個特殊的調控部位，即變構中心，當特異性分子非共價地結合到這個部位時，可以改變酶分子構象，對酶起到激活或抑制的作用。具有變構作用的酶稱為變構酶。由于變構劑與變構中心的結合而引起酶活性改變的現象稱為變構調節。（2）共價修飾某些酶蛋白肽鏈上的側鏈基團在另一酶（修飾酶）的催化下可與某種化學基團發生共價結合或解離，從而改變酶的活性，這一調節酶活性的方式稱為酶的共價修飾。共價修飾作用可分為可逆和不可逆兩種化學基團：磷酸基、甲基、乙基、腺苷酰基。蛋白質的共價部位：氨基酸殘基上的羥基。1）

可逆共價修飾大多數共價調節是通過特定部位的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸的側鏈（-OH）的磷酸化和去磷酸化來調節的。（意義：可在短時間經信號啟動，觸發生成大量的活性酶。更容易控制酶的活性以響應環境代謝的。）2）不可逆共價修飾酶原的激活：無活性的酶原必須在一定條件下，去掉一個或者幾個特殊的肽鍵，從而使酶的構象發生一定的變化才有活性。（3）締合與解離能進行這種轉變的蛋白質由多個亞基組成，蛋白質活化與鈍化是通過組成它的亞基單位的締合與解離實現的。（4）競爭性抑制一些蛋白質的生物活性受代謝物的競爭性抑制。酶的誘導：（1）組成酶和誘導酶：根據酶的生成是否與環境中所存在的該酶底物或其有關物的關系，可把酶劃分成組成酶和誘導酶兩類。組成酶：是細胞固有的酶，它們的合成與環境無關，隨菌體形成而合成，在菌體內的含量相對穩定。（如：糖酵解途徑有關的酶）誘導酶：只有在環境中存在誘導劑時，它們才開始合成，一旦環境中沒有誘導劑，酶的合成就終止。（誘導酶是細胞為適應外來底物或其結構類似物而臨時合成的一類酶。）（2）酶的誘導合成：①協同誘導：即當誘導物加入后，微生物能同時或幾乎同時誘導幾種酶的合成，它主要存在于短的代謝途徑中。②順序誘導：即先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中間代謝物的酶，以達到對較復雜代謝途徑的分段調節。酶合成的阻遏在某代謝途徑中，當末端產物過量時，微生物的調節體系就會阻止代謝途徑中包括關鍵酶在內的一系列酶的合成，從而徹底地控制代謝，減少末端產物的生成，這種現象稱為酶合成的阻遏。酶合成的阻遏包括：末端產物阻遏：由于某代謝途徑末端產物的過量積累而引起酶合成的阻遏產物末端代謝產物阻遏。特點：同時阻止合成途徑中所有酶的合成。對直線式反應途徑來說，未端產物阻遏的情況較為簡單，即產物作用于代謝途徑中的各種酶，使之合成受阻遏止，例如精氨酸的生物合成途徑。對分支代謝途徑來說，情況較為復雜。每種未端產物僅專一地阻遏合成它的那條分支途徑的酶。而代謝途徑分支點前的酶則受所有分支途徑末端產物的共同阻遏。分解代謝物阻遏：指細胞內同時存在兩種以上可利用底物（碳源或氮源）時，利用快的那種底物會阻遏利用慢的底物的有關酶合成的現象。這種阻遏并不是快速利用底物直接作用的結果，而是由這種底物分解過程中產生的中間代謝物引起，因此稱為分解代謝物阻遏。第四章培養基的設計與滅菌1、生長因子從廣義上講，凡是微生物生長不可缺少的微量的有機物質，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長因子。2、前體前體指某些化合物加入到發酵培養基中，能直接彼微生物在生物合成過程中合成到產物物分子中去，而其自身的結構并沒有多大變化，但是產物的產量卻因加入前體而有較大的提高。