ICS07.080

A21

中華人民共和國國家標準

GB/TXXXXX—201X

工業微生物菌株生長表型評價微液滴濁

度法

Evaluationofthegrowthphenotypeoftheindustrymicroorganism

strain——Microdropletturbidity

（征求意見稿）

201X-XX-XX發布201X-XX-XX實施

中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局發布

中國國家標準1化管理委員會

GB/T××××—201×

GB/T××××—201×

工業微生物菌株生長表型評價微液滴濁度法

1范圍

本標準規定了工業微生物菌株質量評價微液滴濁度法的原理、試劑材料、儀器設備、操作步驟、結

果分析。

本標準適用于工業微生物菌株生長表型評價。

2規范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682-2008分析實驗室用水規格和試驗方法

3原理

通過將微生物細胞限域在液滴中，利用微球中的面積進行生長速率計算和評價。

4試劑材料

除特殊說明外，本標準所用試劑均為分析純，水均為符合GB/T6682中規定的二級水。

4.1基礎培養基

按照GB/T15818中方法配制。或選用商品化的預制干燥培養基，嚴格按照商品說明書加水配制。

5儀器設備

5.1單細胞拉曼光譜測試系統：532nm激光，輸出強度不低于100mW，800mm長焦，600刻線光柵，100

倍物鏡，光譜分辨率不低于2cm-1，波數范圍需包含“指紋區”，即390cm-1～1800cm-1。

5.2離心機，500～4000rpm/min。

5.3顯微鏡：100～400倍，帶CCD成像模塊

5.4無菌EP管：容量1.5毫升。

5.5微量移液器及槍頭：1毫升，200微升，10微升。

5.6聚四氟乙烯管：內徑0.5mm，外徑1.59mm。

1

GB/T××××—201×

6操作步驟

6.1LB培養基的制備

配制每升培養基,應該在950mL去離子水中加入:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，搖動容

器直至溶質溶解。用5mol/LNaOH調pH至7.0。用去離子水定容至1L。在121℃蒸汽高壓滅菌20min。

6.2微生物菌株菌液制備

從瓊脂平板挑取微生物菌株單克隆于5mLLB培養基中，在37℃、220rpm搖床中培養過夜。取1mL

的培養液3000rpm離心2min去除上清后加入PBS溶液，重復清洗3次。

6.3微生物菌液濃度選取

用LB培養基稀釋含有PBS的菌液3000倍，得到細胞懸液濃度約為6×105CFU/mL。

6.3瓊脂糖溶液制備

用分析天平稱取0.02g超低熔點瓊脂糖A5030，并向其中加入1mL已滅菌的LB培養基，加熱溶解，

配制成2%(g/v)的溶液。趁熱用0.22μm的無菌濾膜過濾，備用。

6.4微流控芯片制作

用AutoCAD設計微流控芯片通道圖形，其中分散相的寬度為40μm，連續相的寬度為60μm。制備

出分辨率為24500DPI的芯片結構掩膜。

制作芯片結構硅片，包括勻膠、前烘、曝光、后烘、顯影步驟。

PDMS微流控芯片制作，同時制作出兩個芯片，一個用于待鑒定菌株，另一個用于工業標準菌株。

6.5單細胞液滴的產生

分別將兩種菌株稀釋到6×105CFU/mL細胞與超低熔點瓊脂糖溶液混勻。

取一塊芯片，將兩個100μL的槍頭分別插在芯片的油相入口和水相入口，連續相為氟碳油，分散

相為低熔點瓊脂糖菌液，然后將聚四氟乙烯管連接出口與注射器。

將芯片放在溫控系統，范圍在30℃到37℃內，將注射器的活塞用夾子固定在注射器2mL的位置，

開始發生液滴。

取另一塊芯片重復上述步驟。

6.6單細胞液滴的培養與生長表型評價

液滴發生結束后，移除芯片上的槍頭和管子后，將兩芯片放入4℃冰箱冷凝20min后再置入盛有水

的培養皿中入37℃恒溫箱進行培養6h。

培養后的瓊脂糖微球使用倒置顯微鏡在10X物鏡成像進行成像，獲取的圖片保存為bmp格式并用軟件

進行計數。

根據兩塊芯片內微球中的面積進行生長速率的計算。獲取的數據經過對數轉換后進行統計學分析。

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GB/T××××—201×

6.7工業菌株微生物的宏觀培養驗證

將目標液滴通過PEEK軟管收集到EP管中，加入破乳試劑對液滴進行破乳。析出底層菌液加入LB培養

基中放入搖床培養12h,稀釋到適宜濃度后進行涂布培養。

7結果分析

篩選菌株與參考菌株的生長速率差異按式（1）計算：

………………….（1）

式中：

D——標準