關于常用免疫測定方法的原理和質量非標記免疫分析：補體結合試驗，免疫速率散射比濁測定標記免疫分析：放射免疫法、酶標記免疫法、熒光免疫法、發光免疫法、電化學發光免疫定量免疫免疫分析中的質量問題

1、工具抗體

2、包被（反應載體及其抗原或抗體的包被）

3、標記物

4、校準

5、基質效應第2頁,共97頁，2024年2月25日，星期天從定性試驗到定量測定第3頁,共97頁，2024年2月25日，星期天補體結合試驗，曾經最敏感抗原-抗體反應形成的免疫復合物能結合補體，紅細胞及其抗體能指示補體的含量，由此較敏感地推斷抗原或抗體的含量主要特點：現已少用，紅細胞不易保存和標準化第4頁,共97頁，2024年2月25日，星期天免疫速率散射比濁測定即測定最大反應速率，在抗體過量的情況下，反應峰值的高低與抗原的量成正比。峰值（最大導數）出現的時間與抗體的濃度及其親和力直接相關。利用不同抗原含量與其速率峰值的函數關系，計算出抗原含量主要特點：不必等到抗原抗體達到平衡，可節省反應時間，檢測敏感度量為mg/L水平,生化儀上可做透射比濁測定，抗體必須過量且為R型第5頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第6頁,共97頁，2024年2月25日，星期天標記免疫分析放射免疫法（同位素碘125標記）：免疫放射測定法，放射免疫測定法酶標記免疫法（標記酶分子量比碘125大，空間位阻大，標記酶容易失活）熒光免疫法：時間分辨熒光免疫分析，酶標記熒光免疫測定，熒光偏振免疫測定，Luminex技術發光免疫法電化學發光免疫

第7頁,共97頁，2024年2月25日，星期天放射免疫法（同位素碘125標記）免疫放射測定法（immunoradiometricassay，IRMA）：夾心法，系用放射性同位素標記抗體（*Ab）主要特點：靈敏度較高，被測物需有兩個以上抗原決定簇放射免疫測定法（radioimmunoassay，RIA）：競爭法，系利用放射性同位素標記抗原，主要特點：被測物低濃度時的精度較差，受到抗體量的限制第8頁,共97頁，2024年2月25日，星期天RosalynYalow(1977獲諾貝爾獎）第9頁,共97頁，2024年2月25日，星期天標記免疫的發展第10頁,共97頁，2024年2月25日，星期天酶標記免疫法

顯色底物法（比如酶聯免疫吸附試驗，ELISA）：主要采用辣根過氧化物酶標記和堿性磷酸酶標記，主要特點：大多數采用的96孔酶標板，測單孔成本低，新項目上得快，但容積小，孔間包被差異大，特別是偶爾出現的“壞包被孔”導致雙孔測定的高成本等熒光底物法：采用堿性磷酸酶標記，以磷酸傘型酮作為底物，主要特點：屬于酶免疫，其效果取決于采用反應的載體，自動分析能克服酶標的一些缺點發光底物法

第11頁,共97頁，2024年2月25日，星期天酶標記免疫法：發光底物法

采用堿性磷酸酶標記，以金剛烷衍生物的磷酸鹽為底物，它在堿性磷酸酶(ALP)作用下,磷酸酯基發生水解而脫去一個磷酸基,開始裂解并發光，可持續幾十分鐘。主要特點：屬于酶免疫，但發光時間長，效果取決于采用反應的載體，自動分析能克服酶標的一些缺點第12頁,共97頁，2024年2月25日，星期天酶（標記）化學發光免疫分析第13頁,共97頁，2024年2月25日，星期天熒光（fluorescence）發射光的能量來自激發光的能量即激發一停，發光立即停止，余輝≤10-8s(0.01μs)者熒光基本不受溫度影響第14頁,共97頁，2024年2月25日，星期天磷光（phosphorescence

