WB測定蔗糖酶的分子量與糖基化程度[摘要]本課題主要研究使用WesternBlot技術測定酵母蔗糖酶（EC.3.2.1.26）的分子量，并用EndoH酶對酵母蔗糖酶進行去糖基化處理，從而分析酵母蔗糖酶的糖基化程度。本課題是對蔗糖酶系列實驗的合理拓展，由于SDS常規電泳和活性電泳的局限性——無法特異性顯示蔗糖酶蛋白、樣品處理不充分——無法準確測得蔗糖酶的分子量。WB技術的特異性克服了這些缺點，顯示出其測量蛋白分子量的優越性。通過進一步分析蔗糖酶的糖基化程度，有利于對酵母蔗糖酶有更加深入的認識；通過完整地實踐WesternBlot技術，學習WesternBlot的原理、用途，鍛煉了學習者的實驗能力。[關鍵詞]WesternBlot;酵母蔗糖酶;分子量;糖基化程度[前言]WesternBlot技術WesternBlot是檢測生物樣品中特定蛋白的常用技術。它利用簡單的原理，根據蛋白質的大小分離蛋白質，并將它們結合到一個支持物上，再用特定的抗體檢測它們。它是一種檢測單個或復合蛋白、監測表達或翻譯后修飾變化的強大技術。近年來，WesternBlot在免疫學、病毒學等領域中都成為了不可或缺的分析手段；通過與其他技術結合，WB可以應用于更詳細的蛋白質組學研究。由于SDS常規電泳和活性電泳的局限性——無法特異性顯示蔗糖酶蛋白、樣品處理不充分——無法準確測得蔗糖酶的分子量，而WB技術對蛋白分子量的特異性測定可以較好地解決這一問題。去糖基化處理酵母蔗糖酶以兩種形式存在于酵母細胞膜的外側和內側,在細胞膜外細胞壁中的稱之為外蔗糖酶(externalyeastinvertase)，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50%~70(質量分數)糖成分的糖蛋白；在細胞膜內側細胞質中的稱之為內蔗糖酶（internalyeastinvertase），含有少量的糖。通過去糖基化處理和測定蛋白質部分的分子量以分析糖基化程度。酵母蔗糖酶酵母蔗糖酶（EC.3.2.1.26），系統命名為β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶,能夠特異性地催化非還原糖中的α-呋喃果糖苷鍵水解,具有相對專一性。具有廣泛的實際應用，如各種抗生素、有機酸、氨基酸、維生素的發酵生產；工業生產中對淀粉、糊精進行酶水解等。目前對蔗糖酶的研究較為透徹，已經得到了蔗糖酶的三維空間結構和蛋白質的氨基酸序列，并且對該酶的不同中蛋白有了較深入的研究，對蔗糖酶的催化機理有了透徹的了解。同時，對于該酶的催化活性和抑制劑激活[實驗目的]1.測量酵母蔗糖酶分子（主要是外酶）的相對分子質量；2.測量酵母蔗糖酶中蛋白質組分的含量，計算酵母蔗糖酶的糖基化程度；3.研究活性電泳的處理是否充分，能否利用活性電泳處理打開外蔗糖酶以測定蛋白質分子量[說明]若活性電泳處理中加入的SDS足夠將蛋白質分子打開（之前的蔗糖酶系列實驗的活性電泳證明SDS可以打開內蔗糖酶，但是不足以打開外蔗糖酶），那么活性電泳結果會和WB的電泳結果相似，說明了活性電泳結果足以鑒別出蔗糖酶，那么之前提出的處理不充分的假設反而是錯誤的。[材料方法]<實驗材料>酵母蔗糖酶樣品（材料來自酵母酶系列實驗）、30.8%凝膠貯液、1.5mol/LTris-HClpH8.8分離膠緩沖液、0.5mol/LTris-HClpH6.8濃縮膠緩沖液、10%SDS試劑、TEMED試劑、10%Ap試劑、0.1mol/L,pH5.6乙酸鈉緩沖液、5×SDS蛋白質上樣緩沖液、2×SDS蛋白質上樣緩沖液、蛋白marker、1U/μl糖苷內切酶H(EndoH)、電泳緩沖液、轉移緩沖液（轉移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要通風）、無水甲醇、TBST試劑、麗春紅染液、5%脫脂奶粉溶液、一抗（兔源的抗蔗糖酶的多抗，1:3000稀釋）二抗（HRP-羊抗兔IgG，1:10000稀釋）<實驗儀器>電泳槽、電泳儀、搖床、4℃冰箱、水浴鍋、高速離心機、移液槍、自動顯影儀器、蛋白轉膜系統[實驗原理]去糖基化方法：參考Sigma去糖基化試劑盒,Sigma-Aldrich的天然蛋白去糖基化試劑盒,可在天然條件下去除糖蛋白上的N連接寡糖；也可查閱文獻找到類似蔗糖酶去糖基化的常用酶——EndoH（內切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶-H）。