酶制劑發(fā)酵生產(chǎn)酶合成方式：

1958Crick中心法則DNAmRNA酶轉(zhuǎn)錄翻譯RNA聚合酶第一節(jié)酶生物合成調(diào)控機(jī)制第2頁,共66頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)錄是以DNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在RNA聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）的作用下，生成RNA的過程。翻譯：以mRNA為模板，以氨基酸為底物，在核糖體上通過各種tRNA，酶和輔助因子的作用，合成多肽的過程。第3頁,共66頁，2024年2月25日，星期天一、誘導(dǎo)作用（Induction）

1、概念：某些酶在通常情況下生物體不能合成或合成很少，但加入“誘導(dǎo)物”后，就能大量合成，這種現(xiàn)象稱為誘導(dǎo)。第4頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

LaczLacyLaca

20世紀(jì)60年代初法國巴斯德研究所F.JacobandJ.Monod“乳糖操縱子假說”乳糖酶第5頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（1）決定酶合成有兩個(gè)不同的基因群。2、乳糖操縱子假說第6頁,共66頁，2024年2月25日，星期天決定酶合成的兩個(gè)基因群操縱子（operon）調(diào)節(jié)基因R(Regulatorygene)啟動(dòng)基因P

操縱基因O結(jié)構(gòu)基因SP:PromotorO:OperatorS:Structure第7頁,共66頁，2024年2月25日，星期天SPLaczLacyLacaOR調(diào)節(jié)基因操縱基因啟動(dòng)基因結(jié)構(gòu)基因Operon操縱子DNA第8頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

①調(diào)節(jié)基因（Regulatorygene）：

可產(chǎn)生阻遏蛋白，阻遏蛋白能與操縱基因結(jié)合。R阻遏蛋白SPLaczLacyLacaORDNA第9頁,共66頁，2024年2月25日，星期天②啟動(dòng)基因（Promotor）：是RNA聚合酶的結(jié)合部位和轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)。RNA聚合酶SPLaczLacyLacaORDNA第10頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

③結(jié)構(gòu)基因（Structure）：

是DNA模板，在RNA聚合酶作用下，根據(jù)其堿基序列轉(zhuǎn)錄出mRNA。SPLaczLacyLacaORDNAmRNAzmRNAymRNAa轉(zhuǎn)錄翻譯酶RNA聚合酶第11頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

④操縱基因（Operator）：位于啟動(dòng)基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿基序列，是阻遏蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。在操縱子中起“開關(guān)”作用。SPLaczLacyLacaORDNA第12頁,共66頁，2024年2月25日，星期天調(diào)節(jié)基因操縱基因SPLaczLacyLaca

阻遏蛋白（有活性）轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)基因ORA、無誘導(dǎo)物（乳糖）存在

結(jié)構(gòu)基因RNA聚合酶翻譯酶mRNA（2）乳糖酶合成調(diào)控方式第13頁,共66頁，2024年2月25日，星期天mRNAZmRNAYmRNAA

阻遏蛋白(無活性)乳糖

阻遏蛋白(有活性)調(diào)節(jié)基因操縱基因SPLaczLacyLaca啟動(dòng)基因R結(jié)構(gòu)基因RNA聚合酶B、有誘導(dǎo)物（乳糖）存在O轉(zhuǎn)錄翻譯酶第14頁,共66頁，2024年2月25日，星期天Question：

以上理論對(duì)指導(dǎo)酶制劑生產(chǎn)有何實(shí)際意義？第15頁,共66頁，2024年2月25日，星期天3、乳糖操縱子假說對(duì)指導(dǎo)

