附件11擴展一代生殖發育毒性試驗方法ExtendedOne-GenerationReproductiveToxicityStudy范圍本規范規定了擴展一代生殖發育毒性試驗基本原則，試驗方法和技術要求。本規范用于檢測化妝品原料的生殖發育毒性。試驗目的提供關于受試物產前、產后暴露對雌性、雄性動物生殖功能、生育力及子代發育影響的確切信息。定義生殖毒性Reproductiontoxicity對后代產生有害作用，并損傷雄性和雌性的生殖功能和生殖能力。發育毒性Developmentaltoxicity生殖毒性的表現，具體表現為后代在產前、圍產期、產后發生的結構和功能紊亂。神經發育毒性Neurotoxicity個體在發育過程中暴露于受試物后引起的神經系統結構和功能的異常改變，這種改變可以發生在生命周期的任何階段。發育免疫毒性Developmentalimmunotoxicity個體在其生命早期發育過程中（尤其是出生前后）暴露于受試物后導致的免疫系統發育受到影響、功能出現障礙，而這些影響在成年個體暴露時未被發現或持續時間較短。母體毒性Maternaltoxicity受試物引起親代雌性妊娠動物直接或間接的健康損害效應，表現為增重減少、功能異常、毒性反應、甚至死亡。未觀察到有害作用劑量NOAEL通過動物試驗，以現有的技術手段和檢測指標未觀察到任何與受試物相關的毒性作用的最大劑量。觀察到有害作用的最低劑量LOAEL在規定的條件下，受試物引起實驗動物組織形態、功能、生長發育等有害效應的最小作用劑量。試驗的基本原則通過對實驗動物以受試物暴露，考察其對雄性和雌性動物生殖功能、生育力及生殖系統形態的影響。若該暴露（直接或間接）持續至子代，則還可以繼續考察受試物對子代發育，甚至子代生殖功能和生育力的影響。受試物配制化妝品生殖發育毒性試驗一般采用經口途徑給予受試物，但基于人的可能暴露途徑或受試物的特性而選擇經皮或吸入也是合適的。溶媒對照應采用與之相同的給予途徑。若設置陽性對照，其處理方式可以不同于受試物處理組。一般情況下首選水作為溶媒，可以是水溶液也可以是混懸液，其次可以選擇玉米油作為溶媒配制成乳濁液，也可以將其與水混合配制成油溶液。使用水以外的其它溶媒，應闡明其毒性并保證所配制溶液的穩定性。應避免使用具有潛在內在毒性的溶媒（如丙酮、二甲基亞砜）。其它應納入考慮的因素包括：溶媒是否影響受試物化學特征繼而改變受試物毒性；溶媒是否影響受試物的吸收、代謝、分布和蓄積；溶媒是否影響動物食物和飲水攝入繼而影響營養狀況；溶媒本身是否有潛在毒性。經口灌胃時，以大鼠為例，水溶性液體的灌胃體積一般不超過10mL/kg體重，最大不超過20mL/kg體重；油溶性液體的灌胃體積不超過4mL/kg體重。每只動物的受試劑量通常應基于最近測定的個體體重，成年雄性和成年未懷孕雌性至少每周校準一次劑量，懷孕雌性和F1動物在斷奶前和斷奶后2周內每兩天校準一次劑量。如果毒代動力學數據表明受試物的胎盤透過量較低，則可能需要調整妊娠最后一周的灌胃劑量，以防止對雌性動物造成額外的毒性。雌性在分娩當天不應通過灌胃或任何其他方式給予受試物，以免干擾分娩過程。經飼料或飲水給予時，應充分考慮溶媒添加量和動物熱量的攝入。若使用溶媒，那么對照組應按受試物組的最高使用量添加；若不使用溶媒，且受試物會造成攝食量或食物利用率的降低，那么可以通過將其飼喂未交配動物作為配對對照組，但是，如有資料表明食物消耗的降低并不影響生殖相關參數，可以不設置配對對照。若無特殊理由建議通過口服給藥。經皮給予受試物時，應考慮受試物濃度對皮膚的刺激性。若在既定劑量下的濃度產生較為嚴重的皮膚刺激性，應將濃度適當降低。當然，這種降低可能也伴隨劑量的降低。如果因濃度過高，在早期就出現皮膚嚴重受損的情況下，應終止試驗并選擇合適的濃度重新開始。