關于細胞凋亡及其調控分子機制第2頁,共117頁，2024年2月25日，星期天凋亡的概念，與壞死的區別凋亡信號通路細胞凋亡相關蛋白、細胞凋亡與疾病細胞凋亡檢測第3頁,共117頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡名稱的由來英國Aberdeen大學病理系

Kerr教授1972年我和Wyllie在研究中觀察到一種不同于壞死的細胞死亡方式，聯想到秋日落葉，我們就把它稱作Apoptosis第4頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第5頁,共117頁，2024年2月25日，星期天

SydneyBrenner1/3oftheprizeUnitedKingdomTheMolecularSciencesInstitute

Berkeley,CA,USAb.1927

(inUnionofSouthAfrica)H.RobertHorvit1/3oftheprizeUSAMassachusettsInstituteofTechnology(MIT)

Cambridge,MA,USAb.1947JohnE.SulstonUnitedKingdomTheWellcomeTrustSangerInstitute

Cambridge,UnitedKingdomb.1942

THE2002NOBELPRIZEWINNER第6頁,共117頁，2024年2月25日，星期天王曉東：

從事的是細胞凋亡規律的研究。2000年，他和助手們進行了一項實驗，研究一種神秘的線粒體蛋白質Smac，這種蛋白質可以打破腫瘤的“堅硬堡壘”，誘使腫瘤細胞“自殺”，對研究治療癌癥方法有重要幫助。從1996年他建立起自己的研究室后，他的論文成果在8年間被其他科學家引用超過了15000次。第7頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第一節細胞凋亡的特征及意義一、細胞凋亡的基本特征第8頁,共117頁，2024年2月25日，星期天

程序性細胞死亡programmedcelldeath,PCD在發育過程中定時出現的生理性刺激誘導的細胞死亡。用于選擇性地清除多細胞動物體內一些無用的或危險的細胞。依據形態學不同，程序性細胞死亡可劃分為凋亡（apoptosis）、自噬（autophagy）、腫脹性死亡3種形式。細胞凋亡：apoptosis在生理和病理條件下，由基因控制的自主有序的死亡過程。生理條件下，凋亡用以清除單個細胞，繼而由巨噬細胞內吞，最后再由溶酶體執行降解功能。自噬autophagy:是一種在進化上保守的真核細胞內轉運泡的運輸機制，它可將細胞本身的亞細胞成分如蛋白、胞質或細胞器，通過溶酶體中的水解酶進行消化降解和循環。凋亡和自噬都是細胞內重要的生理過程。

壞死Necrosis：各種致病因子，干擾和中和了細胞的正常代謝活動，造成細胞的意外死亡。第9頁,共117頁，2024年2月25日，星期天誘發因素

特定的生理病理因素，藥物

缺氧、藥物、毒素組織分布

單個細胞分布

成片細胞組織反應

形成凋亡小體，被周圍組織

細胞內容物溶解細胞吞噬，無炎癥反應釋放，有炎癥反應

壞死凋亡第10頁,共117頁，2024年2月25日，星期天形態學：

細胞體積

皺縮變圓，細胞漿失水濃縮

腫脹，外形不規則化細胞膜

保持完整，形成泡狀，凋亡破裂后期內陷包裹核物質和細胞器形成凋亡小體細胞核

核膜完整，核皺縮，染色質固縮

核腫脹破裂，

聚集在核膜下，最后核裂成碎片染色質不規則外移細胞器

大多數保持完整，線粒體腫脹，

多受損，溶通透性增加，釋放細胞色素

酶體破裂，線粒體腫脹破裂

凋亡壞死第11頁,共117頁，2024年2月25日，星期天

DNA階梯狀片段化隨機斷裂磷脂凋亡早期磷脂酰絲氨酸外翻外翻

ATP合成并提供能量耗竭凋亡壞死生物化學：出現180-200bp大小及其倍數的核苷酸片段，DNALADDER第12頁,共117頁，2024年2月25日，星期天細胞壞死與凋亡的形態區別第13頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共117頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的誘發因素

