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中華人民共和國國家標準

GB/TXXXXX—XXXX

水稻中轉基因成分測定－膜芯片法

DetectionofGeneticallyModifiedComponentsinRice

Membrane-basedGene-chipMethod

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征求意見稿

XXXX-XX-XX發布XXXX-XX-XX實施

GB/TXXXXX—XXXX

水稻中轉基因成分測定－膜芯片法

1范圍

本標準規定了水稻及水稻加工產品中轉基因成分的檢測方法。

本標準適用于轉BAR基因耐除草劑水稻和轉Bt基因（Cry1Ab/Cry1Ac）抗蟲水稻中轉基因成分的定性

檢測，也適用于水稻加工產品中轉基因成分的定性檢測，本標準規定的轉基因成分最低檢測限量是0.5%。

2規范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T19495.1轉基因產品檢測通用要求和定義

GB/T19495.2轉基因產品檢測實驗室技術要求

GB/T19495.3轉基因產品檢測核酸提取純化方法

GB/T19495.4轉基因產品檢測核酸定性PCR檢測方法

GB/T19495.5轉基因產品檢測核酸定量PCR檢測方法

GB/T19495.6轉基因產品檢測基因芯片檢測方法

GB/T19495.7轉基因產品檢測抽樣和制樣方法

GB/T19495.8轉基因產品檢測蛋白質檢測方法

GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法

SN/T1204植物及其加工產品中轉基因成分實時熒光PCR定性檢驗方法

SN/T2584水稻及其產品中轉基因成分實時熒光PCR檢測方法

3術語、定義和縮略語

3.1術語和定義

GB/T19495.1、GB/T19495.6確定的術語和定義適用于本標準。

3.2縮略語

下列縮略語適用于本標準。

3.2.1

DNA：deoxyribonucleicacid

脫氧核糖核酸。

3.2.2

dNTP：deoxyribonucleosidetriphosphate

1

GB/TXXXXX—XXXX

脫氧核苷酸三磷酸。

3.2.3

dATP：deoxyadenosinetriphosphate

脫氧腺苷三磷酸。

3.2.4

dCTP：deoxycytidinetriphosphate

脫氧胞苷三磷酸。

3.2.5

dGTP：deoxyguanosinetriphosphate

脫氧鳥苷三磷酸。

3.2.6

dTTP：deoxythymidinetriphosphate

脫氧胸苷三磷酸。

3.2.7

dUTP：deoxyuridinetriphosphate

脫氧尿苷三磷酸。

3.2.8

Bp：basepair

堿基對

3.2.9

BAR：phosphinothricinacetylatransferasegene

來源于桿菌Bacillusamyloliquefaciens草丁膦乙酰轉移酶基因

3.2.10

Cry1Ab：bacillusthuringiensisInsecticidaltoxinCryIAbgene

蘇云金芽孢桿菌殺蟲毒蛋白cryIA(b)基因

3.2.11

Cry1Ac：bacillusthuringiensisInsecticidaltoxinCryIAcgene

蘇云金芽孢桿菌殺蟲毒蛋白cryIA(c)基因

3.2.12

2

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CaMV35S-P：Promoterfromcauliflowermosaicvirus

來自于花椰菜花葉病毒的35S啟動子。

3.2.13

NOS-3’：Terminationsequenceofthenopalinesynthasegene

胭脂堿合成酶基因終止子。

3.2.14

CaMV35S-T：Terminationsequencefromcauliflowermosaicvirus

來自于花椰菜花葉病毒的35S啟動子。

3.2.15

GOS9：Oryzasativa(rice)GOS9gene

水稻GOS9基因。

3.2.16

PC：Positivecontrol

陽性對照

3.2.17

NC：Negativecontrol

陰性對照

4防污染措施

檢測過程中防止交叉污染的措施應按照GB/T19495.2的規定執行。

5抽樣與制樣

抽樣與制樣方法應符合GB/T19495.7的相關規定。

6原理

待檢樣品經抽樣記錄后，提取DNA模板，核酸進行定量。針對轉基因水稻中常見外源基因片段設計

引物，對提取DNA模板進行多重PCR擴增。擴增產物與固定有目標基因特異性探針的膜芯片進行反向斑

點雜交，檢測結果可以用肉眼直接判斷，或用芯片識讀儀對雜交芯片進行掃描并判定結果。

7試劑與標準品

7.1試劑

3

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除非另有規定，本方法中所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規定的三級水。