蔗糖酶的純化方法：I.在酵母細胞研磨破碎后，使用高速離心將細胞碎片沉降，得到上清液。對上清液使用親和層析技術分離得到蔗糖酶樣品。II.對上清液使用離子交換層析得到蛋白樣品，之后使用WesternBlot得到蔗糖酶的樣品條帶，經過轉膜之后得到蔗糖酶樣品。III.采用SDS抽提法從啤酒酵母中提取蔗糖酶，通過正交實驗對SDS濃度、提取時間、PH值、提取溫度等條件進行優化，采用離子強度遞增的方法用Q-瓊脂糖凝膠FF陰離子交換層析方法得到純化的酵母蔗糖酶。WesternBlot測定蛋白質相對分子質量：WesternBlot采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質分子，“探針”是特異性結合待測分子的一抗，“顯色”使用經過特殊標記的二抗。經過PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。實驗中選擇合適的蛋白質marker，顯影后通過作標準蛋白質相對分子量的對數與電泳相對遷移率標準曲線，并根據樣品的相對遷移率，從而求出蛋白質樣品的相對分子量。關于蔗糖酶特異性親和物的選取：I.使用親和層析技術需要可以特異性識別蔗糖酶的分子，需要查找文獻；II.使用WesternBlot技術需要選用特異性的一抗和二抗，本實驗使用的一二抗已在實驗材料中列出。[實驗步驟]一、SDS電泳1.準備電泳裝置：電泳槽、電泳儀。2.制備凝膠：（1）按照下表分別配制分離膠和濃縮膠。SDS—PAGE不連續體系1塊凝膠板所需試劑配制表8%分離膠所需試劑量5%濃縮膠所需試劑量30.8%凝膠貯液(ml)20.351.5mol/LTris-HClpH8.8分離膠緩沖液(ml)1.9/0.5mol/LTris-HClpH6.8濃縮膠緩沖液(ml)/0.62510%SDS(μl)7525TEMED(μl)43蒸餾水(ml)3.451.4810%Ap(μl)7525總體積(ml)7.52.5注意：TEMED和Ap要最后加，并立即混勻，防止凝膠凝固。（2）安裝好凝膠制備裝置。（3）制備分離膠：按上表配制分離膠，混合均勻后將凝膠液加至長、短玻璃板間的縫隙內，再用少許蒸餾水（或水飽和的異丙醇或正丁醇）沿長玻璃板側壁緩慢注入，約5mm高，以封住膠面（加水液封時要很慢，防止膠被沖變型），以促使聚合并使膠面平直，約30min后，凝膠與水封層間出現折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合，傾去水封層的蒸餾水。（4）制備濃縮膠：按上表配制濃縮膠，混勻后將濃縮液加到已聚合的分離膠上方，直至離短玻璃板上約0.1cm處，輕輕將樣品槽模板（梳子）插入濃縮膠內，約10min后凝膠聚合。小心拔去樣品槽的槽板（梳子），將電泳緩沖液倒入上、下貯槽中，電泳緩沖液應沒過短板約0.5cm以上，即可準備加樣。3.樣品的處理與加樣：（1）樣品處理：部分樣品酶切處理成去糖基化的蔗糖酶樣品V：去糖基化酶切反應實驗表樣品V（0.5mlEppendorf離心管）配制劑量反應體系（μl）600.1mol/L,pH5.6乙酸鈉緩沖液（μl）6去離子水（μl）22蔗糖酶（樣品IV原液）（μl）301U/μlEndoH（μl）2混勻，37°C保溫3h-20℃保存備用各樣品溶液分別與“5×SDS蛋白質上樣緩沖液”，按照40（uL）:10（uL）比例混合。在100°C保溫3分鐘，取出后，室溫冷卻，取上清液直接加樣。