酶制劑生產(chǎn)的意義在酶合成時(shí)添加誘導(dǎo)物底物關(guān)鍵：選擇合適的誘導(dǎo)物和其濃度底物的結(jié)構(gòu)類似物實(shí)驗(yàn)確定第16頁,共66頁，2024年2月25日，星期天生產(chǎn)實(shí)例：酵母生產(chǎn)β-半乳糖苷酶以葡萄糖作唯一碳源培養(yǎng)酵母菌以乳糖作為唯一碳源培養(yǎng)酵母菌幾分鐘后β-半乳糖苷酶乳糖最佳誘導(dǎo)濃度：120g/L第17頁,共66頁，2024年2月25日，星期天意義2：利用現(xiàn)代誘變育種技術(shù)使基因發(fā)生突變①

使調(diào)節(jié)基因R發(fā)生突變②使操縱基因O發(fā)生突變第18頁,共66頁，2024年2月25日，星期天mRNAzmRNAymRNAa轉(zhuǎn)錄翻譯酶RNA聚合酶R①

調(diào)節(jié)基因R突變

利用現(xiàn)代育種技術(shù)，使調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，致使其不能產(chǎn)生阻遏蛋白，使誘導(dǎo)酶變成組成酶。

阻遏蛋白PLaczLacyLacaOS第19頁,共66頁，2024年2月25日，星期天mRNAZmRNAYmRNAa轉(zhuǎn)錄翻譯酶RNA聚合酶②

操縱基因O突變

利用現(xiàn)代育種技術(shù)，使操縱基因發(fā)生突變，使其不與阻遏蛋白作用，使誘導(dǎo)酶變成組成酶。

阻遏蛋白(有活性)PLaczLacyLacaRSO第20頁,共66頁，2024年2月25日，星期天二、酶合成的反饋?zhàn)瓒鬜epression反饋?zhàn)瓒羰侵该缸饔玫慕K產(chǎn)物對(duì)酶合成產(chǎn)生阻遏作用第21頁,共66頁，2024年2月25日，星期天阻遏蛋白操縱基因結(jié)構(gòu)基因調(diào)節(jié)基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，所以結(jié)構(gòu)基因表達(dá)。酶代謝產(chǎn)物一旦大量積累阻遏蛋白被產(chǎn)物激活，結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)。第22頁,共66頁，2024年2月25日，星期天這一理論在實(shí)踐意義：(1)設(shè)法從培養(yǎng)基中除去其終產(chǎn)物，以消除反饋?zhàn)瓒簟５?3頁,共66頁，2024年2月25日，星期天三、酶合成的分解代謝阻遏作用又稱葡萄糖效應(yīng)是指微生物在其培養(yǎng)基中由于葡萄糖的存在雖然能迅速生長(zhǎng)，但明顯地抑制某些分解代謝誘導(dǎo)酶的形成。第24頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

將E.coli培養(yǎng)在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上，出現(xiàn)“二峰生長(zhǎng)現(xiàn)象”即使有乳糖存在，也要等葡萄糖耗盡之后誘導(dǎo)形成

-半乳糖苷酶葡萄糖分解產(chǎn)物對(duì)-半乳糖苷酶形成阻遏第25頁,共66頁，2024年2月25日，星期天葡萄糖過量存在——放出的能量部分儲(chǔ)存在ATP中ADP+AMP——ATPcAMP+H2OAMPcAMP-CRP復(fù)合物的濃度降低啟動(dòng)基因(P)上沒有cAMP-CRP復(fù)合物結(jié)合RNA聚合酶無法結(jié)合到啟動(dòng)基因酶的生物合成無法進(jìn)行。磷酸二酯酶第26頁,共66頁，2024年2月25日，星期天酶微生物引起阻遏作用物質(zhì)α-淀粉酶嗜熱脂肪芽孢桿菌果糖纖維素酶綠色木霉葡萄糖、甘油、纖維二糖蛋白酶巨大芽孢桿菌葡萄糖淀粉葡萄糖苷酶二孢內(nèi)孢酶麥芽糖、葡萄糖、甘油分解代謝阻遏實(shí)例第27頁,共66頁，2024年2月25日，星期天用甘油代替果糖培養(yǎng)嗜熱脂肪芽孢桿菌，α-淀粉酶產(chǎn)量可提高25倍。采用甘露糖作為熒光假單胞桿菌培養(yǎng)基時(shí)，纖維素酶的產(chǎn)量比用半乳糖作為培養(yǎng)基時(shí)要高1500倍以上。如果微生物需要某些代謝阻遏物作為碳源，在工業(yè)生產(chǎn)中則可采用限量流加碳源的辦法，便可減少或避免這種阻遏作用。第28頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)產(chǎn)酶微生物的篩選