7.1.1試劑組分

水稻轉基因檢測膜芯片法試劑組分應符合表1和7.1.2～7.1.21的規定。

表1.膜芯片法試劑組分

序號名稱規格數量存放條件

1多重PCR即用型預混液1250μL1管-20℃

2多重PCR引物預混液250μL1管-20℃

3無核酸酶滅菌水1mL2管-20℃

4轉基因標準品基因組DNA（50ng/μL）200μL1管-20℃

5陽性寡核苷酸單鏈DNA50μL1管-20℃

6DDDDDDDNA(Po去si活ti化ve液-Oligo,10μM)60mL1瓶室溫

7去活化清洗液60mL1瓶室溫

8雜交液60mL1瓶室溫

9雜交清洗液60mL2瓶室溫

10酶孵育液60mL1瓶室溫

11堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素25μL1管4℃

12孵育清洗液160mL2瓶室溫

13孵育清洗液260mL2瓶室溫

14BCIP/NBT顯色底物25mL1瓶4℃

15膜芯片/50片室溫

7.1.2引物

PCR反應使用的引物序列應符合表2的規定。

表2.PCR反應使用的引物序列

目標基因引物名稱序列擴增片段大小（bp）

Forward5'-CGTCTGCGGGAGCGCTATCC-3'

BAR168bp

Reverse5'-biotin-GTAGAGCGTGGAGCCCAGTC-3'

Forward5'-GACATGAACAGCGCCTTGAC-3'

Cry1Ab164bp

Reverse5'-biotin-TTGATGGTTGCAGCATCGAA-3'

Forward5'-GTTAGACTCAACAGCAGTGGA-3'

Cry1Ac161bp

Reverse5'-biotin-GAGAAGATGGATGAATTACCCCA-3'

Forward5'-GGCCATCGTTGAAGATGCCTC-3'

CaMV35S-P144bp

Reverse5'-biotin-TCATCCCTTACGTCAGTGGA-3'

Forward5'-TGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTT-3'

NOS-3’113bp

Reverse5'-biotin-GCGCGCGATAATTTATCCTAGTTT-3'

CaMV35S-TForward5'-CCAGATAAGGGAATTAGGGTTC-3'132bp

4

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Reverse5'-biotin-ACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGA-3'

Forward5'-GACGATCCGTAGTGGAGC-3'

GOS9117bp

Reverse5'-biotin-GTAATCGTAGTTGGATTTCCACC-3'

7.1.3探針

膜芯片表面包被的目標基因探針序列應符合表3的規定。

表3.目標基因探針序列

名稱序列修飾基團

BAR5'-CGCAACGCCTACGACTGGACGGCCGAGTCGACCGTGTACGTCTCCCCCCGCCACCAGCG-3'5'-AminolinkerC6

Cry1Ab5'-GCAGCTAATCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTAGCGTGTTTGGGCAAAGGTGGGG-3'5'-AminolinkerC6

Cry1Ac5'-TCTACCAGATATAGAGTTCGTGTGAGGTATGCTTCTGTGACCCCTATTCACCTCAACGT-3'5'-AminolinkerC6

CaMV35S-P5'-AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATG-3'5'-AminolinkerC6

NOS-3’5'-TTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGC-3'5'-AminolinkerC6

CaMV35S-T5'-AGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAAT-3'5'-AminolinkerC6

GOS95'-GCCTTTACATACGTTGGCACGGACGGGAATGAACATCTTGCAGGTCCTTGGGGTGGTGG-3'5'-AminolinkerC6

PC5'-GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG-3'5'-AminolinkerC6

NC5'-GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGATGATCCTATTTTC-3'5'-AminolinkerC6

注：陽性寡核苷酸單鏈DNA(Positive-Oligo,10μM)：核苷酸序列與陽性對照核酸探針（PC）序列互補，用于

膜芯片雜交過程質量控制，5’端帶生物素（biotin）標記，序列如下：

5'-biotin-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3'

7.1.4氫氧化鈉（NaOH）：分析純

7.1.5氯化鈉（NaCl）：分析純

7.1.6磷酸二氫鈉（NaH2PO4.H2O）：分析純

7.1.7乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）：分析純

7.1.8十二烷基磺酸鈉（SDS）：分析純

7.1.9堿性磷酸酶標記鏈霉親和素(AP-streptavidin)

7.1.10堿性磷酸酶化學顯色底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑蘭（NBT/BCIP）