（2）加樣用微量注射器分別向樣品槽內注入2～10μl樣品I-4、樣品V混合液和適量的蛋白marker，如樣品濃度較低，可適當增加上樣量。具體的加樣順序會在實驗結果處詳細列出。4.電泳：在電泳槽中加入電泳緩沖液，上槽（加樣孔端）接負極、下槽接正極，接電泳儀電源，電流控制在2～3mA/樣品孔，一般樣品進濃縮膠前，電流控制在10～20mA，待樣品進分離膠后，將電流調到20～30mA，保持電流強度不變（恒流），待指示染料遷移至下沿約0.5～1cm處停止電泳。（注：電泳時要及時觀察電泳緩沖液高度是否高于短板，并及時補加緩沖液，否則電泳中可能會出現溴酚藍區帶中心線彎曲的現象）5.剝膠：關閉電源，傾倒干凈電泳緩沖液，拆解凝膠槽和凝膠模，取下凝膠玻璃板，用專用鏟子撬開短玻璃板，將凝膠一角切下做一加樣標記，將凝膠板放在塑料盒內，用無離子水清洗干凈。轉膜實驗使用金斯瑞生物科技股份有限公司自主研發的eBlot?L1快速濕轉儀。eBlotL1快速濕轉儀是一款高效的蛋白快速轉膜系統，該系統基于濕轉的原理，集合了傳統濕轉穩定、均勻和半干轉快速、高效的優勢，同時避免了傳統濕轉耗時費力和半干轉不均勻穩定性差的缺點，能夠在9-15分鐘內快速高效地實現蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉移到PVDF膜或NC膜上的過程；儀器使用嚴格優化的轉膜液和平衡液，能夠確保大小蛋白同時高效轉膜。無論從轉膜的均一性、寬廣的蛋白分子量大小和超低蛋白含量上都實現了良好的轉膜效果。轉膜前試劑準備：請將下述試劑按說明書稀釋后使用（詳見產品說明書）：eBlotL1PVDF膜轉膜濃縮液,5X（Cat.No.L00733C）eBlotL1PVDF膜平衡濃縮液,10X（Cat.No.L00734C）eBlotL1NC膜轉膜濃縮液,5X（Cat.No.L00730C）eBlotL1NC膜平衡濃縮液,10X（Cat.No.L00731C）轉膜基本操作：（1）在WB反應盒中裝入10ml平衡液（2）將膜放入平衡液中注意：a.若使用PVDF膜，請先用甲醇激活，再放入平衡液中平衡1分鐘（3）在托盤中裝入蒸餾水，將電泳好的凝膠小心取出，放入托盤中浸潤1分鐘左右注意：ThermoGEL請切除凸起部分（4）打開轉膜夾，平鋪在實驗桌上注意：轉膜夾有正負極區分，標記有+為正極（5）在標記為+側平鋪1張干海綿墊注意：必須使用干燥的海棉墊，海綿墊放置在塑料框內。海綿為一次性用品，切勿重復使用。（6）將膜從平衡液中取出，平鋪在干海綿墊上（7）將凝膠平鋪于膜上，并用轉印滾子去除氣泡，注意：凝膠方向如下圖所示（8）在凝膠上平鋪1張干海綿墊（9.）合上轉膜夾（10）轉膜夾插入儀器一個通道中,如下圖，裝有凝膠和膜的轉膜夾插入了儀器的B通道注意：轉膜夾是有方向性的，請插入時注意將有Front字樣對向自己（11）按一下B通道對應的STARTB按鍵，儀器開始工作，主界面顯示如下圖，STARTB按鍵閃爍，開始進行倒計時(12)儀器工作結束時，發出蜂鳴(13)儀器工作結束后，主界面顯示如下圖，儀器發出蜂鳴按下STARTB按鍵，按鍵閃爍停止，主界面恢復為轉膜前顯示[注意事項]1.為防止污染膠和海綿，整個轉膜過程請帶手套操作2.不要使用過期的試劑3.部分試劑在低溫時會結晶，如果出現這種情況，請將試劑放置于室溫環境下，待其溶解后再使用4.轉膜夾每次使用完后，使用蒸餾水沖洗，晾干5.儀器正常使用后，如果需要搬動儀器，請確認儀器內無液體后再進行三、免疫反應I.取出PVDF膜用5%脫脂奶粉溶液室溫孵育封閉1h（與膠接觸的那一面始終朝上），使用搖振蕩使封閉更充分。II.將配置好的一抗倒入抗體孵育盒，將封閉完的PVDF膜用TBST清洗一遍后置于一抗中，搖床室溫孵育1-2h。III.將經過一抗孵育的PVDF膜置于TBST中重復清洗3次，每次10min。IV.將配置好的二抗倒入抗體孵育盒中，將PVDF膜置于二抗中室溫緩慢搖動1h，之后將經過二抗孵育的PVDF膜置于TBST中重復清洗3次，每次10min。