中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準棉花中轉基因成分定性PCR2003-03-17發布國家質量監督檢驗檢疫總局I本標準由國家認證認可監督管理委員會提出并歸口。本標準起草單位：中華人民共和國天津出入境檢驗本標準系首次發布的檢驗檢疫行業標準。1本標準規定了抗鱗翅目昆蟲棉花中轉基因成分的定性PCR檢測方法。聚合酶鏈式反應polymerasechainreaction(PCR)3.3.4dATP:deoxyadenosinetriphosphate,脫氧腺苷三磷酸。3.3.5dCTP:deoxycytidine3.3.7dTTP:deoxythymidinetriphosphate,脫氧胸苷三磷酸。23.3.10EDTA.ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺3.3.12Tris:tris(hydroxymethyl)aminomethane,三(羥甲基)氨基甲烷。3.3.14CaMV35S:35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus,花椰菜花葉病毒35S啟動子。3.3.17CryIA(b)-CryIA(c):asyntheticgeneencodes608aminoacids,productidenticaltothatofcryIA(b)geneandcryIA(c)geneofBacillusthuringiensissubsp,Kursta3.3.18CrylA(c):asyntheticgeneencodesinsecticidal-activetruncatedproductidenticaltothatofcrylA(c)geneofBacillusthuringiensissubsp,KurstakisteainHD-73蘇云金芽孢桿菌殺蟲毒蛋白4防污染措施5抽樣和制樣6測定方法6.1原理濃度為5pmol/L。其中外源基因的有關信息參見附錄A。被檢測基因基因來源引物序列擴增片段長度/bp退火溫度/℃內源5'-tct-gcc-cta-tca-act-tte-gat-ggt-a-3'51-aat-ttg-cgc-gcc-tgc-tgc-ctt-cct-t-3外源5-get-cct-aca-aat-gcc-atc-a-3'5'-gat-agt-ggg-att-gtg-cgt-ca-3'3表1(續)被檢測基因基因來源引物序列擴增片段長度/bp退火溫度/℃外源外源外源外源外源6.2.21mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.0):稱取121.1g三羥甲基氨基甲烷(Tris),溶于800mL水6.2.30.5mol/LEDTA(pH8.0):在800mL水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉6.2.5CTAB沉淀液：稱取5.0gCTAB,2.3376g氯化鈉，加水溶解定容至1L,分裝后高壓滅菌6.2.11·70%乙醇。6.2.12TE緩沖液(pH8.0):量取10mL1mol/LTris-HCl(pH8.0)和2mL0.5mol/LEDTA(pH8.0),加水定容至1L,分裝后高壓滅菌備用。6.2.1310×PCR緩沖液：含500mmol/L氯化鉀(KCl),100mmol/LTris-HCl(p氯化鎂(MgCl?),0.1%明膠。6.2.2150×TAE緩沖液：稱取484gTris,量取114.2mL冰乙酸，200mL0.5mol/LEDTA6.4.1.2加入1.3mLDNA抽提緩沖液，渦旋震蕩30s后，顛倒混合5min(注意不要使樣品結塊),6.4.1.3室溫10000g離心10min,取上層溶液800μL,加入5μLRNaseA(10μ6.4.1.4加入等體積的三氯甲烷/異戊醇(24:1),顛倒混勻1min。6.4.1.5室溫10000g離心10min,取上清液600μL,加入2倍體積的CTAB6.4.1.6室溫8000g離心10min,棄上清液。6.4.1.7加入800μL氯化鈉(NaCl)(1.2mol/L)溶解沉淀，待沉淀溶解后室溫放置5min,加入等體6.4.1.8室溫10000g離心10min,取上清液600μL,移入1.5mL的Eppendorf管中，加入0.6倍體6.5提取物純度和濃度測定樣品DNA用核酸蛋白分析儀測定260nm和280nm5 (2)為空白對照。檢測轉基因棉花中內外源基因采用的PCR反應體系見表2。每個反應體系應設置兩個次序50pL反應體系加樣體積/pL加樣體積/μL110×PCR緩沖液210×dNTPs(各2.5mmol/L,含dUTP)310X氯化鎂(25mmol/L)4Tag酶(5U/μL)5正義引物(5pmol/L)6反義引物(5μmol/L)7DNA模板(0.1μg/μL～1.0μg/μL)8加水至注：反應體系中各試劑的量可根據具體情況或不同的反應總體積進行適當調整。表3檢測轉基因棉花內外源基因的PCR反應循環參數被擴增的內外源基因變性擴增條件循環次數最終延伸CryIA(b)-CryIA(c)注：PCR反應循環參數可根據不同的基因擴增儀進行適當調整。6.6.3PCR擴增產物的電泳檢測分析用電泳緩沖液(1×TBE或TAE)制備2%瓊脂糖凝膠(55℃~60℃時加入左右加入溴化乙錠至終濃度為0.5μg/mL,也可在電泳后進行染色)。取9μLPCR擴增產物，加1μL10×上樣緩沖液上樣。電泳時，PCR擴增產物按上述上樣量上樣，并在每行膠孔中選一個膠孔，在其中加DNA分子量標記物混合液以判斷PCR擴增產物片段的大小。電壓大小一般控制在3V/cm～5V/cm,電泳時間根據PCR擴增片段長度及溴酚藍的移動位置來確定，電泳檢測結果用凝膠成像分析系統記錄并保存。6用針對真核生物內源基因18SrDNA基因設計的引物對棉花DNA提取液進行PCR測試，陰性對照、陽性對照和待測樣品都應被擴增出137bp的PCR產物。如未見有PCR擴增產物，則說明DNA提取液質量有問題，或DNA提取液中有抑制PCR反應的因子存在，應重新提取DNA,直到擴增出137bp7.2結果判定對棉花樣品DNA提取液進行外源基因的PCR測試，如果陰性對照和空白對照未出現條帶，陽性對照和待測樣品均出現預期大小的擴增條帶(擴增片段大小見表1),則可初步判定待測樣品中含有可疑的該外源基因，應進一步進行確證試驗，依據確證試驗的結果最終報告；如果待測樣品中未出現PCR擴增產物，則可判斷待測樣品中不含有該外源基因。使檢測結果出現假陽性。轉基因檢測應檢測目的基因以排除假陽性的可能。確證試驗方法按照SN/T1204中規定的方法執行。8結果表述8.1未檢出××××基因。(資料性附錄)轉基因棉花轉入的外源基因的有關信息表A.1