關于重組克隆的單元操作本章節內容DNA重組的載體(裝載DNA的工具）DNA的體外重組（切、連）重組DNA分子的轉化與擴增（轉、增）轉化子的篩選與重組子的鑒定（檢測）目的基因的克隆（供體中的目標DNA的克隆）第2頁,共145頁，2024年2月25日，星期天第一節DNA重組的載體質粒載體λ雙鏈噬菌體DNA載體M13單鏈噬菌體DNA載體噬菌體-質粒雜合載體第3頁,共145頁，2024年2月25日，星期天載體的功能為外源基因提供進入受體細胞的轉移能力為外源基因提供在受體細胞中的復制、擴增或整合能力（指DNA拷貝數的增加）（所有載體必須具備的能力）為外源基因提供在受體細胞中的表達能力（指基因的表達，使外源基因通過mRNA和蛋白質在受體細胞中發揮功能，進而可發現基因在生物體內發揮的作用）。第4頁,共145頁，2024年2月25日，星期天載體必須具備的三個條件具有復制原點或整合位點，能使外源基因在受體細胞中穩定遺傳。既有多種單一的核酸內切酶的識別切割位點（多克隆位點，multi-clonesite,MCS)。具有合適的選擇性標記，便于重組DNA分子的檢測。第5頁,共145頁，2024年2月25日，星期天一、質粒載體（一）質粒的基本性質存在于細菌或真菌的細胞質粒是染色體外穩定遺傳的復制體，其特點共價、閉環，雙鏈DNA分子（covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)。大多數質粒具有復制原點，能獨立進行復制，不依賴寄主的細胞復制周期質粒第6頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（一）質粒的基本性質質粒通常賦予寄主一些表型特征，如抗生素抗性等。選擇性標記(selectablemarker):由于質粒攜帶的基因，可供實驗室條件下進行選擇的一些標記。如抗性，營養元素的利用等。顯性質粒與隱性質粒.一、質粒載體第7頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（一）質粒的基本性質1、質粒的自主復制性：含有Ori或replicon質粒在特定的宿主細胞中維持恒定的拷貝數。A、反義RNA進行調控的機制B、關鍵蛋白與重復區域結合進行調控的機理一、質粒載體第8頁,共145頁，2024年2月25日，星期天A、反義RNA進行調控的機制（plasmidColE1）RopdimerPRNAIIRNAIIa、在復制起點處，RNAII（長555個堿基）與質粒DNA形成RNA-DNA復合物，RNA酶H可降解RNAII，露出3’自由羥基，質粒復制起始。在該區域還能反向轉錄形成RNAI，I和II為互補的RNA。第9頁,共145頁，2024年2月25日，星期天B、如果RNAI和RNAII形成雙鏈RNA螺旋，RNA酶H不能降解RNAII，復制不能進行。RopdimerPRNAIIRNAII第10頁,共145頁，2024年2月25日，星期天c、當質粒的濃度比較高的時，Rop蛋白促進RNAI和RNAII形成雙鏈RNA螺旋，使質粒的復制不能起始。d、當質粒的比較低時，RNAII與質粒DNA形成RNA-DNA復合物，RNA酶H降解RNAII質粒復制起始。e、突變RNAI或去除Rop基因導致質粒的拷貝數增加。第11頁,共145頁，2024年2月25日，星期天B、關鍵蛋白與重復區域結合進行調控的機理（pS101質粒）a)

復制原點區域含有3～7拷貝的長度為17～22bp的重復區域，R1、R2、R3等。第12頁,共145頁，2024年2月25日，星期天B、關鍵蛋白與重復區域結合進行調控的機理

b)復制原點附近有一個編碼基因repA,編碼RepA蛋白。RepA是雙功能的蛋白：與復制原點區域的重復序列結合，起始DNA的合成；與自身基因的啟動子結合，抑制自身的轉錄。第13頁,共145頁，2024年2月25日，星期天質粒拷貝數由RepA蛋白濃度和質粒自身的濃度進行調節。

如果質粒拷貝數高，RepA蛋白與自身的啟動子區域結合，抑制轉錄，RepA蛋白合成受阻，DNA的復制受到抑制。RepA蛋白通過結合到兩個質粒的重復序列把它們連接起來，避免復制起始。細胞分裂后，拷貝數和RepA蛋白的濃度降低，RepA蛋白自身合成增加，結合到重復區域起始DNA的合成。B、關鍵蛋白與重復區域結合進行調控的機理

第14頁,共145頁，2024年2月25日，星期天問題：在寄主復制后，質粒是如何分配到子細胞中？

Par原件會附著在細胞膜上，隨著細胞的分裂，質粒正確分配到子細胞中，維持相對穩定的質粒拷貝數。第15頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（一）質粒的基本性質2、質粒的可擴增性（質粒的拷貝數）拷貝數：細胞中質粒的數量（摩爾數）與染色體DNA數量之比

嚴謹型:少數拷貝存在于細胞中（1~幾個）

松弛型:多個拷貝存在于細胞中（≥10）嚴謹型與松弛型是相對的。第16頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（一）質粒的基本性質3、不相容性在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關系密切的不同質粒，不能夠在同一寄主細胞系中穩定地共存的現象，稱為質粒的不相容性，或稱為不親和性（Plasmidincom-patibility)。這樣的兩種質粒稱為不親和質粒第17頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（一）質粒的基本性質引起質粒的不相容的機理

