核桃殼中黃嘌呤氧化酶抑制活性物質的分離鑒定及構效關系的研究高尿酸血癥是人類常見的代謝疾病,會導致關節和腎臟形成尿酸鹽結晶,同時會增加患痛風性關節炎、尿酸腎石病、心血管疾病和高血壓等的風險。黃嘌呤氧化酶是嘌呤代謝的關鍵酶,該酶可以催化次黃嘌呤轉化為黃嘌呤,進而將黃嘌呤轉化為尿酸,與高尿酸血癥的形成息息相關。因而服用黃嘌呤氧化酶抑制劑是治療高尿酸血癥的非常有效的方法之一。但是,目前廣泛使用的臨床藥物別嘌呤醇會導致一系列副作用,例如過敏反應、Steven-Johnson癥狀和腎臟毒性等,因此治療高尿酸血癥需要更加安全有效的黃嘌呤氧化酶抑制劑。文獻報道表明植物中的天然活性物質既是潛在的黃嘌呤氧化酶抑制劑,同時又是良好的抗氧化劑。核桃屬于胡桃科胡桃屬植物,廣泛的分布于世界各地,核桃殼質量約占核桃質量的30%,核桃加工后會產生大量的核桃殼。本論文研究了核桃殼的提取物的體內降尿酸活性,并期望從中尋找出新型的黃嘌呤氧化酶抑制劑,現將主要研究結果歸納如下:(1)優化了評定樣品黃嘌呤氧化酶抑制活性的催化反應條件,將測定酚類物質的黃嘌呤氧化酶抑制活性的高效液相色譜法和分光光度法進行了對比研究。優化后的催化反應條件為:底物濃度0.24mM、酶濃度0.01U/mL、催化反應溫度25oC、pH值7.5、催化反應時間30min和終止反應用HCl溶液(1.0M)的體積80μL。兩種方法在尿酸的檢測濃度范圍內都具有較好的線性關系和較高的日內精密度,但高效液相色譜法的檢出限和定量限比分光光度法大約低了一個數量級,靈敏度較高。分光光度法在檢測活性較弱的物質或在292nm處有強吸收的酚類物質的黃嘌呤氧化酶抑制活性時結果會偏高。相比之下測定黃嘌呤氧化酶抑制活性的高效液相色譜法消除了干擾,并可以在不控溫的情況下21h內檢測有效,每個樣品檢測只需8min,可用于樣品的高通量篩選。同時高效液相法的日間精密度在0.10-1.50%的范圍內,說明該法具有較高的日間精密度。(2)為了從核桃果實及其副產物中篩選出合適的原料,對核桃果實(青皮、殼和仁)、莖和葉提取物的抗氧化活性和黃嘌呤氧化酶抑制活性進行了對比研究。核桃殼提取率較低(提取率為2.80%),但其提取物的總酚含量(14.81±0.50GAEg/100g,GAE沒食子酸當量)最高,抗氧化活性(ORAC3423.44±142.52μmolTE/g,TE為Trolox當量,還原力115.86±2.05μg/mL)最優,黃嘌呤氧化酶抑制活性僅次于核桃青皮提取物(核桃殼和青皮提取物抑制黃嘌呤氧化酶的半數抑制濃度分別為988.36±31.31μg/mL和616.86±17.84μg/mL),在保健食品工業中具有潛在的應用價值。同時,通過高效液相分析譜圖發現核桃果實不同部分(青皮、殼和脫脂核桃仁)、莖和葉提取物組成存在著一定的差異,但均具有相同的特征峰,說明這些樣品的主要成分比較接近。(3)探討了核桃殼提取物在高尿酸大鼠體內的降尿酸活性,并在體外進行了以黃嘌呤氧化酶抑制活性為導向的分離、純化和結構鑒定。按照166mg/kg核桃殼提取物的劑量灌胃大鼠30d,發現灌胃核桃殼提取物不會影響大鼠的體重;灌胃20d時該組大鼠的血尿酸含量明顯低于模型組大鼠(核桃殼提取物組vs模型組,p<0.05),在30d時血尿酸含量降低到模型組的76.41%(核桃殼提取物組vs模型組,p<0.05),同時大鼠血清中的尿素氮和肌酐含量(核桃殼提取物組vs模型組;尿素氮p<0.01,肌酐p<0.05)明顯降低,說明核桃殼提取物具有體內降尿酸活性和腎臟保護作用。以黃嘌呤氧化酶抑制活性為導向進行分離純化,鑒定出了對香豆醛、β-D-胡蘿卜苷、對羥基苯甲醛和氫化胡桃醌這四種物質。其中對香豆醛的黃嘌呤氧化酶抑制活性最強,為混合性抑制劑,與別嘌呤醇具有協同增效作用。核桃殼提取物和對香豆醛可以作為預防和治療高尿酸血癥及痛風的活性物質。(4)基于對香豆醛及其結構類似物,探討了黃嘌呤氧化酶抑制活性的構效關系,并對對香豆醛抑制黃嘌呤氧化酶的機制進行了探討。體外的黃嘌呤氧化酶抑制活性和分子對接結果表明對香豆醛的醛基、雙鍵和羥基對其黃嘌呤氧化酶抑制活性具有重要貢獻。對香豆醛與黃嘌呤氧化酶之間相互作用主要包括對香豆醛與苯丙氨酸-914和苯丙氨酸-1009之間的苯環與苯環的相互作用,羥基與谷氨酸-1261和精氨酸-880之間的兩個氫鍵,醛基與蘇氨酸-1010和纈氨酸-1011之間的兩個氫鍵。通過改變對香豆醛本身基團的位置和增加基團進一步探討了對香豆醛及其衍生物抑制黃嘌呤氧化酶的構效關系,結果表明在對香豆