動(dòng)物酶植物微生物微生物易于大量培養(yǎng)，倍增時(shí)間短；DNA技術(shù)使微生物生產(chǎn)特殊作用的酶，并大大提高產(chǎn)量；因此，微生物可以說是酶商業(yè)化生產(chǎn)的最佳來源。第29頁,共66頁，2024年2月25日，星期天1、產(chǎn)酶菌的分布規(guī)律為獲得能夠降解某種物質(zhì)的產(chǎn)酶菌株，一般可以從該物質(zhì)比較豐富的地方尋找。

Exp.豆科植物的根系中，往往存在根瘤菌；油田和煉油廠周圍土層中常見分解石油的微生物；處理降解合成物質(zhì)的產(chǎn)酶菌則往往能在污水處理處獲得；第30頁,共66頁，2024年2月25日，星期天生產(chǎn)性能鑒定主要通過初篩和復(fù)篩確定。初篩是從已分離出來的菌種中挑出能產(chǎn)生目標(biāo)酶的菌株，要求檢出方法快捷、簡(jiǎn)便初篩多選用平板培養(yǎng)透明圈法2、菌種生產(chǎn)性能鑒定第31頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第32頁,共66頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞外的水解酶1、溶解度——不溶性底物如淀粉、纖維素、酪素、細(xì)胞壁等培養(yǎng)基中生長(zhǎng)——透明圈大小2、酸堿度——酸堿指示劑——變色圈大小和顏色3、顏色——合成特定底物與酶反應(yīng)變色——變色深淺第33頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共66頁，2024年2月25日，星期天復(fù)篩是在初篩的基礎(chǔ)上篩選產(chǎn)酶量高，性能更符合要求的菌株，要求測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠。復(fù)篩多采用搖瓶培養(yǎng)的方法。將初篩出來的菌種移入三角瓶振蕩培養(yǎng)，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析檢定，找出產(chǎn)酶量最高，性能符合要求的菌株。第35頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)酶的液體深層發(fā)酵法液體深層發(fā)酵是現(xiàn)代普遍采用的方法，主要設(shè)備發(fā)酵罐是一個(gè)具有攪拌漿和通氣系統(tǒng)的密閉容器。國內(nèi)多采用10-50t，國外多用100t以上。第36頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第37頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第39頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第42頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第43頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第44頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第45頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第46頁,共66頁，2024年2月25日，星期天液體發(fā)酵流程圖實(shí)驗(yàn)室種子制備階段（一級(jí)種子培養(yǎng)）生產(chǎn)車間種子制備階段（二級(jí)種子培養(yǎng)、三級(jí)種子培養(yǎng)）二級(jí)發(fā)酵三級(jí)發(fā)酵沙土孢子冷凍干燥孢子斜面孢子搖瓶液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)一級(jí)種子罐二級(jí)種子罐發(fā)酵罐第47頁,共66頁，2024年2月25日，星期天空氣空氣凈化處理保藏菌種斜面活化擴(kuò)大培養(yǎng)種子罐主發(fā)酵碳源、氮源、無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)滅菌

酶分離純化成品（液體或顆粒）控制t、pH、DO、泡沫、補(bǔ)料等第48頁,共66頁，2024年2月25日，星期天發(fā)酵罐發(fā)酵全過程動(dòng)畫.exe第49頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（1）溫度的調(diào)節(jié)控制