A具有相同的復制調控機制

B控制質粒分配的par元件相同,也會引起質粒的不相容不相容群：指那些具有不相容性的質粒組成的一個群體，一般具有相同的復制子ColE1/pMB1第18頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（一）質粒的基本性質4、質粒的可轉移性（p13)第19頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（二）、質粒的改造和構建天然的野生質粒一般不能直接用作克隆載體，需要改造1、刪除不必要的DNA序列，縮小質粒相對分子量，提高外源DNA片段的裝載量。2、滅活一些質粒的基因（如可轉移基因），保證重組實驗的安全；滅活質粒拷貝數的負控制基因，提高質粒的拷貝數。3、加入選擇性標記，便于重組子的檢測4、加入多克隆位點，便于外源基因的插入5、根據克隆的目的，加裝特殊的表達元件或便于蛋白純化的元件（GST標簽）第20頁,共145頁，2024年2月25日，星期天R7268ApRR1drd19ApRCmRSmRSuRKmRpMB3ApRpSF2124ApRpBR312ApRTcRpSC101TcR12pM88pMB9TcR34ColE1566pBR313ApRTcRpBR322ApRTcR78pMB1(b)例:第一個人工構建的遺傳載體pBR322第21頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（三）、質粒的分類及用途1、克隆質粒：能在宿主細胞中高拷貝存在（含有氯霉素可擴增的松弛型復制子或解除了對質粒拷貝數的負控制作用）。2、測序質粒:能高拷貝復制，含有MCS，含有通用的引物序列（如SP6，T7），能形成單鏈模板，便于測序反應的進行。3、整合質粒：含有整合酶編碼基因以及整合特異性位點序列，克隆在這種質粒上的外援基因進入受體細胞后，能準確重新整合在染色體DNA的特點位點上（如動物植物細胞中用于目的基因敲除的載體，見第五章、第六章）。第22頁,共145頁，2024年2月25日，星期天第23頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（三）、質粒的分類及用途4、穿梭載體（shuttlevector）質粒分子上含有兩個親緣關系不同的復制子以及相應的選擇性標記，能在兩種不同的受體細胞中復制并檢測。如大腸桿菌-酵母穿梭質粒。特點：克隆在這類載體上的外源基因不需要更換載體直接從一種受體菌轉入另一種受體菌復制并且遺傳。第24頁,共145頁，2024年2月25日，星期天三、質粒的分類及用途5、探針質粒：用來篩選克隆基因的表達調控元件。通常含有報告基因，但缺少相應的調控序列（如啟動子或終止子），只有含有啟動子或終止子的調控序列被克隆進入載體后，報告基因才能別表達，表達量的大小直接反應了克隆進入的調控元件的強弱。第25頁,共145頁，2024年2月25日，星期天無啟動子序列報告基因第26頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（三）、質粒的分類及用途6、表達質粒在多克隆位點的上下游分別裝有兩套轉錄效率較高的啟動子、合適的核糖體結合位點序列（SD）序列以及強有力的終止子結構，使得克隆在合適位點上的任何外源基因均能在受體細胞中高效表達。如pET載體。常用的載體見表格2-1（p16)第27頁,共145頁，2024年2月25日，星期天MCS復制原點選擇標記高效啟動子終止子序列核糖體結合位點第28頁,共145頁，2024年2月25日，星期天pGEM載體—克隆DNA的體外轉錄加入了兩個短片段，這兩個片段在限制性酶切位點的兩側，可被T7噬菌體的RNA聚合酶或SP6T7噬菌體的RNA聚合酶的識別方便了克隆DNA的體外轉錄，便于研究RNA加工，合成蛋白質等的研究等6、表達質粒第29頁,共145頁，2024年2月25日，星期天pGEM-3Z多拷貝裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標記lacZ’裝有兩個噬菌體的強啟動子用于外源基因的高效表達注意：T7和SP6啟動子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識別，因此相應的受體菌必須表達噬菌體RNA聚合酶，如E.coliBL21（DE3）等AproripGEM-3Z2743bplacZ’PT7MCSPSP6第30頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（四）、質粒DNA的制備1基于分子大小的分離2基于構象的分離質粒有三種構型cccDNA(共價閉環DNA)：DNA的兩條鏈都是完整的。ocDNA(開環DNA)：只有一條鏈是完整的。線性DNA：DNA的兩條鏈均被打開。多種細菌中存在線性的質粒DNA。但末端或是通過重復序列形成發卡結構或通過共價結合蛋白進行保護，避免核酸酶的降解。第31頁,共145頁，2024年2月25日，星期天超螺旋DNA松弛cccDNA開環DNA核酸內切酶DNA連接酶核酸內切酶DNA促旋酶拓撲異構酶第32頁,共145頁，2024年2月25日，星期天堿變性用CsCl-EB等密度離心UpperbandcontainingchromosomalDNAandopenplasmidcirclesLowerbandofcovalentlyclosedcirclesplasmidDNAEthidiumbromide(EB)電泳方向cccDNAL-DNAOC-DNACKRZ第33頁,共145頁，2024年2月25日，星期天總結質粒載體1、質粒載體的基本性質：自我復制能力、拷貝數的控制、嚴謹型和松弛型質粒、質粒的不相容性及機理2、質粒載體具備的特點3、質粒載體的分類：克隆載體、測序載體、穿梭載體、表達載體和探針載體等的特點第34頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（一）、噬菌體的生物學特征λ噬菌體顆粒中的DNA是一線性雙鏈DNA分子，長48502bp。基因簇集排列線λ噬菌體上有些基因可被取代而不影響其生活周期線性λ噬菌體兩端各有12個堿基的5’凸出黏性末端是互補的,該互補序列相互作用形成cos位點。