用法：前體使用時普遍采用流加的方法（前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利。）3、產物促進劑和抑制劑所謂產物促進劑是指那些非細胞生長所必須的營養物，又非前體，但加入后卻能提高產量的添加劑。如酶的誘導物3、抑制劑在發酵過程中加入抑制劑會抑制某些代謝途徑的進行，同時會使另外一些代謝途徑活躍，從而獲得人們所需的某種產物或正常代謝的某一中間產物積累起來。設計培養基的原則1、培養微生物的目標要明確2、培養基中的營養組分要協調3、培養基的理化條件要適宜4、培養基的成本要盡可能的經濟節約對大多數微生物的培養與發酵而言，要考慮向培養基中添加的成分主要有哪幾類？為什么？答：主要分類：碳源、氮源、無機鹽、水、生長因子、能源原因：（1）碳源：微生物細胞干物質中含碳量約為50%，出去水分內外，碳源是需求最大的營養物。異養微生物必須利用有機碳源，而自養微生物主要利用無機碳源。（2）氮源：N是構成微生物細胞中的重要組成部分，蛋白質和核酸的主要構成元素，占細胞干重的12%-15%，對微生物的生命活動由重要作用。（3）無機鹽：為微生物生長繁殖提供碳源、氮源以為的各種重要元素。（4）水分：作為溶劑，保證生化反應的正常進行，維持生物大分子的結構穩定，有效的穩定細胞的溫度，將發酵過程中的多余能量排除。（5）生長因子：某些異養型微生物在含有C、N和無機鹽的培養基中生長緩慢，可以通過添加生長因子調節微生物的正常代謝。（6）能源：為微生物的生命活動提供能量。固體培養基與液體培養基各有何用途？分別選用固體、液體培養基發酵產生一種胞外酶，試述有何異同。用途：固體培養基用于培養菌落或動植物組織、觀察、分離提純微生物、用于保存運輸；液體培養基適宜各類微生物的營養生長，廣泛運用于擴大培養及大規模生產。異：（1）液體培養基中細胞生長速率高于固體培養基（2）液體培養分離難度高于固體培養。（3）液體培養便于控制進料、出料，保持培養濃度，而固體培養需分批次培養發酵，培養濃度不受控制。（4）液體培養及時出料，使產物及時分離，使培養環境不積累產物，導致抑制微生物生長。同：（1）都需要產物分離純化；（2）培養條件基本相同。（3）培養基成分基本相同。在實驗室研究的實踐中如何避免高溫滅菌對培養基中的營養成分破壞？（1)某些情況下，可采用過濾除菌的替代方法（2)對培養基中含有的糖類等不耐高溫的成分，課將其與培養基其他成分分開滅菌，冷卻后再混合。將培養基中的Ca+、Fe3+成分與磷酸鹽分別滅菌，防止發生沉淀反應。（3)葡萄糖經過112℃，滅菌15min，只破壞0.6%，所以對這些成分的滅菌可通過降低滅菌溫度或縮短滅菌時間的方法進行，盡可能減少損失。（4)采用連續滅菌的方法。可以縮短滅菌時間，減少營養成分的流失。滅菌的方法1）干熱滅菌法：在烘箱內熱空氣滅菌，將物品放入烘箱內，然后升溫至160℃-170℃，維持1-2小時。2）火焰滅菌法：焚燒法:是利用火焰直接殺死微生物的滅菌法。簡單、徹底，但對被滅菌物品的破壞極大。電磁波、射線滅菌法：是利用電磁波、紫外線、X射線、γ射線或放射性物質產生的高能粒子殺死大多數物質上的微生物的一種有效方法。3）濕熱滅菌法：1、高壓蒸汽滅菌法：121℃（1kg/cm2或15磅/英寸2）維持15-20min。112℃（0.5kg/cm2或8磅/英寸2）20-30min。115℃（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）20-30min。應根據滅菌物品的性質或成分選擇滅菌溫度煮沸滅菌法：將待消毒物品如注射器、金屬用具、解剖用具等在水中煮沸15min或更長時間，以殺死細菌或其他微生物的營養體和少部分的芽孢或孢子。