新冠病毒的檢測方法2020.05SARS-CoV-2檢測方法核酸檢測實時熒光PCR環介導等溫擴增技術（LAMP)重組酶聚合酶擴增技術(RPA)基于Cas酶的檢測技術免疫檢測膠體金技術檢測方法￥1

70SARS-CoV-2的檢測——核酸檢測基于RNA的RNA聚合酶RNA-dependentRNApolymerase包膜蛋白基因Envelopegene核衣殼蛋白Nuclearcapsid主要檢測的基因￥1

70SARS-CoV-2的檢測——核酸檢測熒光RT-PCR當完整的探針與目標序列配對時，熒光基團發射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應時，聚合酶的5'外切酶活性將探針進行酶切，使得熒光基團與淬滅劑分離，因而熒光基團發射出熒光信號。隨著擴增循環數的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此熒光強度與擴增產物的數量呈正比關系缺點：如需快速精準升降溫的PCR儀器，溫度范圍一般要求0~100℃，且反應時間長，操作要求高等。針對目的基因6個區域設計出4種特異引物F3、B3、FIP、BIP，在嗜熱脂肪芽孢桿菌鏈置換DNA聚合酶（BstDNApolymerase）的作用下，可在60~65℃實現恒溫擴增，15~60min即可實現109～1010倍的核酸擴增。具有操作簡單、終點可視檢測等提點。SARS-CoV-2的檢測——核酸檢測環介導等溫擴增技術（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）￥1

70SARS-CoV-2的檢測——核酸檢測等溫擴增技術之重組酶聚合酶擴增技術（Recombinase?Polymerase?Amplification，RPA）RPA技術主要依賴于3種酶：能結合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單鏈DNA結合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶。最佳溫度為37℃~42℃，擴增反應所需時間少于30min。重組酶首先與引物結合形成的蛋白質-引物復合體，能在雙鏈DNA中定位同源序列，發生鏈交換反應并啟動DNA合成，達到目標區域指數式擴增，被替換的DNA鏈與SSB結合，以防止進一步替換。整個過程一般可在10min之內獲得可檢出水平擴增的產物SARS-CoV-2的檢測——核酸檢測

LAMP

RPASARS-CoV-2的檢測——核酸檢測基于Cas酶檢測技術之SHERLOCK技術

CＲISPＲ/Cas系統是原核生物的適應性免疫系統，可保護古生菌和細菌免受外來遺傳因素(如噬菌體和質粒)的干擾。CＲISPＲ/Cas存在于幾乎所有的古細菌和約40%的細菌中，但不存在于真核生物或病毒中。目前CＲISPＲ/Cas系統分為2類，6型和30多種亞型。在Cas蛋白和CＲISPＲＲNA(crＲNA)形成效應復合物時，1類系統(包括Ⅰ型，Ⅲ型和Ⅳ型)需要多個Cas蛋白，而2類系統(包括Ⅱ型，Ⅴ型和Ⅵ型)只需單個多結構域的Cas蛋白。Cas13屬于2類CＲISPＲ系統的Ⅵ型，只切割單鏈而不切割雙鏈ＲNA，當Cas13蛋白與crＲNA結合后，形成的ＲNA靶向效應復合物具有ＲNA核糖核酸酶(ＲNase)活性，已成為可編程識別RNA的強大工具。基于Cas13非特異的ＲNA切割能力，Cas13已被開發為體外核酸檢測的高靈敏度診斷工具。該系統依賴于ＲNA熒光報告探針，其在ＲNA被切割之前不發射任何熒光，當Cas13a被靶ＲNA激活后切割ＲNA熒光報告探針從而發出熒光，由于Cas13a強大的ＲNase活性，一個靶ＲNA激活的Cas13a可切割數以千計的ＲNA探針，對反應體系里的靶ＲNA進行信號放大檢測。SHERLOCK（specifichigh-sensitivityenzymaticreporterunlocking）是2017年基于RPA技術開發的一種靶向RNA的新核酸診斷平臺，將CRISPR相關酶Cas13a改造成快速、廉價、高靈敏度的診斷工具。SARS-CoV-2的檢測——核酸檢測基于Cas酶檢測技術之SHERLOCK技術

Cas13a在crRNA引導下，偵檢到靶RNA序列并結合目標序列時，會轉入一種酶促“激活”狀態，其無區分的RNA酶活性，會切割RNA報告分子當該報告分子被切割時，會釋放可檢測到的熒光信號.通常，為提高分析靈敏度，樣品中雙鏈DNA（dsDNA）或RNA首先要經RPA或RT-RPA擴增來提高樣品中目標含量水平，并與T7轉錄相結合，將擴增DNA轉化為RNA.經上述處理，SHERLOCK的靈敏度達到渺摩爾級（10-18mol/L），特異性達到單堿基錯配.SARS-CoV-2的檢測——核酸檢測基于Cas酶檢測技術之DETECTR技術

Cas12酶家族在crRNA的引導下，與目標序列結合后，便切換為激活狀態，瘋狂切割體系內其他的單鏈DNA（ssDNA）。Cas12a這一特點可被用于分子診斷領域，Doudna教授借鑒SHERLOCK技術，也引入RPA擴增步驟，創造RPA+Cas12a新的核酸分子檢驗技術，命名為DETECTR.與SHERLOCK相比，DETECTR無需將擴增后的DNA產物轉錄到RNA.SARS-CoV-2的檢測——免疫檢測膠體金免疫檢測原理圖膠體金標記的能與IgM/IgG抗體特異結合的抗原固定在結合墊上，NC膜上檢測線處固定抗人IgM/IgG抗體，質控線處固定特異識別重組抗原His/Fc等標簽抗體.當待測樣品滴加至樣品墊加樣處，樣品向試紙吸水墊處移動，如含有IgM/IgG抗體，抗體與結合墊上的金標抗原結合，形成抗原抗體復合物，隨后被檢測線上的抗人IgM/IgG抗體捕獲，并顯色.若待測樣品中不含IgM/IgG抗