）發射光的能量也來自激發光激發光停止后，發光還會延續一段時間，即余輝≥10-8s(0.01μs)又分為短期磷光(余輝10-8s~10-4s)和長期磷光(余輝≥10-4s)磷光的衰減強烈的受溫度影響時間分辨熒光免疫分析中作為標記物的稀土離子(如Eu3+、Tb3+、Sm3+和Dy3+)產生的“長壽命熒光”實際就是長期磷光(可長達數十、數百、乃至數千μs)第15頁,共97頁，2024年2月25日，星期天化學發光(chemiluminescence)發射光的能量來自發光物的化學(氧化還原)反應，簡稱“發光”生命物質的化學發光稱為生物發光發光是常見的自然現象，人們最熟悉的發光生物是螢火蟲，在海深2000米以下，多數生物都發光第16頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共97頁，2024年2月25日，星期天熒光免疫法

時間分辨熒光免疫分析酶標記熒光免疫測定，同上節酶標記免疫法中的熒光底物法熒光偏振免疫測定Luminex技術：將流式細胞術中的概念創造性地用于高效率平行測定血清成分，是上個世紀末實驗室檢測技術中最重要的發明之一第18頁,共97頁，2024年2月25日，星期天時間分辨熒光免疫分析timeresolvedfluoroimmunoassay;TRFIA

以鑭系元素作為標記物所建立的免疫測定技術主要特點：因鑭系元素(如Eu3+)所發射的熒光壽命長，在測定特異性熒光時，可通過延遲檢測時間而將標本或環境中的非特異熒光扣除，使其具有良好信噪比第19頁,共97頁，2024年2月25日，星期天時間分辨熒光免疫分析第20頁,共97頁，2024年2月25日，星期天熒光偏振免疫測定fluorescencepolarizationimmunoassay，FPIA熒光物質經單一平面的藍偏振光(485nm)照射后，吸收光能躍入激發態，隨后回復至基態，并發出單一平面的偏振熒光(525nm)。偏振熒光的強弱程度與熒光分子的大小呈正相關主要特點：最適宜檢測小至中等分子物質，常用于藥物、激素的測定第21頁,共97頁，2024年2月25日，星期天熒光偏振免疫分析第22頁,共97頁，2024年2月25日，星期天發光免疫法發光分子標記（化學發光免疫分析，CLIA）：用化學發光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標記的是吖啶酯,它能直接與過氧化氫反應而發光。主要特點：化學反應簡單、快速、無須催化劑，吖啶酯分子量小，位阻小；檢測小分子抗原采用競爭法,大分子抗原則采用夾心法,非特異性結合少,本底低;與大分子的結合不會減小所產生的光量,從而保證了靈敏度酶標記發光免疫測定：同上節酶標記免疫法中的發光底物法。電化學發光免疫第23頁,共97頁，2024年2月25日，星期天化學發光免疫分析第24頁,共97頁，2024年2月25日，星期天電化學發光免疫electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA用三聯吡啶釕衍生物，即[Ru(bpy)3]2+N羥基琥珀酰胺酯，作為標記物，利用其與三丙胺在電化學池內進行氧化還原反應而發光主要特點：發光反應的能量由電極補充，發射光的線性范圍大，從而保證了較大的測定范圍，但是電化學池內進行反應會影響速度，且需防止攜帶污染（沖洗）第25頁,共97頁，2024年2月25日，星期天工作電極(陽極)上一定的電壓能量作用下，二價三聯吡啶釕釋放電子發生氧化反應而成為三價的三聯吡啶釕，同時，電極表面的三丙胺（TPA）也釋放電子發生氧化反應而成為陽離子自由基TPA+

，并迅速自發脫去一個質子而形成三丙胺自由基TPA·這樣，在反應體系中就存在強氧化性的三價三氯聯吡啶釕Ru(bpy)33+

和強還原性的三丙胺自由基TPA·后兩者發生氧化還原反應，結果使三價的三聯吡啶釕還原成激發態的二價Ru(bpy)32+，并以620nm波長光子釋放能量后回到基態，再進入下一個循環第26頁,共97頁，2024年2月25日，星期天定量免疫分析中的質量問題

