真核生物系統(tǒng)生物技術(shù)應(yīng)用－1（一）生物技術(shù)與種植業(yè)什么是植物生物技術(shù)？植物生物技術(shù)是在植物細胞和分子水平修飾和改造遺傳性狀的生物技術(shù)，主要包括植物基因工程、植物細胞工程等。是生物技術(shù)中除醫(yī)藥生物技術(shù)外另一個最受矚目的學(xué)科。全球人口的增長上圖中描繪了新石器革命(約公元前l(fā)0000年)和工業(yè)革命(約于1760年在英格蘭開始)之后世界人口的急劇增長及其繼續(xù)趨勢。上世紀(jì)后半葉人口爆炸已導(dǎo)致了第三世界人口稠密國家過分擁擠和營養(yǎng)不良。使糧食產(chǎn)量的顯著增長不能適應(yīng)人口的增加．這主要是由于上世紀(jì)70年代初期以來很高的人口增長比率。到2005年，世界人口的增長從l983年的47．2億增加到60億，而到2025年，全球人口將達到80億。世界糧食危機目前40個國家需要國際糧食援助。未來糧食產(chǎn)量劇增的前景希望很小，因為大部分可耕地在亞洲季風(fēng)區(qū)己被開發(fā)和利用。未開發(fā)的有潛力可用的土地僅在巴西和非洲的一些部分被發(fā)現(xiàn)。滿足全球的糧食需求，只能靠提高作物的單產(chǎn)量來實現(xiàn)。氣候變化的挑戰(zhàn)氣候變化使全球農(nóng)業(yè)糧食產(chǎn)量下降，2004－2006，每年12－15％。世界的谷物庫存率在1999年時為31.6%，至2006年已降至15.5%，約50天。氣候變暖可能使土豆和花生等農(nóng)作物的野生親緣植物滅絕，給幫助這些農(nóng)作物抵抗害蟲和干旱的寶貴基因源帶來威脅。未來50年，51種野生花生中有超過60%會滅絕，108種野生土豆中12%會滅絕。為什么要發(fā)展植物生物技術(shù)？植物生物技術(shù)能夠突破天然種間屏障進行的雜交,針對某種特性，以突變、植入外源基因或改變基因表現(xiàn)等生物技術(shù)方式，進行遺傳物質(zhì)的修飾，進而降低生產(chǎn)成本，加快植物生長速度、增強對環(huán)境的抗性等，為培育優(yōu)良作物新品種帶來希望。

（一）植物基因工程一、植物基因工程的基本原理植物基因工程，也稱轉(zhuǎn)基因技術(shù)（geneticmodification,GM），是在分子水平對植物基因進行操作的技術(shù)。它通過基因工程手段，利用特定的載體將外源的基因轉(zhuǎn)移到受體植物中，改造植物的遺傳物質(zhì)，達到改良生物性狀或獲得有用基因產(chǎn)物的目的。通俗的說，轉(zhuǎn)基因(transgene)就是一種生物體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移到另一種生物或同種生物的不同品種中的過程。

人們對植物進行遺傳轉(zhuǎn)化的最終目的是讓外源基因在受體植物基因組中得到穩(wěn)定整合并在當(dāng)代及其子代中得到有效、穩(wěn)定的表達。一般來講，獲得轉(zhuǎn)基因植物主要分為三個步驟：

1、目的基因的獲得：以人工方法在現(xiàn)有的生物中分離和克隆所需要的目的基因，或人工合成目的基因。

2、外源基因的轉(zhuǎn)化和整合：外源基因通過載體、媒體或其它物理化學(xué)方法導(dǎo)入植物細胞并得到整合和表達的過程。

1）基因從一種生物體內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種生物體內(nèi)需要一定的載體。現(xiàn)有質(zhì)粒載體、病毒載體、脂質(zhì)載體、原生質(zhì)載體等多種方法；其中以質(zhì)粒載體最為常見。