生理性因素損傷刺激

腫瘤壞死因子家族

病毒感染FasL、TNFP53、PTEN

轉化生長因子

細胞毒素細胞癌基因

自由基

神經遞質治療因素

谷氨酸、多巴胺

化療藥物

去除細胞生長因子

紫外線

基質失去粘附特性

中草藥

第15頁,共117頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的生理意義1、確保正常發育、生長，根據代謝需要調節細胞數量、保持成體器官正常體積。

如：指（趾）間隙的形成2、維持內環境穩定如：清除受損、突變或衰老的細胞3、防御功能如：使受到病毒感染的細胞凋亡第16頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第二節細胞凋亡的發生機制

一、凋亡相關基因（一）ced基因

線蟲（c.elegans），1090個體細胞，其中131個細胞在發育過程中產生凋亡，發現14個基因與凋亡有關；且蟲體透明，易于觀察。第17頁,共117頁，2024年2月25日，星期天細胞內與凋亡有關的基因分2類：

1．存活基因：ced-9：bcl-2蛋白家族

2．致死基因：ced-4：凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1,apoptosisproteaseactivatingfactor-1,

3.致死基因：ced-3：Caspase家族(cycteinylaspartate-specificprotease).天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶線蟲人類第18頁,共117頁，2024年2月25日，星期天Caspase：1996年Alnemri等統一命名的一類與ICE/Ced-3同源性半胱氨酸蛋白酶。（二）caspase與細胞凋亡第19頁,共117頁，2024年2月25日，星期天1.特點：(1)是一種Cys蛋白酶(2)底物Asp-X(3)以酶原形式存在(4)活化的Caspase特異性水解一套底物，導致不可逆的細胞凋亡(5)細胞內有Caspase抑制劑。

IAP,inhibitorsofapoptosisproteins第20頁,共117頁，2024年2月25日，星期天2.結構特征①以無活性的形式存在。②在Pro-Caspases的N端均含有一段的前區域（Prodomain）。③活性形式均是由2個大亞基和2個小亞基組成的雜四聚體。一分子Pro-Caspase只能分裂產生1個大亞基和1個小亞基。④大亞基的C端含有活性中心，其中半胱氨酸（C）是必需氨基酸，故屬于半胱氨酸蛋白酶類。第21頁,共117頁，2024年2月25日，星期天3.分類：14種（1）細胞因子前體：caspase1，4，5，

11，12，13，14

不是凋亡的直接效應分子。

（2）凋亡起始分子：caspase2，8，9，10

（3）凋亡效應分子：caspase

3，6，7

參與介導細胞凋亡。第22頁,共117頁，2024年2月25日，星期天ICE家族成員A：3類caspase：藍色參與炎癥反應，紅色為執行者，綠色為啟動者；B：caspase-3的結構模型；C：caspase-3的活化過程執行者啟動者第23頁,共117頁，2024年2月25日，星期天4.caspase活化：Caspase酶原有很低的活性若caspase過表達，酶原在高濃度下可自身活化Caspase8，9含有死亡效應域（deatheffectdomain,DED），可相互作用，使酶原自身活化。Caspase8：激活所有酶原,如:Caspase3,6,7,9Caspase9：活化需線粒體釋放CytC,活化后激活Caspase2,3,6,8,10。

Caspase3,6,7:效應Caspase。第24頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共117頁，2024年2月25日，星期天5.Caspase

作用：（1）滅活細胞凋亡抑制蛋白:鼠:Caspase活化的DNA酶:Caspaseactivateddeoxyribonuclease,CAD，細胞凋亡抑制物：inhibitorofCAD,ICADICAD與CAD結合，CAD無活性，Caspase剪切ICAD，ICAD失活，CAD活化，CAD游離，進入細胞核內降解DNA。人：Helacell，DFF（DNAfragmentfactor)