工具抗體包被（反應載體及其抗原或抗體的包被）標記物校準基質效應第27頁,共97頁，2024年2月25日，星期天工具抗體

多克隆抗血清（來自許多細胞株，不同類、不同型，不同親和力，針對抗原的不同表位）單克隆抗體（來自統一細胞株，一模一樣，針對抗原的表位）混合單克隆抗體的優點處和局限性多克隆抗血清與混合單克隆抗體結合使用面對的問題：被測分子表位的變異亞型，親和力和滴度，抗體的來源和不同的表位特異性第28頁,共97頁，2024年2月25日，星期天包被（coating)載體：

96孔酶標板的問題單珠和微球的區別磁微粒（球）包被物狀態干燥懸浮液第29頁,共97頁，2024年2月25日，星期天標記物標記物大小：

碘-125D

吖啶酯-481D

堿性磷酸酶-68000D(IgG-150000D)凍干液相標記分子結合物（conjugate）第30頁,共97頁，2024年2月25日，星期天校準(caliberation)校準品:

賦值，復溶，降解校準(caliberation)和擬合(normalization)

線性反應的校準非線性反應的擬合免疫試劑測定曲線的校準

第31頁,共97頁，2024年2月25日，星期天校準品的賦值校準品與儀器和試劑共同組成一個不可分割的系統校準品的值是由參考系統傳遞的這種傳遞的媒介是新鮮的病人樣品（比如血清、血漿或者全血）校準品賦值的目標是為了讓本系統測定的病人結果更接近參考系統測定的結果“為了病人結果準確，校準品可以犧牲自己”第32頁,共97頁，2024年2月25日，星期天校準(caliberation)校準品:

賦值，復溶，降解校準(caliberation)和擬合(normalization)

線性反應的校準非線性反應的擬合免疫試劑測定曲線的校準

第33頁,共97頁，2024年2月25日，星期天校準(caliberation)第34頁,共97頁，2024年2月25日，星期天擬合(normalization)第35頁,共97頁，2024年2月25日，星期天基質效應基質的差異在定量分析中的影響：什么是“基質（matrix)”？樣本基質差異能避免嗎？關于一致化的問題：

harmonization（和諧）可替代性第36頁,共97頁，2024年2月25日，星期天定量免疫分析的質控方法新世紀是否存在實驗室質量問題？臨床質量管理的歷史實驗室的質量控制方法6西格瑪質量管理質量管理中的幾個問題第37頁,共97頁，2024年2月25日，星期天新世紀是否存在實驗室質量問題？生產廠商不斷發展著分析系統許多實驗室認為分析質量已不成為問題或甚至不是實驗室的責任其實不然!讓我們看一下這兩年涉及免疫的全國室間質量評價吧!第38頁,共97頁，2024年2月25日，星期天2000年第一次內分泌室間質量評價總結

甲狀腺素(T4):CV%(均值/中位數/最大/最小)1#103.18%(4.71/3.95/40.3/0.46)2#98.98%(8.76/7.42/74.3/0.85)3#112.18%(15.68/13.10/154.4/1.20)4#108.44%(4.74/4.00/44.0/0.46)5#96.8%(8.76/7.50/71.2/0.82)第39頁,共97頁，2024年2月25日，星期天2001年第二次內分泌室間質量評價總結(除外3s)促甲狀腺激素(TSH):CV%(均值/中位數/最大/最小)E21:91.38%(2.90/2.38/16.80/0.05)E22:155.70%(1.58/1.03/16.80/0.03)E23:219.46%(1.85/0.80/23.88/0.04)E24:193.99%(1.83/0.88/17.6/0.01)E25:182.30%(1.13/0.71/14.50/0.02)第40頁,共97頁，2024年2月25日，星期天2002年第二次內分泌室間質量評價總結(除外3s)化學發光的結果促甲狀腺激素(TSH):CV%(均值/中位數/最大/最小)E21:19.69%(2.44/2.38/3.47/1.44)E22:18.58%(1.13/1.07/1.51/0.56)E23:19.05%(0.84/0.81/1.16/0.37)E24:19.15%(0.94/0.89/1.31/0.46)E25:19.47%(0.76/0.72/1.03/0.34)第41頁,共97頁，2024年2月25日，星期天2003年第一次內分泌室間質量評價總結中催乳素(PRL):