[實驗結果]WesternBlot顯影結果下圖中的電泳條帶的對應關系如下：12345678910111213常規電泳處理樣本對照活性電泳處理樣本樣品I樣品II樣品III樣品IV樣品V樣品V對照Marker樣品I樣品II樣品III樣品IV樣品V樣品V對照5μl5μl5μl10μl10μl10μl5μl10μl10μl10μl5μl5μl5μl[注意]表中的樣品I-IV來自于蔗糖酶系列實驗，樣品V是樣品IV經過去糖基化處理后得到的新樣品，樣品V對照組代表了樣品IV經過熱處理過程后的樣品，目的是為了消除去糖基化步驟中熱處理對實驗結果的影響。[數據分析]蔗糖酶蛋白質分子量測定蔗糖酶糖基化程度測定-量出加樣端距溴酚藍區帶中心間的距離（cm）以及各蛋白質樣品區帶中心與加樣端凝膠頂端的距離（cm），按下式計算相對遷移率Rf：相對遷移率Rf=蛋白質樣品距加樣端的距離/溴酚藍區帶中心距加樣端的距離-以標準蛋白質的相對遷移率為橫坐標，標準蛋白質分子質量的對數值lgMr為縱坐標作圖，可得到一條標準直線。根據未知蛋白質樣品的相對遷移率可直接在標準曲線上查出其相對分子質量。蛋白質分子量標準曲線繪制記錄表Rf0.0550.1270.2180.3090.500Mr2501501007550lgMr2.402.182.001.881.70-根據蛋白質Marker的條帶作出蛋白質分子量的標準曲線計算得糖基化的蔗糖酶條帶的分子量為109.1-159.3KD，去糖基化的蔗糖酶條帶分子量為61.8-74.7KD，顯然，此時的酵母蔗糖酶外酶是以亞基單體的形式存在的，糖基化程度約為49.1%，因此，酵母蔗糖酶外酶是高度糖基化的。[說明]1.糖基化程度計算中，分子量選用了每個條帶的分子量平均值。2.對比參考值：蔗糖酶的糖基化程度約為50%左右，得出實驗結果科學可靠。3.電泳條帶分析（1）常規電泳處理樣本的樣品V的電泳條帶出現了明顯的變化，對比樣品IV和對照組的條帶，說明了在去糖基化處理后該條帶所代表的蛋白分子量發生了較大的改變。（2）活性電泳處理組的樣品條帶不明顯，無法觀察到有效的顯色條帶的存在，原因詳見分析討論部分。（3）仔細觀察電泳條帶，發現IV樣品的條帶顏色濃，說明樣品中的蔗糖酶濃度高；樣品IV出現兩個條帶，說明其中存在亞基和二聚體兩種形式。[分析討論]解釋為什么可以測量蔗糖酶的蛋白分子量參考蔗糖酶系列實驗的電泳條帶（如下圖），我們發現常規電泳處理無法從眾多蛋白質條帶中判斷出對應于酵母蔗糖酶的條帶；活性電泳染色存在處理不充分，酶分子保持空間構象的情況。——兩種電泳方式都無法測定蔗糖酶的蛋白分子量。在使用WB技術之后，電泳條帶與上圖的結果發生了差別：-發現常規電泳處理樣本的樣品V的電泳條帶出現了明顯的變化，對比樣品IV和對照組的條帶，說明了在去糖基化處理后該條帶所代表的蛋白分子量發生了較大的改變。-由于WB實驗中使用的特異性的抗體識別出了具有特異性的蛋白分子，結合去糖基化的處理結果，可以信任實驗結果條帶鑒定得到了酵母蔗糖酶的條帶。分子量測定的范圍選取WB測得蔗糖酶分子量為109.1-159.3KD，去糖基化后蔗糖酶分子量為61.8-74.7KD。因此，蔗糖酶存在糖基化現象，且不同的分子糖基化程度有所不同，不同酶分子的去糖基化程度不同，因此最后的分子量結果為一范圍。分析活性電泳處理的樣本條帶在染色后顏色很淡的原因實驗結果顯示，活性電泳處理組的樣品條帶不明顯，無法觀察到有效的顯色條帶的存在。最開始分析的原因是活性組上樣量不足導致的，在之前的活性電泳中，最后以蔗糖酶的催化生成還原糖來反應顯色，該顯色方法較靈敏，但是WB顯色反應沒有前者靈敏，蛋白量需要盡可能多。但是，經過計算后發現，常規電泳的上樣量與活性電泳的上樣量是一樣的（1、2、3號樣品液），都等效為4ul，但最后卻只有常規電泳組條帶清晰。結合以上信息，產生該現象的可能原因如下：（1）操作誤差導致的上樣量不足：由于常規電泳處理是取40ul樣品液混合，而活性電泳處理則是取8ul樣品液混合，因為活性電泳組取的樣品液體積較小，可能造成的操作誤差也就增大，因此可能使最后上樣的蛋白量不足。