2）植物基因的遺傳轉(zhuǎn)化是指將外源DNA通過載體、媒體或其他物理、化學(xué)方法導(dǎo)入植物細胞并得到整合和表達的過程。實現(xiàn)這一轉(zhuǎn)化的途徑稱之為轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。外源DNA通過載體介導(dǎo)實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)稱之為基因載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

目前已經(jīng)建立了十余種基因轉(zhuǎn)化方法，常見的方法包括：

（1）土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法：

幾乎所有雙子葉植物都容易受到土壤農(nóng)桿菌（A.tumefaciens）感染，而產(chǎn)生根瘤。其致瘤特性由Ti（tumor－inducing）質(zhì)粒介導(dǎo);Ti質(zhì)粒大約在160～240kB之間。其中T-DNA大約在15kb-30kb;T-DNA的整合機制表達載體pBIn19的結(jié)構(gòu)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法的優(yōu)缺點操作簡便、成本低、轉(zhuǎn)化率高，廣泛應(yīng)用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化；單雙子葉植物受限制；

蘇云金桿菌的δ-內(nèi)毒素蘇云金桿菌在孢子形成的過程中，細胞內(nèi)形成殺蟲晶體蛋白—稱為δ-內(nèi)毒素，其活性很強，有時要比有機磷毒性高80000倍，而且選擇性很強，不同品系的細菌和成不同的毒蛋白。在細菌中積累的δ-內(nèi)毒素是無活性的前體，昆蟲食用后，前毒素被蛋白酶消化后產(chǎn)生有毒性的蛋白，結(jié)合到昆蟲腸道內(nèi)，破壞表皮細胞，使昆蟲不能進食，從而饑餓而死。不同昆蟲中，晶體結(jié)構(gòu)不同產(chǎn)生了特異性。蘇云金芽胞桿菌（BT）毒素蛋白CryI鱗翅目幼蟲CryII鱗翅目和雙翅目幼蟲CryIII鱗翅目CryIV雙翅目CryV線蟲綱CryVI線蟲綱蘇云金芽胞桿菌（BT）毒素蛋白基因

(2)基因槍法（biolistics）也稱微粒轟擊法（microparticlebombardment）

基因槍法最早是由Cornell大學(xué)研制的火藥基因槍。1990年，美國杜邦公司推出了商品基因槍PDS-1000系統(tǒng)。基因槍的組成部分有：點火裝置、發(fā)射裝置、擋板、樣品室、真空系統(tǒng)組成。基因槍轉(zhuǎn)化的基本步驟如下：

DNA微彈的制備

DNA-微彈載體的制備

靶外植體準(zhǔn)備

DNA微彈轟擊

轟擊后外植體的培養(yǎng)

基因槍法的優(yōu)缺點無宿主限制，受體類型廣泛，原生質(zhì)體、葉圓片、懸浮培養(yǎng)細胞、莖、根、以及種子的胚、分生組織等幾乎所有具有分生潛力的組織或細胞都可以；可控度高，商品化的基因槍都可以根據(jù)實驗需要調(diào)控微彈的速度和射入濃度，命中特定層次的細胞；操作簡便迅速；缺點：相對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化率要低得多，而且基因槍轉(zhuǎn)化成本高；嵌合體比率大；遺傳穩(wěn)定性差；（3）電激法(electroporation)：利用高壓電脈沖的電激作用將外源基因?qū)胫参锛毎霓D(zhuǎn)化方法。（4）花粉管導(dǎo)入法：即利用花粉管通道，將外源DNA注入進入胚囊，轉(zhuǎn)化受精卵或其前后的細胞(卵、早期胚細胞)，并自然發(fā)育成種子。花粉管通道法不僅可以用于外源總DNA的導(dǎo)入，也可以用于基因的導(dǎo)入，有方法簡便，基因轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點。

