ICS11.220

CCSB41

DB32

江蘇省地方標準

DB32/T4000—2021

牛結核病診斷技術（γ-干擾素體外ELISA

法）

DiagnosticTechniqueforBovineTuberculosisbyInterferon-gammaELISAAssay

2021-02-03發布2021-03-03實施

江蘇省市場監督管理局發布

DB32/T4000-2021

I

DB32/T4000-2021

牛結核病診斷技術（γ-干擾素體外ELISA法）

1范圍

本文件規定了牛結核病診斷技術（γ-干擾素體外ELISA法）的試劑及儀器、檢測方法、質量控制和

結果判定等。

本文件適用于牛結核病診斷。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T18645動物結核病診斷技術

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB/T32945牛結核病診斷體外檢測γ干擾素法

3術語和定義

本文件沒有特別需要界定的術語和定義。

4原理

感染牛分枝桿菌的牛，其T淋巴細胞已被牛分枝桿菌致敏并產生免疫記憶。當體外再次遇到牛分枝

桿菌特異性抗原（結核菌素）刺激時，牛外周血中淋巴細胞被激活并大量釋放γ-干擾素，而未被感染的

牛則不會分泌或低水平分泌γ-干擾素。通過雙單克隆抗體夾心酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測特異性

γ-干擾素濃度水平，即可診斷牛結核病。

5試劑及儀器

5.1試劑

外周抗凝血培養所需材料參見附錄A。夾心ELISA所需試劑和材料參見附錄B。

5.2儀器

檢測所需儀器參見附錄C。

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DB32/T4000-2021

6檢測方法

6.1試劑配制

檢測所需試劑的配制見附錄D。

6.2樣品采集與處理

6.2.1無菌采集牛尾靜脈血3mL～4mL，加入至含肝素鋰或肝素鈉的抗凝血真空管中，輕輕顛倒2次～

3次使血液和抗凝劑混合均勻。室溫（22±5℃）運送至實驗室并在采血后24h內進行培養。

6.2.2分裝前輕輕顛倒抗凝血真空管，充分混勻血液樣品。將抗凝血無菌加入至48孔細胞培養板，每

頭牛抗凝血分裝3孔，1.0mL/孔（可參考表1）。

6.2.3在每頭牛的3孔抗凝血樣品中，分別無菌加入67μLPBS、67μL禽型PPD溶液和67μL牛

型PPD溶液（可參考表1），用微量振蕩器低速充分振蕩，使刺激抗原與抗凝血完全混合。

6.2.4蓋上細胞培養板蓋，避免液體揮發。將含有抗凝血和刺激抗原的48孔細胞培養板在37℃濕溫

培養箱中孵育16h～24h。

6.2.5使用移液器小心吸取上層血漿200μL～300μL，轉至1.5mL離心管中。吸取血漿時應盡量

避免吸入紅細胞。

表1.抗凝血樣品和刺激原加入到48孔細胞培養板（豎排放置）

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物1動物2

A1A2A3A4A5A6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物3動物4

B1B2B3B4B5B6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物5動物6

C1C2C3C4C5C6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物7動物8

D1D2D3D4D5D6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物9動物10

E1E2E3E4E5E6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物11動物12

F1F2F3F4F5F6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物13動物14

G1G2G3G4G5G6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物15動物16

H1H2H3H4H5H6

6.3酶聯免疫吸附試驗

6.3.1溶解陽性、陰性對照凍干粉，配制1×PBST洗滌液，按“操作注意事項”平衡其他試劑。

6.3.2取商品化已包被有γ-干擾素單克隆抗體的酶標板（根據樣品多少，可拆開分次使用），先加入50μL

樣品稀釋液至各孔中，再加入50μL血漿樣品及陽性對照、陰性對照至各孔中，輕輕振勻孔中樣品，貼

上封板膜，37℃孵育2h。

6.3.3棄去孔內液體。使用1×PBST洗滌液洗板5次，300μL/孔。每次靜置1min后棄洗滌液，洗滌

完畢后在吸水紙上拍干。

2

DB32/T4000-2021

6.3.4用酶標抗體稀釋液按1：100稀釋酶標抗體（現配現用）。在每孔中加入100μL新鮮配制的酶標

抗體，貼上封板膜，37℃孵育2h。

6.3.5使用1×PBST洗滌液洗板5次，300μL/孔。每次靜置1min后棄洗滌液，洗滌完畢后在吸水紙