(除外3s)各種方法的結果方法(N)CV%(均值/中位數/最大/最小),E11#所有方法(152):32.86%(525/505/1356/100)放射免疫(14):42.33%(630/572/1356/309)化學發光(88):25.73%(475/499/814/117)微粒酶免(18):21.65%(678/670/884/421)電化發光(21):27.25%(570/489/898/407)時間分辨(6):129.77%(932/403/3380/32)第42頁,共97頁，2024年2月25日，星期天2003年第二次內分泌室間質量評價總結中催乳素(PRL):

(除外3s)各種方法的結果方法(N)CV%(均值/中位數/最大/最小),E21#所有方法(146):33.67%(1326/1283/3791/458)放射免疫(15):60.71%(1842/1426/4242/458)化學發光(85):20.65%(1209/1247/1950/660)微粒酶免(13):21.79%(1816/1723/2635/1131)電化發光(24):21.16%(1296/1232/1856/802)時間分辨(3):***%(***/***/878/611)第43頁,共97頁，2024年2月25日，星期天2002年第二次內分泌室間質量評價總結中催乳素(PRL):

(除外3s)各種方法的結果方法(N)CV%(均值/中位數/最大/最小),E21#所有方法(86):43.42%(5.29/4.86/1577/21)放射免疫(15):67.89%(973/748/2415/79)化學發光(47):18.57%(467/467/744/336)微粒酶免(13):32.65%(544/553/721/27)酶聯免疫(2):***%(***/***/486/261)電化發光(5):26.38%(631/686/796/379)時間分辨(2):***%(***/***/666/367)第44頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

QualityControlisnotsomethingtobeperformedwithoutthought.Thereisnosinglewayto"doQC",andthenotionthat2SDlimitsarethestandardQCpracticeisbothout-datedandwasteful.Dr.Westgard

質量控制并非不假思索便可成就，也沒有獨一無二的“做質控”方法，以為2SD界限就是標準質控的觀念看來既過時又浪費。韋斯特伽德博士第45頁,共97頁，2024年2月25日，星期天臨床質量管理的歷史40年代美國賓夕法尼亞州1967年美國通過“臨床實驗室改進法案”（CLIA67）1958年Freier等引入Levey-Jenning圖，開始IQC1972年CAP開始EQA(PT)1988年美國通過“臨床實驗室改進修正案”（CLIA88）2000年ISO提出質量管理體系的概念第46頁,共97頁，2024年2月25日，星期天實驗室質量管理的歷史發展過程

現場檢查→質量控制（室內質控，室間評價…）→質量保證（CLIA67和CLIA88中的QC和QA的規定）→質量改進→質量（管理）體系（按ISO9000進行質量認證和按ISO17025進行實驗室認可）→全面質量管理第47頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

第48頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第49頁,共97頁，2024年2月25日，星期天臨床實驗室QC模式的演進Levey-Jenning圖和單一規則的應用Levey-Jenning圖和Westgard多(判斷)規則

6個主要規則:12s/13s/22s/R4s/41s/10xQC多規則流水線:12s起動13s/22s/R4s/41s/10xLevey-Jenning圖和個性化設計的QC注重成本效益的QC根據實際條件和需要選擇質控規則和所測質控物數目第50頁,共97頁，2024年2月25日，星期天Levey-Jennings圖直方圖顯示質控值期望的分布從質控數據計算平均值和標準差(s)以建立質控界限期望的質控值進入質控界限內:95%在2s內,99.7%在3s內將對應于時間的質控值點入提供了質控圖確認非期望的質控值(失控點):12s警告,13s失控第51頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第52頁,共97頁，2024年2月25日，星期天Westgard多規則QC6個主要規則:12s/13s/22s/R4s/41s/10x