，與ICAD同源第26頁,共117頁，2024年2月25日，星期天Ca2+/Mg2+

依賴的核酸內切酶：

多聚·ADP-核糖聚合酶（polyADP-ribosepolymerase,PARP）抑制Ca2+/Mg2+依賴的核酸內切酶,與基因完整性的監護有關。

PARP降解，Ca2+/Mg2+依賴的核酸內切酶活性增加，裂解核小體間的DNA，導致細胞凋亡。

Caspase第27頁,共117頁，2024年2月25日，星期天（2）

降解細胞結構蛋白：

降解核纖層蛋白，肌動蛋白，核分裂相關蛋白(3)切割細胞效應蛋白。(4)降解其他的caspases第28頁,共117頁，2024年2月25日，星期天6.Caspase活化抑制劑

IAP,inhibitorsofapoptosisproteins

細胞內存在的Caspase抑制蛋白，IAPinhibitorsofapoptosisproteins家族，阻止細胞凋亡過程。第29頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共117頁，2024年2月25日，星期天二、細胞凋亡的誘導發生

細胞凋亡的信號傳遞（1）Fas介導細胞凋亡（2）細胞色素C介導的細胞凋亡（3）粒酶GrB誘導細胞凋亡

第31頁,共117頁，2024年2月25日，星期天12第32頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第33頁,共117頁，2024年2月25日，星期天DR：死亡受體deathreceptors,DR

含DD：死亡結構域，deathdomain,DD

（DD存在于DR之胞內區，和FADD蛋白中）FADD蛋白：Fas相關的死亡結構域，Fas-associateddeathdomain（FADD蛋白含有DD，DED；可與pro-caspase8結合）

DED：死亡效應結構域，deatheffecterdomain,DED（存在于FADD蛋白、一些起始caspase酶原如pro-caspase8中）（1）死亡受體介導的細胞凋亡（外源性的）第34頁,共117頁，2024年2月25日，星期天

Fas-----細胞表面受體，跨膜蛋白；共4個蛋白第35頁,共117頁，2024年2月25日，星期天1.FasLigand（FasL）是Fas的天然配體，兩者介導細胞凋亡，FasL主要在淋巴細胞膜上表達。2.FasFas/Apo-1存在于細胞表面的特定區域，一旦被FasL或Fas抗體激活，可將信號傳遞到細胞內。

Fas屬腫瘤壞死因子受體(TNFR)及神經生長因子受體（NGFR）超家族，是細胞凋亡的受體信號，又叫死亡分子。Fas/Apo-1(CD95)第36頁,共117頁，2024年2月25日，星期天

Fas從人KT3細胞株分離的cDNA克隆。

Apo-1從人SKW6.4細胞株分離的cDNA克隆。后來證明兩者完全一致，命名為Fas/Apo-1，或稱CD95。

Fas蛋白位于10q33，編碼335AA，成熟319AA，是跨膜蛋白。

由胞外區，跨膜區、胞內區組成。胞內區有80AA,稱死亡結構域（deathdomain,DD）

第37頁,共117頁，2024年2月25日，星期天

3.FADD蛋白:

Fas相關死亡結構域蛋白：Fas-associateddeathdomainprotein

包括：DD，死亡結構域

deathdomainDED，死亡效應結構域

deatheffectdomain第38頁,共117頁，2024年2月25日，星期天Deathinducingsignalcomples,DISC第39頁,共117頁，2024年2月25日，星期天

FasL與Fas結合(同三聚體)

Fas的DD成簇，與FADD蛋白結合，

FADD蛋白活化

Caspase8活化

Caspase3，6，7活化

細胞凋亡（1）Fas介導細胞凋亡死亡誘導信號復合物Deathinducingsignalcomplex,DISC第40頁,共117頁，2024年2月25日，星期天誘導因素→跨膜電位↓（Δ

Ψm↓）

PTP開放（通透性轉換孔）凋亡啟動因子（細胞色素C，smac，AIF）釋出AIF：凋亡誘導因子（2）線粒體相關的細胞凋亡途徑（內源性的）現在，提得最多的、比較公認的線粒體在凋亡中的作用有兩點：（1）細胞色素C的釋放；（2）Smac/Diablo的釋放。第41頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第42頁,共117頁，2024年2月25日，星期天