作用：進入細胞的λDNA通過兩端的黏性末端環化。

二、λ雙鏈噬菌體DNA載體第35頁,共145頁，2024年2月25日，星期天第36頁,共145頁，2024年2月25日，星期天第37頁,共145頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共145頁，2024年2月25日，星期天1、對野生λ噬菌體的改進

A、刪除多余的限制性內切酶的位點。

B、切除一些非必需序列，增加載體的容量。

C、設計陽性選擇重組子的方法。

D、發展可以使插入的真核cDNA與β－半乳糖苷酶形成融合蛋白的載體。

（二）、基于λ噬菌體的克隆載體第39頁,共145頁，2024年2月25日，星期天2、λ噬菌體基因組可刪除的部分不影響生存能力λ噬菌體基因組中可以刪除的序列與噬菌體進入從裂解狀態進入溶源狀態以及從溶源狀態進入裂解狀態有關，即與噬菌體整合和脫離大腸桿菌的染色體相關刪除了這部分序列的噬菌體只能進行裂解循環（二）、基于λ噬菌體的克隆載體第40頁,共145頁，2024年2月25日，星期天3、重組噬菌體的鑒別（1）lacZ′基因功能選擇方法類似于質粒中的藍白斑篩選（2）cI基因功能選擇法cI插入失活的噬菌斑是“清澈”的，而野生型正常的噬菌斑是“渾濁”的渾濁清亮第41頁,共145頁，2024年2月25日，星期天3、重組噬菌體的鑒別（3）Spi-（sensitivetoP2inhibition）正選擇

A野生型λ噬菌體，不能在P2噬菌體溶源性細菌中生長，為Spi+，即對在P2噬菌體的抑制呈敏感反應。Bλ噬菌體載體中的red和gam區段被外源片段取代后，λ噬菌體就能在P2噬菌體溶源性細菌中生長。第42頁,共145頁，2024年2月25日，星期天3、重組噬菌體的鑒別（4）、基于λ基因組大小的篩選包裝體系只能將大小37~52Kb的DNA分子插入到噬菌體的頭部結構中插入型載體通常刪除了噬菌體的中非必須的基因部分，因此中有重組后介于37~52Kb的分子才能被包裝。第43頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（左右臂連接）（三段自身連接）（插入片段）第44頁,共145頁，2024年2月25日，星期天根據噬菌斑的透明度或顏色來進行重組子的篩選第45頁,共145頁，2024年2月25日，星期天插入型載體：只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點。失去了非必需區切點又位于報告基因上，故在切開DNA并插入外源基因后，報告基因失活，即可依此進行重組體的篩選可插入長度為10kb的外源DNA

（三）、λ噬菌體載體分類第46頁,共145頁，2024年2月25日，星期天兩種報告基因的插入型載體cI基因內保留HindIII和EcoRI單酶切位點，當有外源DNA在這酶切位點插入時，使cI基因失活，感染hfⅠ-大腸桿菌后可形成空斑（如λgt10）。在噬菌體DNA插入的lacZ基因末端設有單一的EcoRⅠ酶切位點。在此處插入外源基因，可表達β-半乳糖苷酶的融合蛋白，利用特異性抗體或DNA測序方法可篩選重組DNA。這類載體適宜構建cDNA文庫(如λZAPII)（三）、λ噬菌體載體分類第47頁,共145頁，2024年2月25日，星期天

cIEcoRI

LA32.7RA10.6λgt10

lacZLA19.9RA21.9EcoRICharon16A第48頁,共145頁，2024年2月25日，星期天取代型載體：具有成對的克隆位點，在這兩個位點之間的λDNA區段可以被外源插入的DNA所取代。可克隆的片段大，最大可達25kb，而質粒最大僅10kb左右；λDNA的長度介于野生型λ噬菌體DNA長度的75％而不超過其105％時，才能被包裝成噬菌體顆粒，當DNA的長度短于野生型的75%或超過105%時，噬菌體的活性就急劇下降，因此要求λ載體DNA和外源DNA長度之和在39～53kb之間。（三）、λ噬菌體載體分類第49頁,共145頁，2024年2月25日，星期天LacZ

EcoRIEcoRIEcoRIBanHISalISalIBamHIEcoRI

MCSMCSCharon4AEMBL3/4Charon40第50頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（四）λ克隆載體的體外包裝