受試物皮膚暴露面積應達到動物全身皮膚的10%，毒性過高的受試物也可以小于10%。可以采用紗布和無刺激性膠帶將受試物固定在皮膚表面，需要保證每天6小時的接觸時長，同時也可以采用非保定方式（如防抓咬保護脖套）防止動物攝入受試物或弄掉封閉膠帶。經吸入給予受試物時，一般采用氣體、蒸汽、氣溶膠或以上混合形態進行受試物暴露。吸入受試物所采用的暴露物態應根據其理化性質、擬定濃度和/或其實際應用時的物態加以確定。不論采用頭鼻暴露還是全身暴露，染毒柜內氧氣濃度含量不低于19%，二氧化碳含量低于1%，同時確保受試物濃度穩定。實驗動物和飼養環境實驗動物選擇首選種屬為大鼠，若選擇其它種屬動物應有合理理由，同時應避免選擇生育力低且具有明顯發育缺陷的動物種屬。所選動物應健康且未經歷任何試驗，其中雌性動物應為未經產或未孕動物。試驗開始時動物體重的差異應不超過平均體重的±20%，若有必要還應基于發情周期篩選動物，將發情周期正常的雌性納入試驗。動物數量應保證每組至少有20只懷孕雌性動物，在極端情況下，未能產生足夠的懷孕動物時，不表明研究數據無效，需個案分析。雄性動物數量推薦與雌性動物保持一致。動物的準備和飼養動物抵達實驗設施后，應有不少于5天的環境適應期。實驗動物及實驗動物房應符合國家相應規定。選用標準配合飼料，飲水不限制。但應注意飲食和墊料中植物雌激素的含量，避免影響某些生殖終點。所用批次飼料留樣并適當保存至報告完成，以便在某些情況下進行回溯分析。動物交配前可以多只動物飼養于一籠，雌性動物交配成功后（檢查到陰栓或陰道涂片陽性）應單籠飼養于含墊料的籠具內，其所產F1代同籠飼養至離乳。離乳后的F1代應按組別、性別分籠飼養，如有合理理由亦可單籠飼養。暴露途徑選擇應選擇與人的可能暴露途徑最接近的方式?？筛鶕茉囄锏奈锘匦赃x擇合適的暴露途徑。受試物資料分析在開始試驗前，充分了解受試物的相關信息，如物化性質，毒代動力學（Toxicokinetics,TK，包括物種特異性代謝）特征，毒性效應特征，結構-活性關系，體外代謝過程，已有毒性研究結果和結構類似物等，對于決定受試物的暴露途徑、溶媒選擇、實驗動物種屬選擇、劑量選擇等具有重要意義。參考先前劑量探索研究中的TK數據對于選擇劑量水平和解釋結果非常有用。包括：已經明確了的關于發育中胎兒和幼仔暴露于受試物或其相關代謝產物的資料；提供的體內劑量估計值；對潛在的劑量依賴性飽和動力學過程的評估資料。如果有其他的TK數據，如代謝物譜、濃度-時間曲線等，也應予以考慮?？偟膩碚f，對于設計擴展一代生殖發育毒性試驗具有重要參考價值的TK數據來源如下：妊娠晚期（例如GD20）母體和胎兒血樣；哺乳中期（例如PND10）母體和幼仔血樣或乳汁；離乳早期（離乳PND28）離乳血樣。參考TK數據時，應靈活分析。需注意數據是來自受試物原物還是代謝產物，基于多少個采樣點得出，其暴露途徑如何等。劑量和分組常規劑量設計通常情況下，設置3個劑量組和1個溶媒對照組。劑量水平的選擇應參考已有毒理資料，如非妊娠動物的TK數據，受試物的血乳屏障透過率，人體暴露估計等。在有TK數據的情況下，相關資料表明受試物具有劑量依賴飽和特征，且人體暴露量遠低于飽和劑量，設置受試物高劑量時選擇動力學曲線向非線性轉變的拐點比較適合，可避免出現飽和。在缺乏TK數據支持的情況下，劑量水平的選擇應基于受試物的毒性，如高劑量應產生一定程度的全身毒性，但不致死或造成動物嚴重的痛苦。在高劑量以下按等比關系設置中低劑量，低劑量應能夠確定NOAEL或可以用于推導基準劑量（Benchmarkdose,BMD）。為避免NOAELs和LOAELs間距過寬，2-4倍的劑量間距較為合適，不宜采用過大的間距，如擬設間距超過10，則應采用增加劑量組的方法以降低間距。若有溶媒對照，溶媒對照應采用受試物處理組用到的最大體積作為本組動物的給予體積。限制劑量試驗人的可能暴露水平低于1000mg/kg是開展限制劑量試驗的前提條件。