3.轉(zhuǎn)基因植物的培育及傳代：篩選和培養(yǎng)含有外源基因的細胞或組織，通過細胞或組織培養(yǎng)技術(shù)再生成健康的轉(zhuǎn)基因植物，再通過有性繁殖將優(yōu)良性狀傳遞給下一代。

二、轉(zhuǎn)基因植物的主要種類及地區(qū)分布

自1983年首次獲得轉(zhuǎn)基因煙草、馬鈴薯以來，迄今為止，國際上獲得轉(zhuǎn)基因植株的植物已達120種以上。而自1986年首批轉(zhuǎn)基因植物被批準(zhǔn)進入田間試驗，2002年9月國際上已有50個國家批準(zhǔn)超過2萬例轉(zhuǎn)基因植物進入田間試驗，涉及的植物種類有60多種。1994年首例轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品（耐儲存番茄）在美國獲準(zhǔn)進入市場，轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)業(yè)化取得了突破性進展，各國批準(zhǔn)的上市的轉(zhuǎn)基因植物品種已超過100個（次）。1996年轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物開始大規(guī)模種植，到2008年已增長80多倍，主要品種包括大豆、玉米、棉花和油菜，主要涉及抗蟲和抗除草劑特性，分布于25個國家，但歐洲僅德國、西班牙和保加利亞有少量種植。

全球轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的銷售額1998年為15－30億美元，2000年為30億美元，2002達到50億美元，2008年達69億美元，2010年可達到100億美元。2001年各國種植轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物面積國家主要轉(zhuǎn)基因作物面積萬公頃比例％美國大豆、玉米、棉花、油菜35.768阿根廷大豆、玉米、棉花等11.822加拿大大豆、玉米、棉花、油菜3.26中國棉花1.53南非大豆、玉米、棉花等0.2墨西哥大豆、棉花等0.2其它大豆、玉米、棉花等－－2004年各國種植轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物面積(ISAAA)國家主要轉(zhuǎn)基因作物面積（100萬公頃）年增％美國大豆、玉米、棉花、油菜47.611阿根廷大豆、玉米、棉花等16.217加拿大大豆、玉米、棉花、油菜5.4023中國棉花3.732南非大豆、玉米、棉花等0.7525西班牙大豆、棉花等0.588018國81.020全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植面積全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物銷售額及預(yù)測我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀分析：我國是棉花生產(chǎn)大國，棉鈴蟲病持續(xù)大爆發(fā)，1997年以前年經(jīng)濟損失50－100億，而棉農(nóng)大量使用農(nóng)藥，嚴(yán)重污染環(huán)境。1997年以來，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花逐步推廣，棉鈴蟲病基本得到控制。我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花種植面積我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花效益分析2002年推廣種植抗蟲棉花252萬公頃效益：增產(chǎn)、減少使用農(nóng)藥及勞動力，每畝約140元，經(jīng)濟效益達55億元。社會效益轉(zhuǎn)基因大豆在中國1995年，我國大豆對外依存度只有7%左右，2005年已經(jīng)上升到60%~70%。2008年，中國進口大豆達到3744萬噸，自產(chǎn)大豆約1650萬噸，進口大豆占總供應(yīng)量的比例達到69%。中國對進口大豆的需求未來幾年內(nèi)預(yù)計還將持續(xù)增加。轉(zhuǎn)基因大豆在中國“東北地區(qū)產(chǎn)非轉(zhuǎn)基因大豆與進口轉(zhuǎn)基因大豆正在展開一場戰(zhàn)爭”;東北是我國大豆的主產(chǎn)區(qū)，但今年以來黑龍江、吉林和遼寧三省的大豆進口量均出現(xiàn)了激增。一季度，上述三個省份分別進口大豆44.1萬噸、37.3萬噸和28萬噸，同比增幅分別達到了84.5倍、2.6倍和1.6倍。進口大豆3000-3500元/噸；國產(chǎn)大豆收購價3400元/噸。三、轉(zhuǎn)基因植物的安全性