（2）細胞色素C介導的細胞凋亡

CytC釋放入胞質

與胞漿接頭蛋白Apaf-1結合

Apaf-1寡聚化，募集Caspase9原

Caspase9活化

Caspase2,3,6,8,10活化

細胞凋亡

凋亡蛋白酶激活因子1，Apoptoticproteaseactivatingfactor-1Caspaserecuitmentdomain第43頁,共117頁，2024年2月25日，星期天5Fas介導細胞凋亡

Caspase8活化第44頁,共117頁，2024年2月25日，星期天凋亡誘導因子凋亡蛋白酶激活因子EndoG:endonucleaseG核酸內切酶GAIF：ApoptosisinducingfactorsApaf-1:Apoptoticproteaseactivatingfactor-1第45頁,共117頁，2024年2月25日，星期天

線粒體仍有足夠的CytC，及其他細胞色素，呼吸鏈完整，產生ATP，保證Caspase活化，細胞凋亡。

CytC釋放過多，呼吸鏈破壞，氧消耗，但是不產生ATP，導致細胞壞死。細胞含有caspase抑制劑，不能導致caspase依賴的細胞凋亡；當線粒體巨通道破壞，CytC釋放：第46頁,共117頁，2024年2月25日，星期天AKtJNKp53Bcl-2第47頁,共117頁，2024年2月25日，星期天（3）粒酶的基本結構和功能定義：粒酶，Granzyme，Gr，是CTL和NK細胞殺傷性顆粒中絲氨酸蛋白酶家族的總稱，以酶原形式存在。分類：GrA,GrB,GrH,GrM,類胰蛋白酶2功能：酶切靶細胞的多種底物蛋白，啟動細胞凋亡。

GrB活性最高，與其他粒酶，穿孔素（PEN,Perforin）一起儲存在CTL的殺傷顆粒中。第48頁,共117頁，2024年2月25日，星期天

粒酶進入靶細胞：CTL識別靶細胞，殺傷性顆粒移向靶細胞一極（極化）

GrB,PEN等蛋白釋放入細胞間隙

穿孔素(PEN)協助GrB進入靶細胞，定位在胞漿和胞核

第49頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第50頁,共117頁，2024年2月25日，星期天CTL腫瘤細胞CTL正在誘導腫瘤細胞凋亡第51頁,共117頁，2024年2月25日，星期天GrB誘導細胞凋亡

（1）

Caspase依賴途徑：

GrB切割

Caspase10

Caspase3,7,

PARP(多聚ADP核糖聚合酶)，Bid，DNA片段化因子(DFF)

細胞凋亡GrB確保靶細胞即使缺失1種或幾種Caspase成員時，仍能走向凋亡。

第52頁,共117頁，2024年2月25日，星期天切割

DFF，使CAD游離，降解DNA

結構蛋白Filamin，使細胞骨架破壞

PARP，使Ca2+/Mg2+依賴的核酸內切酶活性增加，裂解核小體間的DNA

細胞凋亡GrBDFF：DNA片段化因子CAD：caspase活化DNA酶PARP：多聚ADP-核糖聚合酶人：Helacell，DFF（DNAfragmentfactor)，與ICAD同源第53頁,共117頁，2024年2月25日，星期天（2）GrB介導線粒體凋亡途徑

①GrB切割胞漿Bid，產生活化Bid（tBid）

tBid移至線粒體，募集Bax，

誘導線粒體釋放CytC，Smac等因子，細胞凋亡

②誘導線粒體開啟膜通透性孔道PTP，破壞線粒體內膜電位，損傷線粒體功能，導致細胞死亡。第54頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第55頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第56頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第三節細胞凋亡的調控細胞自身蛋白的調控作用（一）P53（二）Bcl-2家族蛋白（三）c-myc（四）IAP家族蛋白

第57頁,共117頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的相關調控基因抑制凋亡基因：Bcl-2、IAPs促進凋亡基因:Fas、Bax、P53、雙向調控基因:c-myc第58頁,共117頁，2024年2月25日，星期天(一)P53野生型的P53蛋白是一種包含393AA的轉錄因子，活性形式為四聚體，自N端起依次包括轉錄活化區，DNA結合區，四聚體化區，C端調節區。