（補充知識）體外包裝：模擬λ噬菌體DNA分子在宿主細胞內發生的包裝過程，將重組的λ噬菌體DNA分子包裝成成熟的具有感染能力的λ噬菌體顆粒必要性：

λ噬菌體重組分子直接感染大腸桿菌的效率較低，而在試驗過程中，因內切酶的處理，DNA的連接產生的有效分子等原因，使得轉染效率更低第51頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（四）λ克隆載體的體外包裝第52頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（四）λ克隆載體的體外包裝單菌株體系缺陷型λ噬菌體在cos位點有突變，λ噬菌體的DNA復制不能完成，但可形成外殼蛋白，可以制備包裝所必須的各種外殼蛋白。第53頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（四）λ克隆載體的體外包裝雙菌株的體外包裝原理Aλ噬菌體的頭部和尾部的包裝是分開進行B頭部基因發生突變的噬菌體只能形成尾部C尾部基因發生突變的噬菌體只能形成頭部D兩種不同突變的噬菌體混合起來，能在體外裝備形成有活性的噬菌體顆粒第54頁,共145頁，2024年2月25日，星期天Lyse,mixAddATPandconcatemerizedλDNAMaturephageparticles第55頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（五）λ-DNA分離與純化1、含有乳糖和MgCl2的LB培養基中培養大腸桿菌2、加入合適滴度的重組λ噬菌體懸浮液3、用LB繼續培養，至溶液從渾濁變為清亮4、加入固體NaCl和PEG8000,離心獲得噬菌體顆粒5、蛋白酶K處理噬菌體懸浮液，去除蛋白質6、乙醇或異丙醇沉淀λ噬菌體DNA第56頁,共145頁，2024年2月25日，星期天總結有關λ噬菌體改造的載體λ噬菌體的生物學特點改造野生型λ噬菌體稱為載體需要去除和加入的功能元件有哪些？λ噬菌體重組體的篩選有哪些方法？λ噬菌體載體的類型和特點。第57頁,共145頁，2024年2月25日，星期天三、M13單鏈噬菌體DNA載體（一）M13噬菌體一般特點僅6407個核苷酸，10個基因有雙鏈環狀，單鏈環狀存在形式基因組采取滾環復制形式適合做載體具有比λ噬菌體更大的裝載能力單鏈形式在某些實驗過程很重要，如測序、體外突變等第58頁,共145頁，2024年2月25日，星期天RFDNA第59頁,共145頁，2024年2月25日，星期天第60頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（二）M13-DNA的改造1、定點誘變的方法封閉重復的酶切位點2、引入合適的選擇標記基因，如抗生素抗性基因，LacZ’3、引入多克隆位點4、在多克隆位點兩側引入測序引物第61頁,共145頁，2024年2月25日，星期天野生型M13RF-DNAM13mp系列載體polylinkerlacZ'IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII第62頁,共145頁，2024年2月25日，星期天宿主菌缺陷型缺失N端第11－41位氨基酸：β-半乳糖苷酶沒有生物活性未插入外源基因的M13mp1與該缺陷型基因可以產生互補插入外源基因的M13mp1與宿主不互補編碼β-半乳糖苷酶N端146氨基酸的基因序列M13mp系列載體polylinkerlacZ‘第63頁,共145頁，2024年2月25日，星期天Blue-whiteselection第64頁,共145頁，2024年2月25日，星期天四、噬菌體-質粒雜合載體（一）粘粒載體（柯斯質粒載體，cosmidvector

）

1、定義人工構建的含有λDNA的cos（cohesive-endsite)位點序列和質粒復制子的特殊類型的質粒載體。第65頁,共145頁，2024年2月25日，星期天pHC796.4kb柯斯質粒載體pHC79圖由pBR322質粒DNA與λ噬菌體DNA的cos位點及其控制包裝作用的序列構成第66頁,共145頁，2024年2月25日，星期天2、柯斯質粒載體的特點（1）只具有λ噬菌體的包裝特性，重組分子導入受體細胞按λ噬菌體的方式進行。（2）具有質粒的特性（有質粒復制子、抗生素基因和相應的多克隆位點）；（3）具有高容量的克隆能力（本身僅5-7kb,克隆極限可達45kb左右）廣泛應用于基因組DNA文庫的構建。（一）粘粒載體（柯斯質粒）第67頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（二）噬菌粒載體1、一般特點由絲狀噬菌體DNA復制起始位點序列與質粒組合形成的雜合分子。將M13噬菌體基因II和IV之間的DNA復制起始、終止和包裝識別序列克隆進入質粒載體，形成噬菌粒。第68頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（二）噬菌粒載體2、優點A、具有質粒的基本性質，便于外源DNA的克隆和重組子的選擇B、具有更高的裝載容量C、比M13-DNA重組分子更具有遺傳穩定性，在復制時不會發生DNA缺失第69頁,共145頁，2024年2月25日，星期天五、人工染色體載體1、BAC（bacterialartificialchromosome）A、以大腸桿菌（E.coli）F性因子為基礎構建的載體。B、特點：容納大約200Kb的片段可以像大腸桿菌的質粒一樣繁殖（低拷貝，嚴謹型）在宿主細胞中不會發生重組第70頁,共145頁，2024年2月25日，星期天五、人工染色體載體2、P1以及PAC載體（Pl-derivedArtificialChromosome）組件：