轉(zhuǎn)基因植物的安全性評價是指對重組DNA導(dǎo)入植物體內(nèi)所獲得的遺傳工程體及其產(chǎn)品對人類健康、人類賴以生存的環(huán)境、農(nóng)業(yè)生態(tài)平衡等方面可能造成的影響進行安全性預(yù)測和評價。對于轉(zhuǎn)基因生物的疑慮主要有兩個方面，一是對人體健康是否有害，即食品的安全性；二是對生態(tài)環(huán)境是否構(gòu)成潛在威脅，即環(huán)境的安全性。

1、基因植物的食品安全性評價

對于轉(zhuǎn)基因植物的食品安全性評價，世界上多數(shù)國際采用經(jīng)濟合作發(fā)展組織（OrganizationofEconomicCo-operationandDevelopment,OECD）1993年提出的實質(zhì)等同性（substantialequivalence）原則。轉(zhuǎn)基因植物及其加工食品的安全性（1）轉(zhuǎn)基因作物安全性爭議的幾大事件：1995加拿大“超級雜草”事件：轉(zhuǎn)基因油菜；1998年蘇格蘭“馬鈴薯”事件：轉(zhuǎn)基因馬鈴薯引起老鼠器官發(fā)育異常？1999美國“斑蝶”事件：《自然》論文，斑蝶食用轉(zhuǎn)Bt玉米花粉后，44％死亡，破壞生態(tài)？2002中國轉(zhuǎn)Bt棉事件：破壞農(nóng)田昆蟲生態(tài)？（1）如果轉(zhuǎn)基因食品與傳統(tǒng)食品具的實質(zhì)等同性，則認為是安全的。

（2）如果轉(zhuǎn)基因食品與傳統(tǒng)食品除引入的新性狀外具有實質(zhì)等同性，則需時行嚴(yán)格的安全性狀價。

（3）如果轉(zhuǎn)基因食品與傳統(tǒng)食品不具有實質(zhì)等同性，則應(yīng)從營養(yǎng)性和安全性角度進行全面分析。

在對轉(zhuǎn)基因的食品進行實質(zhì)等同性評價時，一般應(yīng)主要考慮以下幾個方面：首先是有無毒性，轉(zhuǎn)基因植物必須確保轉(zhuǎn)入的外源基因或基因產(chǎn)物對人畜無毒。其次是有無過敏性。另外還要考慮營養(yǎng)物質(zhì)、抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量及標(biāo)記基因的安全性等。

2.轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全性

對轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全性評價的核心問題是轉(zhuǎn)基因植物釋放到田間去是否會將基因（包括轉(zhuǎn)基因）轉(zhuǎn)移到野生植物中，或是否會破壞自然生態(tài)環(huán)境，打破原有生物種群的動態(tài)平衡。

轉(zhuǎn)基因作物的潛在風(fēng)險（1）轉(zhuǎn)基因作物可能變?yōu)殡s草；（2）轉(zhuǎn)基因作物使野生近緣種變?yōu)殡s草；（3）可能產(chǎn)生新的病害；（4）轉(zhuǎn)基因作物對環(huán)境生態(tài)的長期破壞；（5）對非目標(biāo)生物的傷害等。選擇性標(biāo)記的安全性大部分植物載體含有kan抗性基因，以便篩選轉(zhuǎn)基因植株。kan抗性基因，又稱為nptII，來自于細菌編碼新霉素轉(zhuǎn)移酶II，擔(dān)憂：