在重復劑量毒性試驗中高于1000mg/kg的情況下無毒性表征，或者無結構或代謝類似物的相關資料，那么僅設計1000mg/kg的單劑量水平已足夠。若在此劑量水平觀察到生殖發育毒性，則需要在更低劑量水平確定NOAEL。試驗內容試驗步驟F0的雌雄動物均應于交配前2周開始接受受試物處理，并一直持續至子一代（F1）離乳。其中，用于評價精子活力、睪丸和附睪組織病理變化的F0雄性動物應至少保證10周的暴露期。（流程見附圖）F1代動物一般情況下在離乳時接受受試物處理，但是如果有資料顯示受試物具有較差的血乳屏障透過率或不能明確受試物是否能透過血乳屏障，則應考慮在哺乳期直接對F1代動物進行受試物處理并一直持續至解剖。F1代動物在離乳時（PND21）隨機從每窩選取一雌一雄用于初步評估F1的生殖系統毒性和全身毒性（序列1A）。在滿足觸發條件的情況下，需要額外選取F1開展其它子代潛在毒性測試，如：潛在生殖毒性的追加評價（1B）、潛在神經發育毒性（2A&2B）、潛在發育免疫毒性（3）。序列1A用于初步評估F1生殖系統和全身毒性，每窩一雌一雄；序列1B在需要開展進一步生殖毒性研究時，交配產生F2以在受試物具有疑似生殖或內分泌毒性的情況下，或當隊列1A的結果不明確時，獲得額外的組織病理學數據，每窩一雌一雄。序列2A用于神經行為學及神經組織病理研究，每窩一雌一雄；序列2B用于離乳時的神經組織病理研究，每窩一雌一雄；序列3用于發育免疫毒性研究，每窩一雌一雄。試驗流程見附圖。以上序列中1A為必選，其余序列均有對應的觸發條件，具體見附表。交配同劑量組的雌雄大鼠按1:1進行交配，交配最多持續2周。通過在早晨檢查陰栓或陰道涂片來確定交配成功與否，一旦確定交配成功的雌性應單獨飼養，并把發現交配成功的當天定為妊娠第0天（G0）。如若交配不成功，應選擇同組已成功交配的其它雄性繼續交配，配對信息應準確記錄。在離乳動物中，從每窩選取至少一雌一雄在性成熟后進行交配且交配應在同組不同窩間開展。F1的選取應遵循隨機原則，但體重不應低于每窩平均體重兩個標準差。通常情況下不推薦進行二次交配，因為二次交配將丟失著床信息。但是，如出現受試物相關的窩產仔數變化或第一次交配中觀察到可疑的結果，仍建議F0或F1再次交配。同時，也建議將未成功懷孕的雌性動物與能正常生育的雄性進行二次交配，以確證雌性生育力。二次交配的時間應選在最后一胎離乳后大約一周左右。窩的標準化在出生后第4天，通過隨機選擇調整窩的大小，盡可能達到每窩每性別5只，若難以達到，做部分調整也可接受（例如：4只雌性和6只雄性）。窩的標準化應注意不以體重及肛殖距（AGD）為依據。臨床觀察每天至少1次臨床觀察，觀察的時機應考慮與血漿峰濃度相關的毒性癥狀出現的時間，觀察內容包括但不限于行為改變，難產或分娩時間過長，妊娠天數及其它毒性癥狀。離乳后，每周至少1次更為詳細的臨床觀察可在稱重時進行，觀察內容包括但不限于：皮膚、毛發、眼睛、粘膜的變化，分泌、排泄的發生以及自主活動情況，步態、姿勢、對外界刺激的反應，是否有痙攣、肌肉強直，刻板癥等。每天至少2次的籠旁觀察主要觀察動物嚴重的毒性反應、患病和死亡。出生當天，盡快進行檢查幼仔的數量、性別、存活與否以及是否存在明顯外觀異常（包括腭裂、皮下出血、皮膚顏色或質地異常、臍帶存在與否、腹部奶斑、是否存在干結分泌物）。此外，新生幼仔的初次臨床檢查應包括體溫、活動狀態和對刺激的反應。對死亡幼仔應檢查可能存在的缺陷和死亡原因。存活幼仔在PND0到PND4期間測量一次肛殖距（AGD）并定期測量體重，至少應在PND0（PND1）、PND4、PND7、PNF14、PND21各測量1次。肛殖距的測量最好選在體重測量的同一天進行，以減少對幼仔的影響，同時用肛殖距除以體重立方根以標準化該數據。PND12或PND13檢查幼仔是否出現乳頭或乳暈。