（如果在水中適當加1％碳酸鈉或2％-5％的石炭酸則殺菌效果更好）間歇滅菌法：對于某些培養基，由于高壓蒸汽滅菌會破壞某些營養成分，可用間隙滅菌法滅菌，即流通蒸汽(或蒸煮)反復滅菌幾次。巴氏滅菌法低溫維持法：只要在63℃下維持30min高溫瞬時法：只要在72℃下維持15s超高溫法：只要在135-150℃下維持2-6s濕熱滅菌法原理：就是直接用高溫蒸汽滅菌。蒸汽在冷凝時釋放出大量潛能，并且蒸汽具有強大穿透力，蒸汽的濕熱破壞菌體蛋白質和核酸的化學鍵，使酶失活，微生物因代謝障礙而死亡。濕熱滅菌的效果：取決于致死溫度和致死時間。5）化學藥劑滅菌法6）過濾除菌法：將液體或氣體用微孔薄膜過濾，使大于孔徑的細菌等微生物顆粒阻留，從而達到除菌目的。（不耐熱的液體培養基、血清、維生素、氨基酸及氣體等物的滅菌多用此法除菌。）分批滅菌法：將配制好的培養基放入發酵罐中，在罐內通入蒸汽，使培養基和所有設備一起滅菌，達到預定滅菌溫度后，維持一定時間，再冷卻到發酵溫度，然后接種發酵。過程包括：升溫、保溫（121℃維持30min）和冷卻三階段。連續滅菌（又稱連消）：將培養基在發酵罐外通過連續滅菌裝置進行加熱、保溫和冷卻而進行滅菌。流程：（1）配料預熱罐:將配制好的料液預熱到60~70°C，以免連續滅菌時由于料液與蒸汽溫度相差過大而產生水汽撞擊聲；（2）連消塔:用高溫蒸汽使料液溫度很快升高到滅菌溫度（126-132°C）；（3）維持罐：使料液在滅菌溫度下保持5~7min。因為：連消塔加熱的時間很短，光靠這段時間的滅菌是不夠的；（4）冷卻管：使料液冷卻到40~50°C后（冷水噴淋），輸送到預先滅菌過的罐內。空氣過濾除菌原理（1）慣性撞擊截留作用空氣氣流流速大時，氣流中的微粒具有較大的慣性力。當微粒隨氣流以一定速度向纖維垂直運動因受纖維阻擋而急劇改變運動方向時，由于微粒具有的慣性作用使它們仍然沿原來方向前進碰撞到纖維表面，產生摩擦粘附而使微粒被截留在纖維表面，這種作用稱慣性碰撞截留。（2）攔截截留作用微粒隨空氣氣流向前運動，當氣流為層流時，隨氣流運動的粒子在接近纖維表面的部分由于與過濾介質接觸而被纖維吸附捕集，這種作用稱之為阻攔截留。空氣流速愈小，纖維直徑愈細，阻攔截留作用愈大。（3）布朗擴散截留作用直徑小于1μm的微粒在運動中往往產生—種不規則的布朗運動，使微粒間相互凝集成較大的粒子，從而發生重力沉降或被介質截留。這種作用只有在氣流速度較低時才較顯著。（4）重力沉降作用重力沉降是一個穩定的分離作用，當微粒所受的重力大于氣流對它的拖帶力時，微粒就容易沉降。就單一的重力沉降情況下，大顆粒比小顆粒作用顯著，對于小顆粒只有在氣流速度很慢時才起作用。一般它是與攔截作用相配合的，即在纖維的邊界滯留區內，微粒的沉降作用提高了攔截滯留的捕集效率。（5）靜電吸引作用干空氣對非導體的物質相對運動磨擦時，會產生誘導電荷，纖維和樹脂處理過的纖維，尤其是一些合成纖維更為顯著。懸浮在空氣中的微生物微粒大多帶有不同的電荷，如枯草桿菌孢子20%帶正電荷，20%帶負電荷，15%中性，這些帶電的微粒會受帶異性電荷的物體所吸引而沉降。空氣凈化的流程1兩級冷卻、加熱除菌流程2冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程3高效前置過濾空氣除菌流程4利用熱空氣加熱冷空氣流程第五章種子的擴大培養種子擴大培養種子擴大培養是指將保存在斜面、砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態的生產菌種接入試管斜面活化后，再經過茄子瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養，最終獲得一定數量和質量的純種過程。