關于血清球蛋白的分離純化實驗六實驗原理1.了解并初步掌握鹽析法分離、純化蛋白質的原理。2.熟悉鹽析法分離、純化蛋白質的方法。

第2頁,共12頁，2024年2月25日，星期天實驗原理（一）蛋白質鹽析在水溶液中，蛋白質分子由于表面生成水化層和同性電荷層而成為穩定的親水膠體顆粒，因此蛋白質在水溶液中比較穩定而不易沉淀。

當加入較高濃度的中性鹽時，這些鹽類與水有親和性，與蛋白質爭奪水分，破壞蛋白質顆粒表面的水化膜。同時，由于這些鹽是強電解質，離子濃度相對的比較高，可以大量中和蛋白質顆粒上的電荷，這樣使蛋白質成了既不含水膜又不帶電荷的不穩定顆粒而容易沉淀，這就是利用鹽析沉淀蛋白質的基本原理。第3頁,共12頁，2024年2月25日，星期天由于血清中各種蛋白質所帶電荷多少、顆粒大小及親水程度都不一樣，因此使用某種中性鹽進行鹽析時，所需要的鹽濃度也各不相同。50%飽和度的硫酸銨能使血清中的球蛋白沉淀，而33％飽和度的硫酸銨則使γ-球蛋白沉淀。可根據所要分離的蛋白質，選擇不同飽和度的硫酸銨溶液進行鹽析。

第4頁,共12頁，2024年2月25日，星期天（二）濃縮

一般實驗室常用的是透析袋（半透膜）濃縮。半透膜具有選擇透過性，只允許離子和小分子擴散進出，生物大分子（蛋白質等）不能自由通過半透膜。將待濃縮的蛋白質溶液放入透析袋內，用繩子扎緊，然后置于燒杯中。第5頁,共12頁，2024年2月25日，星期天實驗試劑與器材試劑：(1)小牛血清

(2)PBS（pH7.2磷酸鹽緩沖生理鹽水）

(3)3%BaCl2溶液

(4)pH7.2飽和硫酸胺溶液器材：(1)離心管

(2)離心機

(3)移液管

(4)透析袋

第6頁,共12頁，2024年2月25日，星期天實驗步驟（一）鹽析——中性鹽沉淀離心管加入血清2ml+2mlPBS

搖勻逐滴加入pH7.2飽和硫酸胺溶液7ml邊加邊搖靜置10min離心（3000轉/分）10min棄上清液沉淀+1.0mlPBS使之溶解逐滴加飽和硫酸胺1.5ml搖勻靜置10min離心（3000轉/分）10min棄上清液沉淀（γ－球蛋白）第7頁,共12頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共12頁，2024年2月25日，星期天第9頁,共12頁，2024年2月25日，星期天（二）濃縮將上述收集的蛋白質+1mlPBS，沉淀完全溶解后，放入透析袋內，用繩子扎緊，然后置于100ml燒杯中，加入純凈水。3~5min后，取1ml燒杯中溶液至試管中，再滴加BaCl2若出現白色混濁，將燒杯中的水倒掉，再換上純凈水。直至滴加BaCl2溶液不再出現白色混濁為止。

第10頁,共12頁，2024年2月25日，星期天注意事項1.在鹽析時，飽和硫酸銨應逐滴加入，速度不能過快，一定要邊滴加邊攪拌，以減少局部高濃度硫酸銨所引起的共沉現象，攪拌速度不宜過快，以免產生過多泡沫，致使蛋白質變性。2.硫酸銨濃度越高越容易沉淀。但濃度過高容易引起其他雜蛋白的共沉作用，因此必須根據分離蛋白的濃度要求，控制適當的蛋白質濃度。3.離心時應平衡放置離心管。

4.濃縮時，滴加BaCl2前，先取出透析袋再滴加。5.更換蒸餾水的目的，是為了增大半透膜兩邊