7.1.11多重PCR即用型預混液（MultiplexPCRMasterMix）

7.1.12多重PCR引物預混液（MultiplexPCRPrimerMix）：每條引物2μM

7.1.1320×SSPE緩沖液：3molNaCl,200mmolNaH2PO4,20mmolEDTA,pH7.4

7.1.14去活化液：100mmolNaOH

7.1.15去活化清洗液：2xSSPE,0.1%SDS

5

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7.1.16雜交液：2xSSPE,0.1%SDS

7.1.17雜交清洗液：2xSSPE,0.5%SDS

7.1.18酶孵育液：2xSSPE,0.5%SDS

7.1.19孵育清洗液1：2xSSPE,0.5%SDS

7.1.20孵育清洗液2：2xSSPE

7.1.21底物顯色液：堿性磷酸酶化學顯色底物NBT/BCIP

7.2標準品

7.2.1LLRice62Rice轉基因水稻標準品LLRice62品系

7.2.2BT63Rice轉基因水稻標準品BT63品系

7.2.3Non-ModifiedRice非轉基因水稻標準品

8儀器與設備

8.1基因擴增儀。

8.2超凈工作臺。

8.3消毒滅菌鍋。

8.4制冰機。

8.5核酸蛋白分析儀。

8.6冷藏冷凍冰箱。

8.7純水儀。

8.8研磨儀。

8.9分析天平。

8.10膜芯片識讀儀。

8.11臺式離心機：轉速12000rpm/min。

8.12Mini個人離心機。

8.13旋渦混合器。

8.14恒溫水浴鍋。

8.15分子雜交爐。

8.16膜芯片自動雜交儀。

8.17微量移液器及槍頭。

6

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9試驗方法

9.1樣品

9.1.1實驗室樣品代表性應符合GB/T19495.7的規定。

9.1.2標準品、實驗室樣品及測試樣品的保存應按照GB/T19495.1的規定執行。

9.1.3所有測試樣品的制備操作應按照GB/T19495.2的規定執行，小心操作確保防止任何的污染和

樣品組分的改變。

9.2樣品制備

9.2.1DNA的提取

樣品中DNA的提取，應按照GB/T19495.3中的規定執行。每個測試樣品提取時應做兩個提取重復。

9.2.2PCR擴增

將10.2.1的核酸提取物加入到PCR反應體系進行擴增。

9.2.3PCR反應體系

按照表4配制PCR反應體系。每次實驗中，利用轉基因水稻標準品的基因組DNA作為陽性質控，

非轉基因水稻標準品的基因組DNA作為陰性質控，核酸提取空白作為空白質控，以對后續的PCR擴增體系、

膜芯片雜交反應進行質控。

表4.PCR反應體系體積（50μl）

反應液組成檢測反應陽性質控陰性質控空白質控

MultiplexPCRMasterMix25μL25μL25μL25μL

MultiplexPCRprimerMix5μL5μL5μL5μL

檢測樣品基因組DNA200ng///

轉基因水稻標準品基因組DNA/200ng//

非轉基因水稻標準品基因組DNA//200ng/

核酸提取空白///10μL

無核酸酶滅菌水upto50μLupto50μLupto50μLupto50μL

PCR體系最終含有MgCl21.5mM,dNTP(含dUTP)0.4mM，UDG酶1U，Taq酶2U，每條引物0.2μM。

9.2.4PCR反應循環參數

按照表5設計PCR反應參數。

表5.PCR反應參數

步驟溫度反應時間

137℃10min

295℃10min

395℃30s

7

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455℃30s

572℃30s

3、4、5循環40次

672℃10min

74℃保溫

9.3膜芯片雜交

9.3.1雜交體系

按照表6配制雜交體系液。

表6.雜交體系

組份體積（μL）

雜交液（2xSSPE,0.1%SDS）979

PCR擴增產物20

陽性寡核苷酸單鏈DNA

1

(Positive-Oligo,10μM)