包裝位點（pac）：體外包裝重組子成為噬菌體粒子所必需。

兩個loxP位點：能被噬菌體重組酶（cre基因的產物）所識別具有P1和F-因子的特性能插入100-300Kb片段第71頁,共145頁，2024年2月25日，星期天補充知識點Cre重組酶：于1981年從P1噬菌體中發現，屬于λInt酶超基因家族。Cre重組酶基因編碼區序列全長1029bp（EMBL數據庫登錄號X03453），編碼38kDa蛋白質。是一種位點特異性重組酶，能介導兩個LoxP位點（序列）之間的特異性重組，使LoxP位點間的基因序列被刪除或重組。LoxP（locusofX-overP1）序列：來源于P1噬菌體，是有兩個13bp反向重復序列和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過程中與DNA共價結合，13bp的反向重復序列是Cre酶的結合域。其序列如下：

ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT第72頁,共145頁，2024年2月25日，星期天+CrerecombinaseproteincircularizesinjectedDNAattheloxPsites.DNA-replicatesusingplasmidreplicon,PlasmidcopynumberisincreasedbyinductionofP1lyticreplicon.PacextractcleavesatpacsiteandinsertsDNAintop1heads.TailsareattachedAllowphagetoadsorbtohoststrainandinjectDNAintocre+hostcell.第73頁,共145頁，2024年2月25日，星期天正常酵母人工染色體含有：*四膜蟲端粒（tel)*酵母自主復制序列（ARS)*酵母著絲點(CEN)*酵母的選擇標記(TRP1、URA1)YAC載體第74頁,共145頁，2024年2月25日，星期天第二節DNA的體外重組目標DNA與載體在體外連接，形成新的DNA分子。涉及到各種工具酶第75頁,共145頁，2024年2月25日，星期天一、序列特異的DNA限制性內切核酸酶

λ

噬菌體E.coli菌株λKλCλB

K

110-410-4B10-4110-4C

11

1（一）限制性內切酶的發現第76頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（一）限制性內切酶的發現

—宿主細胞的限制和修飾作用1、宿主細胞的限制和修飾作用：兩種不同來源的入-噬菌體λK；λB，能高頻感染各自大腸桿菌宿主細胞（K株，B株）。當它們分別與其它宿主菌交叉混合培養時，感染下降數千倍。一但λK噬菌體在B株成功，由B株繁殖出λK后代，能感染B株,不能感染原來K株.第77頁,共145頁，2024年2月25日，星期天(二)限制和修飾作用的分子機制1．大腸桿菌宿主細胞K株，B株，有各自的限制和修飾系統。

1）

它們均有三個連續的基因位點控制，hsdR;hsdM;hsdS.2）

hsdR編碼限制性核酸內切酶---識別DNA分子特定位點，將雙鏈DNA切斷。

3）

hsdM編碼產物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位點的堿基甲基化反應。

4）

hsdS表達產物的功能是---協助限制性核酸內切酶和甲基化酶，識別特殊的作用位點。第78頁,共145頁，2024年2月25日，星期天(二)、限制和修飾作用的分子機制

2.入噬菌體長期生長在大腸桿菌宿主細胞K株，B株中，

1）宿主細胞甲基化酶，將染色體DNA和噬菌體DNA特異性保護.2）封閉自身所產生的核酸內切酶的識別位點（修飾）

3．當外來DNA入侵時，遭到宿主限制性內切酶的特異降解（限制）

4.由于降解不完全，外來少數DNA分子在宿主細胞中繁殖過程中被宿主細胞的甲基化酶修飾，雖然是外來卻不被降解。第79頁,共145頁，2024年2月25日，星期天5．但喪失在原宿主細胞中的存活能力，因為接受了新宿主菌甲基化修飾的同時喪失了原宿主菌修飾的標記(一但λK噬菌體在B株成功，由B株繁殖出λK后代，能感染B株,不能感染原來K株)6．細菌利用限制和修飾系統來區分自身DNA與外來DNA。

C株不能產生限制性內切酶，其它來源入-噬菌體可以感染C株，在C株繁殖，其產生噬菌體則在K株和B株受到嚴格的限制作用(二)限制和修飾作用的分子機制第80頁,共145頁，2024年2月25日，星期天(三)限制性內切酶的分類I類酶II類酶III類酶酶分子三亞基雙功能內切酶與甲基化酶分離二亞基雙功能識別位點二分非對稱序列4-8bp序列，回文結構5-7bp非對稱序列切割位點距識別位點1000bp在識別位點中或靠識別位點在識別位點下游24-26bp限制性反應與甲基化反應互斥分開反應同時竟爭限制作用需要需要不需要第81頁,共145頁，2024年2月25日，星期天酶的命名3.

命名（1973年Smith原則、Ⅱ型酶）根據分離此酶微生物的學名，一般取3個字母。第一個字母大寫該微生物屬名前的第一個字母第二、三個字母小寫該微生物種名前的2個字母第四個字母大寫有變種或品系的第一個字母羅馬字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ從一種微生物中發現了幾種限制酶，按發現順序排列如EcoRⅠ是指從大腸桿菌（Escherichiacoli）R株分離得到的第一種限制酶。第82頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（四）限制性內切酶Ⅱ切割特點1、識別位點一般為4-8個bp的回文序列大多數酶作用于底物DNA雙鏈，位點在識別序列中或靠近識別序列少數酶能作用于回文序列相應DNA單鏈序列第83頁,共145頁，2024年2月25日，星期天限制性內切酶Ⅱ切割特異位點的機理第84頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（四）限制性內切酶Ⅱ切割特點平末端：兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對稱結構的中心，形成的DNA片段具有平末端。黏性末端：指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結構，它們能夠通過互補堿基間的配對而重新環化起來。