1）食品中的kan抗性基因是否能傳給人體腸道中的細菌，產(chǎn)生對抗生素的抗性。

2）kan抗性基因能否傳給環(huán)境中的其他生物，導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)的破壞；轉(zhuǎn)基因食品通過人體的消化道與腸道中的細菌接觸之前kan抗性基因已經(jīng)被破壞，轉(zhuǎn)化到細菌的機會也非常少；然而危險因素并不等于0；去除標(biāo)記基因利用噬菌體P1含有Cre基因，它識別一個34kb的跨越序列，并可以將中間序列切除；利用這一系統(tǒng)，必須使用兩個克隆載體進行轉(zhuǎn)化，其中一個含有目的基因及選擇標(biāo)記基因，選擇標(biāo)記基因兩端被Cre靶序列包圍；另一個載體含有Cre基因，轉(zhuǎn)化完成后，Cre基因的表達可以將kan抗性基因從植物中切除；利用Cre系統(tǒng)去除標(biāo)記基因

3．國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因植物的安全性評價概況

歐洲政壇和媒體普遍持懷疑態(tài)度；

1999年歐盟7國決定，暫停研發(fā)新的轉(zhuǎn)基因食品；歐洲環(huán)保分子經(jīng)常發(fā)生毀壞轉(zhuǎn)基因作物試驗田事件；美國、加拿大的民眾73％的消費者接受轉(zhuǎn)基因食品；美國60％的加工食品中含轉(zhuǎn)基因成分；2000年美、中、印、巴等科學(xué)院發(fā)表白皮書支持；四、轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用

1、植物病毒抗性2、細菌及真菌抗性3、植物的抗逆性4、植物的性狀改良5、轉(zhuǎn)基因花卉

抗病毒植物I病毒外殼蛋白基因

Cp基因可能以下述作用方式使植物獲得保護：（1）當(dāng)裸露的病毒遺傳物質(zhì)進入植物細胞后，立即被外殼蛋白包裝，阻止病毒核酸的翻譯與復(fù)制。（2）在Cp水平上阻止病毒脫殼。TMV外殼蛋白CP的轉(zhuǎn)基因煙草植物，該轉(zhuǎn)基因植物在TMV存在條件下，能抗病毒感染30天左右，正常植物3~4天之后使被TMV感染。馬鈴薯、番茄、苜蓿、番木瓜等也已成功；

轉(zhuǎn)TMV外殼蛋白CP的煙草植物抗病毒植物II轉(zhuǎn)表達復(fù)制酶亞基反義基因的植物：

將TMV5'端基因片段（含復(fù)制酶亞基因）作為目的基因，成功地構(gòu)建了其反義基因的轉(zhuǎn)煙草植株。實驗結(jié)果表明，病毒RNA的合成抑制了25~50倍。系統(tǒng)的病毒侵染癥狀特征消失或大量減少。

此外，衛(wèi)星RNA、核糖體失活蛋白基因、干擾素也成功的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因抗病毒植物的培育。延遲果實成熟轉(zhuǎn)基因番茄

多聚半乳糖醛酸酶番茄從開花到收獲需要大約8周的時間，第6周開始，果實的顏色和風(fēng)味開始變化，此時成熟過程的基因開始啟動，包括多聚半乳糖醛酸酶，使果實開始軟化。運輸過程中，造成傷害，降低了商品品質(zhì)。利用反義RNA延遲番茄果實的成熟從正常多聚半乳糖醛酸酶基因的5’端獲得了一個730bp的限制性片斷，包含了一半的編碼序列，將植物的多腺苷酸化信號連接到片段的頭部，CaMV啟動子連接到尾部，插入Ti質(zhì)粒pBIN19中。引入植物后，轉(zhuǎn)錄后形成了反義RNA。降低了多聚半乳糖醛酸酶基因的表達。實驗的結(jié)果通過4個途徑分析1