總體積1000

9.3.2酶孵育體系

按照表7配制酶孵育體系液，用前新鮮配制。

表7.酶孵育體系

組份體積（μL）

孵育液（2xSSPE,0.5%SDS）999.5

堿性磷酸酶標記鏈霉親和素

0.5

（AP-streptavidin）

總體積1000

9.3.3雜交，酶聯及顯色

10.3.3.1手動過程：

將膜芯片置于雜交盒內，按表7進行手動雜交。雜交過程在分子雜交爐中進行，類似儀器應滿足實

驗要求。

表7.膜芯片手動雜交過程

過程名稱步驟

去活化加入去活化液，37℃，8分鐘，吸除去活化液。

去活化清洗加入去活化清洗液，60℃，5分鐘，吸除去活化清洗液。

8

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雜交加入雜交體系液，42℃，45分鐘，吸除雜交體系液。

雜交清洗(2次)加入雜交清洗液，52℃，5分鐘，吸除雜交清洗液，該過程重復2次。

酶孵育加入酶孵育體系液，42℃，30分鐘，吸除酶孵育體系液。

孵育清洗1(2次)加入孵育清洗液1，42℃，5分鐘，吸除孵育清洗液1，該過程重復2次。

孵育清洗2(2次)加入孵育清洗液2，37℃，5分鐘，吸除孵育清洗液2，該過程重復2次。

顯色加入顯色液，37℃，靜止顯色15分鐘，吸除顯色液。

顯色清洗(2次)加入去離子水，37℃，5分鐘，吸除去離子水，該過程重復2次。

結果判讀根據雜交點顯色情況進行結果判讀

10.3.3.2自動雜交儀測定過程：

按膜芯片自動雜交儀操作說明書開機，預熱，之后將包裝有膜芯片的雜交盒放入自動雜交儀中開始

雜交過程，依次自動完成去活化、雜交、清洗、酶孵育、顯色等步驟，自動完成雜交過程。

具體過程如表8所示，膜芯片自動雜交設備通用要求見附錄C。

表8.自動雜交儀測定過程

程序名稱試劑名稱溫度（℃）時間（min）

去活化去活化液378

去活化清洗去活化清洗液605

雜交雜交液4245

雜交清洗雜交清洗液525

雜交清洗雜交清洗液525

酶孵育孵育液4230

孵育清洗1孵育清洗液1425

孵育清洗1孵育清洗液1425

孵育清洗2孵育清洗液2375

孵育清洗2孵育清洗液2375

顯色顯色液3715

顯色清洗去離子水375

顯色清洗去離子水375

結果判讀根據雜交點顯色情況進行結果判讀

9.4膜芯片結果判讀

9.4.1目測判讀

9

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顯色后的膜芯片可以用肉眼直接判讀檢測結果。陽性雜交信號為肉眼明顯可見的藍色斑點。如果雜

交點部位沒有顯色，和膜芯片背景相同，則判讀為陰性雜交信號。

9.4.2膜芯片識讀儀判讀

膜芯片顯色后，使用膜芯片識讀儀進行掃描分析，根據雜交點的灰度值判斷檢測結果，陽性雜交信

號的判斷閾值是3倍背景灰度值加上3倍背景灰度值標準差。

10結果判斷

10.1質量控制

10.1.1質量控制原則

實驗中設置11.1.2～11.1.4所述的質控對照，其膜芯片雜交檢測結果應符合以下情況。如果出現非

11.1.2～11.1.4中所述的雜交結果，則應判斷實驗不成功，需重做實驗。

10.1.2核酸提取空白對照和多重PCR擴增試劑空白對照

膜芯片上內源基因探針點雜交信號陰性，外源基因探針點雜交信號陰性，陽性對照探針點雜交信號

陽性，陰性對照探針點雜交信號陰性。

10.1.3非轉基因標準品對照

膜芯片上內源基因探針點雜交信號陽性，外源基因探針點雜交信號陰性，陽性對照探針點雜交信號

陽性，陰性對照探針點雜交信號陰性。

10.1.4轉基因標準品對照

膜芯片上內源基因探針點雜交信號陽性，外源基因探針點雜交信號陽性，陽性對照探針點雜交信號

陽性，陰性對照探針點雜交信號陰性。

10.2結果判斷

10.2.1樣本檢測結果中陽性對照探針點雜交信號陰性，可初步判讀膜芯片雜交過程不成功，應確認各

雜交試劑是否過期或保存條件不當，更換可疑試劑后重新試驗。

10.2.2樣本檢測結果中內源基因探針點雜交信號陰性，表明未能從樣本中提取出適宜多重PCR擴增的

核酸模板，需要重新進行樣本核酸提取和多重PCR擴增。

10.2.3樣本檢測結果中內源基因探針點雜交信號陽性，外源基因探針點雜交信號陰性，表明樣本核酸

提取、多重PCR擴增和膜芯片雜交過程正常，判斷樣本中未檢出測定轉基因成分。

10.2.4樣本檢測結果中內源基因探針點雜交信號陽性，各外源基因探針點雜交信號部分或全部陽性，

表明樣本核酸提取、多重PCR擴增和膜芯片雜交過程正常，判讀樣本中存在陽性信號點對應的轉基因成

分。

11確證實驗

轉基因成分膜芯片檢測陽性樣本可進一步進行確證實驗，確證實驗方法按照SN/T1204和SN/T2584

中規定的方法執行。

10

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12結果表述

12.1未檢出

未檢出XXXX基因，陰性質控探針雜交點、陽性質控探針雜交點的檢測結果正常。

12.2檢出

檢出XXXX基因，未檢出XXXX基因，陰性質控探針雜交點、陽性質控探針雜交點的檢測結果正常。

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附錄A

（規范性附錄）

膜芯片法檢測步驟

A.1膜芯片法檢測按照圖A.1步驟進行。

圖A.1

待測樣品

核酸提取

多重PCR擴增

膜芯片雜交