上拍干。

6.3.6每孔加入100μL底物顯色液，貼上封板膜，37℃避光顯色10min。

6.3.7按照加入底物顯色液的順序和時間間隔每孔加入50μL終止液，15min內在酶標儀上測定

OD450nm。

6.4操作注意事項

6.4.1由于本試驗需要活的淋巴細胞，因此需要使細胞損傷降至最低。任何情況下不應將抗凝血貯存于

冰箱中。

6.4.2刺激后的血漿樣品如不直接進行酶聯免疫吸附試驗，血漿可在2℃～8℃貯存7天，在-20℃可貯

存6個月。貯存前，每個貯存管必須用合適的蓋子密封。應在樣品架上標記日期、操作者的首字母、管

內容物、動物編號和牛群細節等相關信息。檢測前，樣品應恢復至室溫并充分混勻。

6.4.3除酶標抗體外，試劑盒使用前各組份應平衡至室溫，使用后即放回2℃～8℃。

6.4.4不同批號試劑盒的試劑組分不得混用，使用過程中各試劑組份應避免交叉污染。

6.4.5底物顯色液避免暴露于強光和接觸氧化劑。

6.4.6終止液中含有H2SO4，使用時注意不要接觸到身體和衣物。

6.4.7抗體包被酶標板拆封后應避免受潮或沾水（每次將剩余的抗體包被酶標板用封口袋扎緊后盡快置

于2℃~8℃）。

6.4.8陽性對照和陰性對照凍干粉用滅菌純水稀釋并使用后，盡快置于2℃～8℃保存。

6.4.9待檢血漿樣品數量較多時，可先使用樣品稀釋液稀釋完所有待檢血漿，再將稀釋好的血漿轉移到

反應板，保證反應時間一致。

6.4.10嚴格按照操作說明書要求進行，操作過程中移液、定時和洗滌等過程應精確。

7質量控制

在判定結果前必須檢查對照樣品的結果，確定陰性對照和陽性對照的OD450nm值在規定范圍之內：

陰性對照OD450nm值范圍為0.0~0.15。

陽性對照OD450nm值范圍為0.7~3.0。

如果有一條標準不符合，試驗是無效的，應重新進行檢測。

8結果判定

8.1計算每個樣品PBS刺激組、禽型PPD刺激組和牛型PPD刺激組的OD450nm值。如果做重復孔，應

計算每頭牛所有樣品PBS刺激組、禽型PPD刺激組和牛型PPD刺激組的平均OD450nm值。

8.2結果判定標準

陽性判定標準：牛型PPD刺激組OD450nm值-PBS刺激組OD450nm值≥0.1且牛型PPD刺激組OD450nm

值-禽型PPD刺激組OD450nm值≥0.1。

陰性判定標準：牛型PPD刺激組OD450nm值-PBS刺激組OD450nm值＜0.1，或牛型PPD刺激組OD450nm

值-PBS刺激組OD450nm值≥0.1且牛型PPD刺激組OD450nm值-禽型PPD刺激組OD450nm值＜0.1。

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9安全措施

按照GB/T18645和GB19489執行。

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附錄A

（資料性）

外周抗凝血培養所需材料

A.1肝素鋰或肝素鈉真空抗凝管；

A.25mL或10mL動物采血器；

A.3無菌48孔細胞培養板；

A.4牛型PPD溶液（2.5mL/瓶）；

A.5禽型PPD溶液（2.5mL/瓶）；

A.6100μL、1000μL槍頭；

A.7用于貯存血漿的1.5mL離心管；

A.896孔板架。

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附錄B

（資料性）

夾心ELISA所需試劑和材料

B.1酶標板（包被牛γ-干擾素單克隆抗體，含0.1%ProClin300）；

B.2牛γ-干擾素陽性對照凍干粉（含0.1%ProClin300）；

B.3牛γ-干擾素陰性對照凍干粉（含0.1%ProClin300）；

B.4樣品稀釋液（血漿稀釋緩沖液，含0.1%ProClin300）；

B.5PBST洗滌液（20×）（含0.1%ProClin300）；

B.6酶標抗體（含0.1%ProClin300）；

B.7酶標抗體稀釋液（含0.01%的硫柳汞）；

B.8底物顯色液（TMB（3,3',5,5'-四甲基聯苯胺）溶液）；

B.9終止液（0.5MH2SO4）；

B.10滅菌純水（用于溶解陽性對照、陰性對照凍干粉）；

B.11蒸餾水（用于稀釋洗液）；

B.12酶聯免疫吸附試驗所需的試劑、反應槽、封板膜和槍頭。

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附錄C

（資料性）

檢測所需儀器

C.137℃濕溫培養箱；

C.2精密可調移液器（100μL、1000μL）；

C.31mL、5mL、10mL的移液器；

C.4100mL、1L、2L的量筒；

C.512道移液器（50μL～300μL）；

C.6微量振蕩器（可選）；

C.7洗板機（可選）；

C.837℃水浴鍋；

C.9酶標儀（含450nm濾光片）。

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DB32/T4000-2021

附錄D

（規范性）

檢測所用試劑的配制

D.1刺激抗原

牛型PPD溶液（10000IU/mL）和禽型PPD