1.P53表達細胞中的DNA損傷，紡錘絲斷裂，癌基因異常激活，缺氧，ATP儲備下降等信號都能導致p53表達增加。已發現有數十種p53的相互作用蛋白，P53在胞漿中的含量受到嚴密的監控。第59頁,共117頁，2024年2月25日，星期天2.P53對細胞周期和凋亡的調節（1）抑制細胞周期p53主要作用于細胞周期的G1/S期，G2/M期等檢查點，并引起細胞周期停滯于G1或G2期。p53通過促進p21的表達，抑制如cyclinD-CDK4,cyclinE-CDK2等的活性，引起細胞周期阻滯于G1期。細胞周期負調節因子14-3-3sigma是p53下游靶基因之一，主要通過調節細胞周期的G2/M檢查點引起G2期阻滯，且與p21有相互增強作用。第60頁,共117頁，2024年2月25日，星期天（2）促進細胞凋亡細胞周期在G1，G2/M期的停滯為細胞DNA修復提供了時間，一旦修復失敗，p53則在其他因素作用下，有效誘導細胞凋亡。P53促進一系列細胞凋亡的相關分子的表達如Fas，DR5，Bax，Apaf-1，Noxa，PUMA等，增加細胞對凋亡信號的敏感性。P53:molecularpoliceman?第61頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第62頁,共117頁，2024年2月25日，星期天（二）Bcl-2家族蛋白的調控作用

（1）Bcl-2家族的結構Bcl-2B

celllymphoma/leukemia-2

兩個結構域：羧基端的跨膜結構域

Bcl-2同源結構域（Bcl-2homology,BH）Bcl-2—229aa構成，分布在線粒體內膜，細胞內膜表面，內質網，核膜等處Bcl-2和C.elegans中的ced-9有很高的同源性，具有促進細胞存活的功能Bcl-2的功能是延長細胞的壽命，而不是刺激細胞的增殖第63頁,共117頁，2024年2月25日，星期天Bcl-2家族分子結構第64頁,共117頁，2024年2月25日，星期天(2)BcL-2的同源基因和蛋白質抗凋亡作用，促凋亡作用，有Bax，Bak,BH3onlyprotein:

BcL-2基因家族成員自身或彼此之間有形成二聚體或多聚體的能力，BcL-2家族的蛋白與蛋白相互作用調節著細胞的存活與凋亡。第65頁,共117頁，2024年2月25日，星期天Bcl-2,Bax,Bcl-xs對凋亡的作用：

因此，Bcl-2表達增加，并不一定抑制凋亡（1）Bax/Bax形成二聚體，誘導凋亡（2）Bcl-2/Bax二聚體更穩定，Bcl-2增加，

Bcl-2/Bax增加，Bax/Bax減少，抗凋亡。（3）Bcl-xs存在，與Bcl-2形成二聚體，Bcl-2/Bax減少，Bax/Bax增加，誘導凋亡第66頁,共117頁，2024年2月25日，星期天(3)Bcl-2抗凋亡機制①直接的抗氧化②抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質③抑制促凋亡的Bax，Bak的作用④抑制Caspases激活⑤維持細胞鈣穩態第67頁,共117頁，2024年2月25日，星期天（三）c-myc

8q24，編碼產物p62，在核內，具有轉錄因子活性，調節基因轉錄。功能：促進細胞增殖。

c-myc低水平時，細胞生長停滯。

c-myc表達，血清生長因子存在時，促進細胞增殖。

c-myc表達，血清生長因子不存在時，促進細胞凋亡。

幾乎所有腫瘤都有c-myc基因的異常表達（高表達）。

第68頁,共117頁，2024年2月25日，星期天（四）IAP家族蛋白IAP(inhibitorofapoptosisproteins)家族蛋白是細胞凋亡抑制蛋白家族，已發現8個IAP家族成員，NIAP,cIAP-1,cIAP-2，XIAP,survivin,BRUCE,livin,ILP-2第69頁,共117頁，2024年2月25日，星期天（1）IAP直接抑制Caspase途徑的caspase3，7，9的活性。

如在Fas/caspase8途徑中，IAP抑制caspase3活性而發揮抑制。在CytC/Apaf-1途徑中，XIAP直接與caspase9酶原結合，抑制caspase9活化；又結合caspase3，抑制caspase3作用。