5’突出的黏性末端

3’突出的黏性末端第85頁,共145頁，2024年2月25日，星期天平末端的DNA片段不易重新環化第86頁,共145頁，2024年2月25日，星期天已知有兩種不同的限制酶都可產生粘性末端：5’-P端突出：3’-OH端突出：第87頁,共145頁，2024年2月25日，星期天同尾酶一組來源不同識別序列各異的，但能夠切割形成相同粘性末端的核酸內切限制酶。第88頁,共145頁，2024年2月25日，星期天HindⅢ5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’HsuI5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’同裂酶（isoschizomers）有一些來源不同的限制性內切酶能識別并切割相同的核苷酸靶序列，這類酶稱為同裂酶。第89頁,共145頁，2024年2月25日，星期天限制酶識別與切割的靶點序列及其隨后的連接同DNA的來源無關，即不帶有種的特異性，對各種DNA普遍適用。根據這一特性，才能將不同來源的DNA片段重組成新的重組體分子或是新的基因。第90頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（五）甲基化酶對內切酶識別的影響為限制性內切酶的伙伴，其識別位點與相應的限制性內切酶相同，并在識別序列內使某位堿基甲基化，對基因組甲基化后，內切酶識別發生的變化：1）封閉了內切酶的切口。如M.EcoRⅠ2）一些依賴甲基化的限制性內切酶的切口產生5′—TCGATCGA—3′5′—TCGA*TCGA*—3′5′—AGCTAGCT—3′5′—A*GCTA*GCT—3′TaqITaqIDpnI第91頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（五）甲基化酶對內切酶識別的影響3）增加了部分酶的識別特異性。大腸桿菌基因組內存在兩種甲基化酶,Dam和Dcm5′—ATCGAT—3′ClaI5′—GA*TCGAT—3′5′—ATCGA*TC—3′4）部分酶對其識別序列內的堿基是否甲基化，不影響切割5′—(C/T/A)ATCGAT(T/A/G)—3′ClaI第92頁,共145頁，2024年2月25日，星期天二、連接酶第93頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（一）DNA連接酶的作用模式1、連接酶：能夠催化兩條雙鏈DNA鏈之間形成3′

，5′磷酸二酯鍵的酶5’－末端形成DNA－腺苷酸復合物第94頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（二）DNA連接酶的兩種類型類型I：E.coliDNA連接酶（只連接粘末端）利用NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）作為能量供體，主要來源于原核生物類型II：T4DNA連接酶（粘末端和平末端）