種子擴大培養的作用：（1）通過逐級擴大培養過程，生產菌種能夠在短時間內形成細胞的集團優勢，抑制其他雜菌的侵染；（2）通過擴大培養才有可能在大罐上實現細胞生長繁殖速度快，很快進入發酵期、縮短了發酵周期；（3）通過逐級擴大培養過程使生產菌種逐步適應大生產的培養條件。種子擴大培養的目的和目標目的：為每次發酵罐的投料提供相當數量的代謝旺盛的種子。目標：獲得純而壯、活力旺盛、數量足夠的培養物。種子擴大培養的方法1.實驗室階段（1）、斜面種及孢子的制備(2)液體種的制備：好氧培養：斜面→試管→三角瓶→搖床→種子罐厭氧（靜止）培養對于酵母菌（啤酒、葡萄酒、清酒等）：斜面→試管→三角瓶→卡式罐→種子罐2、生產車間階段：種子培養在種子罐里面進行，一般在工廠歸為發酵車間管理。3、發酵級數的確定無菌接種的方法：從實驗室搖瓶或孢子懸浮液容器接種種子質量控制：（1）優質種子的標準：1）菌種細胞的生長活力強、同步性號，移種至發酵罐后能迅速生長，延滯期短。2）生理狀態穩定，保持穩定的生產能力。3）菌體細胞總量及濃度能滿足大容量發酵罐發酵的要求4）無雜菌及噬菌體污染，以確保整個發酵過程的正常進行。影響種子質量的因素：1、培養基2、種齡3、接種量4、溫度5、pH值6、通氣與攪拌7、泡沫8、雜菌污染移入種子的體積接種量＝-—————————接種后培養液的體積種子異常分析：菌種生長過慢或過快：與孢子質量及種子罐的培養條件有關。通入種子罐的無菌空氣的溫度較低或者培養基的滅菌質量較差是種子生長、代謝緩慢的主要原因。菌絲結團：與攪拌效果差，接種量小有關。菌絲結團會影響菌的呼吸和對營養物質的吸收。菌絲粘壁：與攪拌效果不好，泡沫過多，以及種子罐裝料系數過小等原因有關。其結果使培養液中菌絲濃度減少，最后就可能形成菌絲團。雜菌污染第六章微生物發酵過程原理一、微生物發酵動力學發酵動力學：是研究微生物生長、產物合成、底物消耗之間的動態定量關系，定量描述微生物生長和產物形成過程的學問。發酵動力學研究目的：（1）認識發酵過程的規律（2）優化發酵工藝條件，確定最優發酵過程參數，如：基質濃度、溫度、pH、溶氧等等（3）提高發酵產量、效率和轉化率等生長速率：單位體積、單位時間內生長的菌體量稱為群體的生長速率。比生長速率：單位菌體的生長速率。菌體濃度除去菌體的生長速率。基質消耗速率：單位時間內消耗的基質量。Yx/s：菌體得率系數YG:菌體生長得率系數m:維持系數代謝產物的生成速率:代謝產物的比生成速率:生長得率:表觀生長得率：Yx/s理論生長得率：YG(不考慮細胞維持所消耗的底物，只考慮細胞合成時細胞對底物的得率。)產物得率:是指消耗每單位（1g或1mo1)基質所合成的產物量（g或mol)。產物形成動力學(1)生長偶聯型產物形成速率與細胞生長速率有密切聯系，合成的產物通常是分解代謝的直接產物。如葡萄糖厭氧發酵生成乙醇，好氧發酵生成中間代謝產物。一般來說在這種類型的發酵生產中，控制好最佳生長條件就可獲得產物合成的最適條件。偶聯型產物的形成速率與微生物的比生長速率以及培養基中的菌體濃度成正比。(2)部分生長偶聯型產物形成速率與細胞生長速率部分相關。(3)非生長偶聯型產物形成速率只與細胞積累量有關，細胞生長時無產物，細胞停止生長后則有大量產物積累。這種產物即次級代謝產物。