（2）作用于TNFR介導的信號傳導通路，抑制細胞凋亡。作用：第70頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第71頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第五節細胞凋亡與疾病

細胞增殖過快及凋亡過少均在腫瘤的發生中起了重要作用P53突變，Bcl-2的高表達在許多腫瘤中都存在第72頁,共117頁，2024年2月25日，星期天CarcinogensMutatep53BladderBloodBrainBreastColonEsophagusLiverLungSpleenThyroidCancerTypesChemicalsVirusesRadiationMutatep53Gene第73頁,共117頁，2024年2月25日，星期天正常機體細胞生長與死亡的平衡生長壞死、凋亡正常機體細胞凋亡與疾病第74頁,共117頁，2024年2月25日，星期天凋亡相對不足腫瘤、自身免疫性疾病、病毒感染等第75頁,共117頁，2024年2月25日，星期天

腫瘤

腫瘤的重要發病機制:

細胞增殖過度

細胞凋亡受抑、死亡不足病變組織內細胞存活>死亡,腫瘤細胞數目的凈增長加大可能機制：Bcl-2高表達、IAPs高表達，P53基因突變從發病學上，細胞凋亡實際是機體天然的抗癌機制之一第76頁,共117頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡過度神經退行性疾病、造血衰竭性疾病、心肌缺血/再灌注損傷第77頁,共117頁，2024年2月25日，星期天

心血管疾病心肌缺血、缺血-再灌傷所致心肌細胞死亡：

壞死和凋亡

可能機制：氧化應激、鈣超載、p53基因激活

心肌細胞凋亡造成心肌細胞數量減少也可能是心力衰竭發生、發展的主要原因之一細胞凋亡過度第78頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第四節細胞凋亡的檢測方法

一、形態學檢測（一）HE染色（二）透射電鏡觀察（三）熒光顯微鏡觀察第79頁,共117頁，2024年2月25日，星期天透射電鏡觀察

凋亡早期，染色體核邊集，在核膜周圍邊聚形成新月體形，隨之染色體發生固縮，呈電子密度增強，核形不規則。核膜表面凹凸不平，核發生碎裂。細胞體積變小，細胞漿濃縮，其內的細胞器保存較好，或輕度增生。線粒體數目輕度增加和輕度腫脹，細胞漿可見空泡增多，細胞膜保持完整。細胞膜表面微茸毛和偽足減少或消失。凋亡晚期，可見膜包裹內有較完整細胞器和細胞核碎片的凋亡小體。

第80頁,共117頁，2024年2月25日，星期天apoptosis概述第81頁,共117頁，2024年2月25日，星期天熒光顯微鏡觀察fluorescentmicroscope

Hoechst33258,Hoechst33342,均為DNA特異性染料，與AT鍵結合，在pH2.0時優先與RNA結合，染色DNA時應調pH7.0。染料不溶于磷酸緩沖液，所以配制時先必須用蒸餾水溶解，4℃避光保存。染料對死細胞或70％冷乙醇處理的細胞可立即染色，對活細胞的染色是漸進的，在10min內可達到飽和。第82頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第83頁,共117頁，2024年2月25日，星期天

第84頁,共117頁，2024年2月25日，星期天二、生化檢測

（一）瓊脂糖凝膠電泳

（二）原位末端標記技術

第85頁,共117頁，2024年2月25日，星期天（一）瓊脂糖凝膠電泳

原理：染色體從核小體間斷裂，為180－200bp或其倍數組成的寡核苷酸片段。通過提取DNA，電泳，UV下，可見DNALadder。觀察：凋亡細胞Ladder

壞死細胞Smear

第86頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第87頁,共117頁，2024年2月25日，星期天操作：收集細胞，PBS洗滌細胞裂解液

酚抽提氯仿異戊醇抽提

無水乙醇沉淀

TE溶解

電泳觀察第88頁,共117頁，2024年2月25日，星期天觀察：凋亡細胞Ladder

壞死細胞Smear壞死凋亡12345M789Marker10000bp，7500bp，5000bp，2500bp，1000bp，250bpDNA電泳第89頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第90頁,共117頁，2024年2月25日，星期天（二）原位末端標記技術