QC多規則流水線:12s起動13s/22s/R4s/41s/10x第53頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第54頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第55頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第56頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第57頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第58頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第59頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第60頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第61頁,共97頁，2024年2月25日，星期天個性化設計的QC注重成本效益的QC“選擇規則”的質控:根據測定項目的不精密度、偏差和規定的總誤差，以及期望的誤差檢出率(90%)和盡可能低的假報警(5%)，選用盡可能簡單的規則,以體現成本效益。第62頁,共97頁，2024年2月25日，星期天設定質量目標（確定分析項目的TEa）↓評價本實驗室所用分析方法的不精密度（CV%）和不準確度(Bias)↓畫出OPSpecs圖↓評價誤差檢出概率(Ped)和假失控概率(Pfr)↓確定質控方法（包括質控規則和質控品測定的個數）↓重新評價性能第63頁,共97頁，2024年2月25日，星期天QC能否保證測定方法可接受若沒有定義質量要求，QC只能反映變化我們是通過定義“靶”值和允許總誤差（TEa)以確定“質量要求”的通過所測定項目的偏差和CV能計算出總誤差（TE),并與TEa進行比較，以此確定該方法是否能被接受統計小結同樣用于評估新批號試劑、快速檢查校準(calibrations)和評估均值漂移第64頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第65頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第66頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第67頁,共97頁，2024年2月25日，星期天Weexpectonerunoutof20(5%)tofallbetween2and3SDfromthemean.第68頁,共97頁，2024年2月25日，星期天Whenmostdatapointsfallwithin+/-1SD,theassignedSDismuchhigherthantheactualobservedvalue.第69頁,共97頁，2024年2月25日，星期天AsignificantincreaseinrandomerrordoesnotgenerateaQCflagwhentheASSIGNEDSDissignificantlyhigherthentheACTUALvalue.第70頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第71頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第72頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

ThecalculatedmeanandSDareincorrectifthedataincludetwopopulationswithdifferentmeans.

第73頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第74頁,共97頁，2024年2月25日，星期天ThecalculatedSDisincorrectifthedataincludetwopopulationswithdifferentSDs.第75頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第76頁,共97頁，2024年2月25日，星期天6-Sigma

質量管理6-Sigma質量管理是美國臨床實驗室質量管理的幾年前的又一潮流，進入較快的發展階段。

6Sigma概念曾是摩托羅拉公司上世紀80年代質量管理策略的主要框架。這一想法發展了能夠生產出那樣優質（事實上是無缺陷）產品的制造過程第77頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第78頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第79頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

Cpk=(可接受規格

-bias)/3s

第80頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第81頁,共97頁，2024年2月25日，星期天質控圖的幾點要求設定的靶值應當與實際的均值一致，不一致怎么辦？設定的SD應當與實際的SD一致（或接近），不一致怎么辦？方法精度越高，SD越小，如何避免因為過小的SD使臨床完全能夠接受的結果，因為質控超過3SD，而“被報廢”？第82頁,共97頁，2024年2月25日，星期天解決辦法既然優秀的實驗室可以做到6西格瑪，即超出6SD才算不合格（超過允許總誤差TEa）那么，我們就可以干脆用TEa代替3SD作為質控限當然，我們可以根據自己的情況加以調整，選擇比推薦的TEa更小的TEa作為自己實驗室的TEa那么,原來的2SD\3SD線條要不要了呢？第83頁,共97頁，2024年2月25日，星期天解決辦法WESTGARD規則還有甚么用處？原來的2SD/3SD線條還是有用的！有了它們，就可以使用WESTGARD規則但是，我們使用它們，不再是判斷是否失控，而是判斷存在何種性質的誤差：隨機誤差？還是系統誤差？出現22s、41s或10x是系統誤差，出現13s、R4S是隨機誤差（接下來可以尋找原因）第84頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第85頁,共97頁，2024年2月25日，星期天臨床免疫QC的幾個問題1.

有了先進的儀器和配套的試劑、校準品和質控物,臨床實驗室還需要自己關注質量問題嗎?第86頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

經過以上討論，您一定不會贊成。先進的儀器和配套的試劑、校準品和質控物為實現優秀實驗室創造了基本條件。但是，保證臨床免疫分析結果的穩定可靠，仍然需要實驗室本身的不懈努力；實現各實驗室間結果的可比性，則需要實驗室之間的共同努力。儀器生產商的質量體系不能代替實驗室自己的質量體系。我們對