（2）樣品活性處理本身與抗體的矛盾：活性處理的樣品組，相比于常規處理的樣品組，少了加入巰基乙醇和100℃處理的步驟，也就是說，活性組的蔗糖酶蛋白的空間結構極有可能與常規組不同。而一抗類的抗體一般都是與蛋白表面的構象表位相結合，構象表位是一個三維的結合位點，空間結構的不同，極有可能導致構象表位的變化，即抗體結合能力存在差異，甚至可能出現結合不上的情況。在這種情況下，自然也就無法結合二抗進行顯色反應了。4.探討膠濃度大小對電泳結果的影響凝膠濃度不同，蛋白質遷移速度不同。凝膠濃度越大，分子篩效應越明顯，相同分子量大小的蛋白質遷移速度越慢。并且marker在不同濃度的凝膠中展開情況也不同，這正是每塊膠對應的標準遷移曲線都不同的原因。5.實驗的改進建議1.可以增加考馬斯亮藍染色電泳測量蛋白量。采用相同的點樣方式，檢測活性電泳組的蛋白含量，判斷活性電泳組條帶顏色暗淡的原因是否是因為蛋白量不足，以進一步驗證我們的推測。2.驗證樣品處理方式對抗體結合的影響：將活性組進行與常規組相同的樣品處理方式，但是仍用活性組的比例與量進行上樣操作。[結語]本課題中完整地應用了WesternBlot技術，幫助學習者加深了對WesternBlot技術原理、用途的理解，并掌握了各個步驟的操作方法，鍛煉了學習者的實驗技能。由于蛋白質中普遍存在的糖基化作用，為了確認蔗糖酶中糖基化現象的程度，需要先對蔗糖酶進行去糖基化處理，之后再進行凝膠電泳。將去糖基化條帶與保留糖基化的電泳條帶進行對比，我們能夠大致確定蔗糖酶糖基化的程度。[參考文獻][1].Gwozdz,Tomasz,andKarelDorey.“Chapter6-WesternBlot.”InBasicScienceMethodsforClinicalResearchers,editedbyMortezaJalali,FrancescaY.L.Saldanha,andMehdiJalali,99–117.Boston:AcademicPress,2017.[2].Weickert,CynthiaShannon,DeboraA.Rothmond,andTertiaD.Purves-Tyson.“Chapter16-ConsiderationsforOptimalUseofPostmortemHumanBrainsforMolecularPsychiatry:LessonsfromSchizophrenia.”InHandbookofClinicalNeurology,editedbyIngeborgHuitingaandMareeJ.Webster,150:221–35.BrainBanking.Elsevier,2018.[3].Slieman,TonyA.,andJoergLeheste.“Chapter1-IntroductiontoImmunologicalTechniquesintheClinicalLaboratory.”InMethodsinMicrobiology,editedbyCharlesS.PaviaandVolkerGurtler,47:1–16.ImmunologicalMethodsinMicrobiology.AcademicPress,2020.[4].Coombs,R.W.“14-HumanImmunodeficiencyVirusInfectionandtheAcquiredImmunodeficiencySyndrome:ViralPathogenesis,LaboratoryDiagnosisandMonitoring.”InAtlasofSexuallyTransmittedDiseasesandAIDS(FourthEdition),editedbyStephenA.Morse,RonaldC.Ballard,KingK.Holmes,andAdeleA.Moreland,240–55.London:W.B.