原位末端標記是：將滲入到凋亡細胞的外源性核苷酸（生物素標或熒光標）在末端脫氧核苷酸轉移酶的作用下，與斷裂的ssDNA或dsDNA聚合，再通過顯色系統顯示。通常的方法是：末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（terminaldeoxynucleotidyltransferasemediateddUTPnickendlabeling,稱TUNEL）第91頁,共117頁，2024年2月25日，星期天常用的標記和顯色系統：

生物素標記的dUTP

地高辛標記的dUTP

熒光素標記的dUTP

顯色系統：

辣根過氧化物酶標記的抗生物素抗體和DAB,

辣根過氧化物酶標記的抗地高辛抗體和DAB,熒光素標記的dUTP(FITC-dUTP)，流式細胞儀或熒光顯微鏡觀察。

第92頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第93頁,共117頁，2024年2月25日，星期天該技術不能區分凋亡、壞死、自溶性死亡的細胞，必須結合凋亡細胞的形態學特征加以判斷：

凋亡細胞成單個或少數幾個孤立地分布在組織中；

具有凋亡細胞的核特征，核固縮，顯一個或多個染色體團塊，或凋亡小體；

周圍或局部無炎癥反應。

第94頁,共117頁，2024年2月25日，星期天第95頁,共117頁，2024年2月25日，星期天三、流式細胞儀檢測flowcytometer（一）PI單染

（二）Hoechst33342/PI雙染色

（三）Annexinⅴ/PI雙染色第96頁,共117頁，2024年2月25日，星期天流式細胞儀

flowcytometer

熒光激活細胞分類器fluorescentactivatedcellsorter,FACS

Hoechst33342是雙苯并咪唑家族成員，能特異性與DNA螺旋小溝中AT結合。它能被活細胞攝入，也能在攝入后被細胞排出。活細胞對碘化丙錠（PI），溴化乙錠（EB）有拒染性，當細胞被這些染料著染，提示為晚期凋亡或壞死。第97頁,共117頁，2024年2月25日，星期天（一）PI單染

細胞凋亡之初，由于核酸內切酶的激活，將DNA從核小體間切斷，產生游離寡核苷酸片段。這些片段彌散到胞漿中，但是細胞膜完整，不能離開細胞。乙醇固定，PBS洗滌，使細胞膜通透性增加，并從細胞漿彌散出胞外。但是大分子DNA在胞內，不能被抽提。壞死細胞中，DNA可染性并不立即下降，甚至反而增加，可能是由于細胞壞死時部分DNA變性，引起更多的可染位點。

原理：第98頁,共117頁，2024年2月25日，星期天

收集細胞

，PBS洗滌

冷70％乙醇固定12h以上

離心，PBS洗滌，400目篩網過濾

PI（含RNase）染色

流式細胞儀檢測

操作：第99頁,共117頁，2024年2月25日，星期天判斷：在直方圖上，Go/G1期前有一個亞二倍體峰。

（檢測晚期凋亡，但不能判斷是晚期凋亡還是壞死）

AB第100頁,共117頁，2024年2月25日，星期天PI單染檢測細胞周期改變

細胞周期分析第101頁,共117頁，2024年2月25日，星期天（二）Hoechst33342/PI雙染色

染料配制：Hoechst33342：配10ug/ml,4℃避光保存。

PI：5ug/ml,4℃避光保存。

第102頁,共117頁，2024年2月25日，星期天原理：

凋亡細胞膜在早期是完整的，但細胞膜的通透性已有增加，因此進入早期凋亡細胞的Hoechst比正常細胞多；而EB、PI等不能進入凋亡細胞。即正常細胞不經固定，對EB、PI是拒染的。而壞死細胞早期就被破壞，能被這些染料染色。第103頁,共117頁，2024年2月25日，星期天操作：懸浮細胞＋Hoechst33342，終濃度1ug/ml,

貼壁細胞消化后，培養液重懸，加Hoechst，

37℃,7-10min，離心，洗滌，加

PI，4