微生物發酵操作方式（一）分批發酵法特點：1、微生物所處的環境是不斷變化的。2、可進行少量多品種的發酵生產。3、發生雜菌污染能夠很容易終止操作。4、當運轉條件發生變化或需要生產新產品時。易改變處理對策。5、對原料組成要求較粗放。（二）補料分批發酵法補料的內容：（1）補充碳源和能源物質（2）補充氮源（3）補加無機鹽、微量元素或前體物質（4）補加酶的底物（5）補水、酸、堿等等補料的原則：控制微生物的中間代謝，使之向著有利于產物積累的方向發展。要根據菌體的生長代謝、生物合成規律，利用中間補料的措施給予產生菌適當的調節，讓它在生物合成階段有足夠但又不過多的養料供給其合成和維持正常代謝的需要。補料的控制：（1）無反饋控制（2）反饋控制補料分批培養的優點與傳統分批發酵相比，其優點在于使發酵系統中維持很低的基質濃度。低基質濃度的優點為：①可以除去快速利用碳源的阻遏效應，并維持適當的菌體濃度，使不致于加劇供氧的矛盾。②避免培養基積累有毒代謝物。適用范圍：補料分批發酵廣泛應用于抗生素、氨基酸、酶蛋白、核苷酸、有機酸及高聚物等的生產。（三）連續發酵所謂連續培養，是指以一定的速率向發酵液中添加新鮮培養基的同時，以相同的速率流出培養液，從而使發酵罐內的液量維持恒定不變，使培養物在近似恒定狀態下生長的培養方法。連續發酵的特點1、提供了一個微生物在恒定狀態下高速生長的環境，可以有效地延長微生物的指數生長期。2、在恒定的狀態下，微生物所處的環境條件，如營養物質濃度、產物濃度、pH值，以及微生物細胞的濃度、比生長速率等可以始終維持不變，甚至還可以根據需要來調節生長速率。連續發酵優缺點優點：1）高效：減少分批培養中每次清洗、裝料、滅菌、接種、放罐等的操作，從而減少了非生產時間，提高生產效率和設備的利用率。2）節約：節省了大量的人力、動力、水和蒸汽，且使水、電、汽的負荷均勻合理。3）自動化程度高：便于使用各種儀表實現自動化控制，降低勞動強度。4）可維持穩定的操作條件，使產率和產品質量比較穩定；缺點：1）長周期連續發酵易發生微生物菌種變異，導致菌種退化。2）開放的系統和長周期發酵，易造成染菌。長時間的連續發酵中對發酵設備和空氣凈化系統的無菌要求更高。不能保持長時間的無菌操作是導致連續發酵失敗的主要原因。3）新加入的培養基與原有的培養基不易完全混合，流出液中可能有未被利用的營養物質，降低了營養物質的利用率。對于某些原材料價格昂貴的產品，由于連續發酵對基質利用率較低，往往造成生產成本的增加。4）絲狀菌體易附著在器壁上以及在發酵液中結團，造成連續操作的困難。連續發酵的模式：1）全混式2）活塞流式第七章發酵工藝控制發酵熱Q發酵：所謂發酵熱就是發酵過程中產生的熱量減去散失的熱量即凈熱量。發酵熱是引起發酵過程溫度變化的原因。發酵熱引起發酵液的溫度上升。發酵熱大，溫度上升快，發酵熱小，溫度上升慢。發酵熱的成分;生物熱：微生物生長繁殖過程中的產熱攪拌熱：機械攪拌造成的摩擦熱蒸發熱：被通氣和蒸發水分帶走的熱量輻射熱：發酵罐罐體向外輻射的熱量顯熱：空氣流動過程夾帶著的熱量Q發酵=Q生物+Q攪拌-Q蒸發-Q顯-Q輻射溫度控制的方法：分階段溫度控制策略pH對發酵的影響和控制影響1、pH值影響細胞膜所帶電荷的狀態2、pH影響酶的活性3、pH值影響培養基某些成分的解離4、pH影響菌體的形態5、pH影響代謝過程和產物合成引起pH下降的原因（1）C/N比過大，供氧不足，有機酸積累，引起pH下降（2）碳源的種類：快速利用碳源，有機酸積累多，會引起pH下降；慢速利用碳源，有機酸積累少，pH較穩定；（3）氮源的利用：培養基中的NH