利用ATP作為能量供體，主要來源于真核生物，T4噬菌體也屬于此類在基因工程的實驗中主要用T4DNA連接酶第95頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（三）條件（1）連接所需的條件一條DNA鏈的3’末端具有一個游離的羥基（-OH），而在另一條DNA鏈的5’末端具有一個磷酸基團（-P）；（2）需要有一種能源分子存在以提供羥基與磷酸基團之間形成磷酸二酯鍵時所需的能量。大腸桿菌及其它細菌中：NAD+（氧化氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）動物細胞及噬菌體中：ATPOH3’5’P第96頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（四）注意被連接的兩條DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分，DNA連接酶并不能連接兩條單DNA分子或環化的單鏈DNA分子。DNA連接酶只能連接并封閉雙螺旋DNA分子所出現的切口（Nick），即封閉雙鏈DNA上兩個相鄰核苷酸之間失去一個磷酸二酯鍵所出現的斷裂第97頁,共145頁，2024年2月25日，星期天GGTAC-OHP-CC-PHO-CATGG5’3’3’5’GG-OHP-CCCCATGG5’3’3’5’GGTACCCCATGG5’3’3’5’第98頁,共145頁，2024年2月25日，星期天三、其他用于DNA重組的工具酶1、DNA聚合酶Ⅰ（來自大腸桿菌）功能：5’→3’的聚合酶活性。5’→3’外切核酸酶活性，3’→5’外切核酸酶利用：5’→3’的聚合酶活性以及5’→3’外切核酸酶活性，切口平移大片段（Klenow片段）：5’→3’的聚合酶活性，3’→5’外切核酸酶小片段DNA聚合酶Ⅰ第99頁,共145頁，2024年2月25日，星期天第100頁,共145頁，2024年2月25日，星期天TaqDNA聚合酶（來自耐熱細菌）具有5’→3’的聚合酶活性和3’→5’外切核酸酶，高度保真。耐高溫。T4DNA聚合酶：具極強3’→5’外切核酸酶活性，可修平非平頭的DNA分子。測序酶：具有5’→3’的聚合酶活性，但不具備3’→5’外切核酸酶的T7DNA聚合酶。反轉錄酶：以mRNA為模板合成DNA的聚合酶第101頁,共145頁，2024年2月25日，星期天2、末端脫氧核苷酰轉移酶不需要模板的DNA聚合酶，底物為帶有游離3′端的羥基的雙鏈DNA分子。三、其他用于DNA重組的工具酶5′3′OH+Mg2++dATP+TdT5′3′AAAAAAAA5′3′OH5′3′AAAAAAAA+Co2++dATP+TdT5′3′OH+Co2++dATP+TdT5′3′AAAAAAAAA3′突出端平端3′凹端第102頁,共145頁，2024年2月25日，星期天3、S1核酸酶以外切或內切的方式降解單鏈RNA或DNA。4、Bal31核酸酶三、其他用于DNA重組的工具酶第103頁,共145頁，2024年2月25日，星期天三、其他用于DNA重組的工具酶5、堿性磷酸酯酶：除去DNA5′磷酸的酶6、激酶：在DNA或RNA的5′羥基(OH)端進行磷酸化的酶（作用結果是添加磷酸，可用于核酸的末端標記）第104頁,共145頁，2024年2月25日，星期天四、DNA切接反應的影響因素（一）、限制性內切酶切割反應合適的緩沖液（10~50mMTris-HCl,pH7.5);10mMMgCl2、1mMDTT對NaCl的濃度要求不同，可以分為低鹽組中鹽組高鹽組雙酶切反應的原則A、鹽濃度要求相似的內切酶可在一個反應體系中做雙酶切反應B、先做低鹽反應酶切再做高鹽反應的酶切C、考慮雙酶切位點的核苷酸排列第105頁,共145頁，2024年2月25日，星期天四、DNA切接反應的影響因素星號活性在非理想條件下，酶的專一性降低，導致內切酶切割與其識別序列相似序列的現象，稱為限制性內切酶的星號活性。如EcoRI5′—GAATTC—3′EcoRI低鹽、高pH值、過量甘油5′—AAATTC—3′5′—GAGTTC—3′第106頁,共145頁，2024年2月25日，星期天四、DNA切接反應的影響因素（二）、T4-DNA連接酶的連接反應緩沖液體系：50~100mMTris-HCl（pH7.5）10mMMgCl2、1mMDTT，≤1mMATP過量的甘油抑制反應溫度、離子濃度、DNA末端的性質、DNA片段的大小；載體和外源基因的摩爾比因大多數內切酶產生的黏性末端退火溫度在15度以下，故連接反應一般在低溫下進行（16度以下）。第107頁,共145頁，2024年2月25日，星期天（三）重組率及其影響因素1、由同一種酶切割的載體分子和目標DNA片段在連接時會產生三種連接產物：載體自連外源DNA片段自連載體+外源DNA片段的連接產物（目標重組產物）2、提高重組產物的方法：增加外源片段與載體片段的比值（3~8:1)載體DNA的5′去磷酸化用末端轉移酶分別處理載體和目標片段，使它們帶有互補的末端四、DNA切接反應的影響因素第108頁,共145頁，2024年2月25日，星期天1、互補黏性末端之間的連接同一限制酶切割位點連接：

由同一限制性核酸內切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割DNA后產生單鏈突出（5‘突出及3’突出）的粘性末端，同時酶切位點附近的DNA序列不影響連接，那么，當這樣的兩個DNA片段一起退火時，粘性末端單鏈間進行堿基配對，然后在DNA連接酶催化作用下形成共價結合的重組DNA分子。具有兩個插入方向兩個限制性內切酶切割位點連接：只可一種方向插入同尾酶切割位點連接：發生酶切口的焊死作用五、DNA分子重組的方法第109頁,共145頁，2024年2月25日，星期天五、DNA分子重組的方法2、平末端之間的鏈接DNA連接酶可催化相同和不同限制性核酸內切酶切割的平端之間的連接。原則上講，限制酶切割DNA后產生的平端也屬配伍末端，可彼此相互連接；若產生的粘性末端經特殊酶處理，使單鏈突出處補齊或削平，變為平端，也可實行平端連接。操作方法同黏性末端之間的鏈接，增加酶的用量。提高連接反應溫度；增加DNA平頭末端的濃度等。第110頁,共145頁，2024年2月25日，星期天3、將粘末端加到平末端分子上DNA接頭同聚物加尾產生粘性末端PCR產物的克隆連接（特例）五、DNA分子重組的方法第111頁,共145頁，2024年2月25日，星期天DNA接頭第112頁,共145頁，2024年2月25日，星期天