）Southern雜交檢測反義基因；2

）

利用只能與反義RNA雜交的單鏈探針，Northern雜交檢測反義基因的轉(zhuǎn)錄；3

）檢測轉(zhuǎn)基因植株的多聚半乳糖醛酸酶mRNA的表達量明顯低于對照；4

）聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示，多聚半乳糖醛酸酶的表達量明顯降低；轉(zhuǎn)基因果實雖然也在逐漸的成熟，但可以存放很長的時間。這意味著反義RNA雖然不能完全將多聚半乳糖醛酸酶基因失活，但可以有效的降低基因的表達量，延緩成熟過程。多聚半乳糖醛酸酶的活性檢測抗蟲基因作用機制轉(zhuǎn)基因作物的舉例Bt（蘇云金芽孢桿菌，Bacillusthuringiensis）毒蛋白基因Bt毒蛋白基因合成一種對昆蟲有毒的內(nèi)毒素蛋白。這種殺蟲蛋白可以使害蟲消化道產(chǎn)生穿孔，從而導(dǎo)致其死亡，而對人畜在內(nèi)的高等動物無任何毒副作用。玉米、棉花、馬鈴薯等蛋白酶抑制劑（proteinaseinhibitor,PI）基因用含PI的植物材料或飼料飼喂昆蟲后，PI與消化酶（主要為蛋白酶）結(jié)合抑制消化酶功能而PI本身則不被降解，嚴(yán)重干擾了昆蟲的消化系統(tǒng)，使其生長發(fā)育受到嚴(yán)重抑制，最后導(dǎo)致死亡。大豆、玉米、棉花油菜、、馬鈴薯、番茄等外源凝集素（lectin）基因外源凝集素會在昆蟲的消化道內(nèi)釋放出來，并與腸道圍食膜上的糖蛋白相結(jié)合，影響營養(yǎng)物質(zhì)的正常吸收。同時，還可能在昆蟲的消化道內(nèi)誘發(fā)病灶，促進消化道內(nèi)細菌的增殖，對害蟲本身造成為害，達到殺蟲的目的。油菜、西紅柿、水稻、甘蔗、甘薯、向日葵、煙草、馬鈴薯、大豆、葡萄等膽固醇氧化酶基因（cholesteroloxidase,Cho）Cho也被稱為第二代抗蟲基因，其表達的產(chǎn)物是一類新型殺蟲劑。膽固醇氧化酶屬于乙酰膽固醇氧化酶家族的成員，可催化膽固醇形成17-酮類固醇和過氧化氫。膽固醇是細胞膜的主要組分，伴隨著上述反應(yīng)，昆蟲攝食后其腸道表皮細胞出現(xiàn)胞溶現(xiàn)象，導(dǎo)致昆蟲死亡。棉花、煙草等抗除草劑基因

抗EPSPS(5-enolpyrvylshikimicacid-3-phosphatesynthase)抑制劑基因

草甘磷類除草劑可破壞植物體內(nèi)的莽草酸代謝關(guān)鍵酶EPSPS導(dǎo)致植物死亡。抗EPSPS抑制劑基因所產(chǎn)生的酶分子由于點突變，對草甘磷類除草劑不敏感。大豆、玉米、棉花、油菜等膦絲菌素（phosphinothricin,PPT）乙酰轉(zhuǎn)移酶基因PPT除草劑是谷氨酰胺合成酶的抑制劑，可導(dǎo)致植物細胞內(nèi)氨的大量積累而死亡。PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT）可催化PPT的游離氨基乙酰化而解毒，大豆、油菜、甜菜、馬鈴薯、番茄等腈水解酶（nitrilase）基因溴苯腈（bromoxynil）是一種抑制植物光合作用的除草劑。腈水解酶可使溴苯腈失去活性，使轉(zhuǎn)基因植物對PPT產(chǎn)生抗性。棉花、油菜、煙草等RoundupReady?

轉(zhuǎn)抗除草劑基因的

大豆和玉米蘇云金芽胞桿菌（BT）毒素蛋白基因抗病基因＋抗蟲基因＋優(yōu)質(zhì)基因轉(zhuǎn)BT基因水稻抗稻縱卷葉螟植物生物反應(yīng)器利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)及其它