Exp.不同的細(xì)胞有各自不同的最適生長(zhǎng)溫度。如：枯草桿菌最適生長(zhǎng)溫度34～37℃，黑曲霉28～32℃，植物細(xì)胞25℃左右。第50頁,共66頁，2024年2月25日，星期天溫度控制的方法一般采用熱水升溫，冷水降溫，故此在發(fā)酵罐中，均設(shè)計(jì)有足夠傳熱面積的熱交換裝置，如排管、蛇管、夾套、噴淋管等。第51頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（2）pH的變化與控制培養(yǎng)基的pH值與細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖以及發(fā)酵產(chǎn)酶都有密切關(guān)系。細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH值通常接近于該酶反應(yīng)的最適pH值。例如：發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶的最適pH值為堿性(pH8.5～9.0)；而酸性(pH4.0～6.0)條件有利于酸性蛋白酶的產(chǎn)生。

第52頁,共66頁，2024年2月25日，星期天有些細(xì)胞可以同時(shí)產(chǎn)生多種酶，通過控制培養(yǎng)基的pH值，往往可以改變各種酶之間的產(chǎn)量比例。

Exp.黑曲霉可既生產(chǎn)α-淀粉酶，又可生產(chǎn)糖化酶。

pH值中性——α-淀粉酶增加糖化酶減少；

pH值酸性——糖化酶增加α-淀粉酶減少。第53頁,共66頁，2024年2月25日，星期天pH的調(diào)節(jié)可以通過改變培養(yǎng)基的組分或比例來實(shí)現(xiàn)，必要時(shí)可以使用緩沖溶液，或流加適宜的酸、堿溶液，以調(diào)控培養(yǎng)基的pH變化。第54頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（3）溶解氧的調(diào)節(jié)控制大多數(shù)的產(chǎn)酶菌是好氣菌，調(diào)節(jié)通氣量對(duì)產(chǎn)酶意義重大。一般細(xì)胞只能利用溶解在培養(yǎng)基中的氧氣——溶解氧。液體發(fā)酵較小的通氣量有助于霉菌的生長(zhǎng)，較大的通氣量有助于產(chǎn)酶。第55頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（4）泡沫形成與控制泡沫是如何形成的？通氣,攪拌；發(fā)酵液中含有蛋白質(zhì)、糖和脂肪等.第56頁,共66頁，2024年2月25日，星期天泡沫的危害有哪些大量逃液增加污菌機(jī)會(huì)使部分菌體黏附在罐蓋或罐壁上失去作用泡沫嚴(yán)重時(shí)還會(huì)影響通氣攪拌的正常進(jìn)行，防礙菌的呼吸，導(dǎo)致產(chǎn)量下降

第57頁,共66頁，2024年2月25日，星期天機(jī)械消泡機(jī)械消泡是一種物理作用，它是靠機(jī)械強(qiáng)烈振動(dòng)和壓力的變化，促使氣泡破裂，或借助于機(jī)械力將排出氣體中的液體加以分離回收，從而達(dá)到消泡的作用。第58頁,共66頁，2024年2月25日，星期天罐內(nèi)消泡——耙式消泡槳第59頁,共66頁，2024年2月25日，星期天化學(xué)消泡——消泡劑天然油脂玉米油、米糠油、豆油、棉子油、菜子油和魚油、豬油等。已有逐漸被合成消沫劑取代的趨勢(shì)。高碳醇和酯類十八醇第60頁,共66頁，2024年2月25日，星期天聚醚類聚氧丙稀甘油和聚乙烯氧丙稀甘油（泡敵）硅酮類聚二甲基硅氧烷與其衍生物。第61頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（6）空氣滅菌介質(zhì)過濾除菌讓含菌空氣通過過濾介質(zhì)以阻截空氣中所含微生物，而去的無菌空氣的方法，目前工業(yè)除菌幾乎均采用該方法。常用的過