同聚物加尾連接是利用同聚物序列，如多聚A與多聚T之間的退火作用完成連接。在末端轉移酶(terminaltransferase)作用下，在DNA片段端制造出粘性末端，而后進行粘性末端連接。這是一種人工提高連接效率的方法，也屬于粘性末端連接的一種特殊形式。dATPdTTP同聚物加尾產生粘性末端第113頁,共145頁，2024年2月25日，星期天PCR產物的克隆連接PCR反應中所使用的聚合酶具有末端轉移酶的活性，通常在3’末端加上A。經特使處理的載體具有3’突出T堿基，通過T/A互補，進行克隆。屬于黏性末端的連接，該克隆方式特稱TA克隆。第114頁,共145頁，2024年2月25日，星期天從生物秀網站下載第115頁,共145頁，2024年2月25日，星期天4、定向克隆將外源DNA按正確的方向插入載體。通常采用不同的內切酶分別處理載體和片段，使線性載體和片段的兩段帶有不同的粘性末端，通過載體與片段之間的連接，實現定向克隆。第116頁,共145頁，2024年2月25日，星期天第三節重組DNA分子的轉化與擴增第117頁,共145頁，2024年2月25日，星期天一、概念將重組DNA分子，導入特定的受體細胞，使之無性繁殖并高效表達外源基因或直接改變其遺傳性狀，該導入過程及操作系統稱之為重組DNA分子的轉化。兩個條件：可轉化的DNA分子受體細胞第118頁,共145頁，2024年2月25日，星期天細菌轉化的過程（革蘭氏陽性菌）1、感受態的形成細胞分泌激活蛋白→與細胞表面受體結合→誘導特征性蛋白質（如細菌溶素）合成→細胞壁部分溶解→暴露細胞膜上的DNA結合蛋白和核酸酶2、轉化因子的結合：細胞膜上的DNA結合蛋白與雙鏈DNA特異結合。第119頁,共145頁，2024年2月25日，星期天3、轉化因子吸收：DNA+蛋白質→激活核酸酶→DNA一條鏈被降解，另一條鏈進入到受體細胞中4、整合復合物前體的形成：單鏈DNA+細胞中游離蛋白質→形成整合復合物前體結構（避免細胞內各種核酸酶的攻擊）→引導進入受體細胞染色體DNA處。5、同源重組的方式置換受體DNA的同源區域細菌轉化的過程（革蘭氏陽性菌）第120頁,共145頁，2024年2月25日，星期天二、受體細胞的選擇1、限制缺陷型的細胞：將相應細胞中的內切酶失活（如大腸桿菌中的hsdR，使之變成hsdR-

突變株系）2、重組缺陷型細胞轉入的外源DNA分子能夠自主復制，一般不需要將DNA重組到染色體DNA，因此受體細胞應該是重組相關的酶的突變株系(如大腸桿菌中recA-,recB-,recC-第121頁,共145頁，2024年2月25日，星期天二、受體細胞的選擇3、轉化親和型：使細胞壁的通透性增高，提高轉化效率；噬菌體受體菌細胞膜上需有特異性吸附的相關受體。4、遺傳互補型：受體細胞與載體上的選擇標記具有互補的遺傳性狀。如載體上具有抗生素基因，細菌細胞中就應該沒有該基因或該基因突變，這樣受體細胞接受外源DNA后，就會獲得載體上的選擇標記的性狀，這樣可篩選外源基因表達的轉化細胞。第122頁,共145頁，2024年2月25日，星期天二、受體細胞的選擇5、感染寄生缺陷型對于人體和牲畜有害的細菌，在作為受體時，需將其感染寄生能力突變，從而具有生物安全性。第123頁,共145頁，2024年2月25日，星期天三、轉化方法動植物細胞通常應病毒感染的方法，將外源DNA導入細胞。細菌細胞方法如下：1、Ca2+誘導轉化外膜與內膜間的部分核酸酶離開細胞膨脹細胞膜磷酯層形成液晶感受態加入DNA羥基磷酸鈣-DNA復合物核酸酶不能降解42℃處理膜液晶結構發生變化，通透性增加，DNA進入細胞低滲CaCl2溶液第124頁,共145頁，2024年2月25日，星期天三、轉化方法2、PEG介導的細菌原生質體轉化對數生長期的細胞→適量溶菌酶等滲溶液→原生質體（膜上DNase）→環狀DNA分子的吸收→DNA樣品+PEG→涂布在固體培養基上→細胞壁再生→通過選擇標記篩選轉化細胞。3、電轉化電場脈沖作用下→細胞壁形成微孔通道→DNA與細胞膜結合，引發吸收。轉化分子量大的DNA比較有效。第125頁,共145頁，2024年2月25日，星期天三、轉化方法4、接合轉化接合：細菌細胞間的直接接觸導致DNA從一個細胞轉移至另一個細胞的過程。接合質粒介導：促進細胞有效接觸、誘導DNA分子傳遞轉移第126頁,共145頁，2024年2月25日，星期天接合轉化過程供體菌(待轉化的重組質粒的菌株），不能在最小培養基中生長，但抗生素XR輔助菌(含輔助質粒的菌株），不能在最小培養基中生長，但抗生素YR受體菌,能在最小培養基中生長在無抗生素的培養基中混合培養一段時間后含有X+Y的最小培養基第127頁,共145頁，2024年2月25日，星期天四、轉化率及其影響因素1、轉化率的定義定義1：待轉化的DNA分子遠大于受體細胞的條件下，轉化細胞與細胞總數之比。定義2：受體細胞相對于DNA分子大大過量時，每微克DNA轉化所產生克隆數。（每微克DNA進入受體細胞的分子數）第128頁,共145頁，2024年2月25日，星期天四、轉化率及其影響因素2、轉化率的用途參照已知轉化率和重組率可以幫助設計DNA重組實驗的規模，如平板的制備數量第129頁,共145頁，2024年2月25日，星期天四、轉化率及其影響因素3、轉化率的影響因素載體DNA及重組DNA：構象和大小受體細胞轉化操作：選擇適合轉化方法和優化操作流程第130頁,共145頁，2024年2月25日，星期天2.3.5轉化細胞的擴增轉化細胞的增殖載體攜帶標記基因拷貝數擴增及表達克隆外源基因的表達第131頁,共145頁，2024年2月25日，星期天2.4轉化子的篩選與重組子的鑒定非轉化子：未接納載體或重組子的非轉化細胞轉化子：接納載