從PND0（PND1）開始，每天至少1次臨床觀察，觀察的時機應考慮與血藥峰濃度相關的毒性癥狀出現的時間，觀察內容包括但不限于行為改變，難產或分娩時間過長，其它毒性癥狀。離乳后，每周至少1次更為詳細的臨床觀察可在稱重時進行，觀察內容包括但不限于：皮膚、毛發、眼睛、粘膜的變化，分泌、排泄的發生以及自主活動情況，步態、姿勢、對外界刺激的反應，是否有痙攣、肌肉強直，刻板癥等。每天至少2次的籠旁觀察主要觀察動物嚴重的毒性反應、患病和死亡。所有選入序列的F1動物應觀察其包皮龜頭分離和陰道口張開的日期，通過時間長短比較性成熟是否提前，同時結合年齡和體重分析，以反映F1身體發育與性成熟是否相稱。動物成長過程中觀察到的任何的生殖器官異常均應被記錄。體重、攝食及飲水測量首次給予受試物當天和最終解剖前應稱重一次，試驗期間每周稱重一次。需注意的是，哺乳期的雌性動物稱重應與子代稱重安排在同一天，其中PND4親代可以不稱重。試驗期間，每周稱重當天測量食物消耗，若通過飲水給予受試物則還應測量飲水消耗，但動物合籠期間可以不測量。離乳當天稱重（PND21）所有存活F1，之后分別在PND4、PND7、PND14、PND21稱重，其中幾個重要節點均需稱重，包括雄性包皮龜頭分離、雌性陰道口張開及解剖當日。試驗期間，每周稱重當天測量食物消耗。若通過飲水給予受試物則還應測量飲水消耗，但動物合籠期間可以不測量。動情周期動情周期通過陰道涂片反映。若在接受受試物處理前經過動情周期的篩查，則從接受受試物處理開始直至確認交配成功或交配期結束每日檢查陰道涂片，但是，如果可能存在非特異性影響（如急性應激或攝食減少），則可將首次受試物處理前移2周。需要注意的是，若雌性首次受試物處理前移2周，則雄性也相應的需要前移2周。1A序列的雌性動物從陰道口張開后開始觀察陰道涂片，直至在陰道涂片中觀察到角化上皮為止，以記錄整個時間段長度。另外，為監測動情周期，從PND75左右開始進行為期兩周的陰道涂片觀察。1B序列的雌性動物在需要交配以產生F2的情況下，從交配期開始，直到發現交配成功或2周的交配期結束為止也需要持續觀察陰道涂片以監測動情周期。血液學及血生化解剖前1天開始禁食，至解剖時禁食約16h。推薦采用麻醉后放血的安樂死方法，以便采集血樣檢測相關指標。動物麻醉后從腹主動脈進針采血，各組至少隨機選取10份（雌雄各半）血樣分別用于血液學（至少包括：紅細胞壓積，血紅蛋白濃度，紅細胞計數，總白細胞計數和白細胞分類計數，血小板計數和凝血時間/趨勢）、血生化（至少應包括：葡萄糖、總膽固醇、尿素、肌酐、總蛋白、白蛋白和至少兩種肝功能酶（如丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶、堿性磷酸酶、谷氨酰轉肽酶和山梨醇脫氫酶）及甲狀腺素/促甲狀腺素（T4/TSH）分析，剩余血樣經適當的處理后可予以保存，以便在需要對相關結果進行確證時可以再次檢測。若已知受試物能誘導血液其它相關改變，也可以增加考察內容。若需要進行第二次交配，血樣采集應安排在交配前進行。尿液分析在解剖前收集尿液或在解剖時從膀胱收集尿液分析，具體參數包括：尿量、顏色、透明度、滲透性、比重、pH值、蛋白質、葡萄糖、隱血、血細胞、細胞碎片。除檢測以上參數外，收集的尿液也可用于分析受試物的代謝和排泄。若重復毒性研究中已明確受試物不改變尿液參數，則可以不分析尿液。精子參數所有雄性均應檢測精子參數，但是有90天的研究資料表明受試物對精子參數無影響，則可以免除檢測。解剖時，將附睪稱重后，一側附睪留作組織病理檢查，從另一側附睪的尾部取精子樣本用于精子計數、精子活力及形態分析。其中，用于精子形態分析的樣本可以是濕樣本，也可以是固定樣本。精子形態分析應至少觀察200個精子，將其分為正常（頭、頸、尾均正常）和異常（頭部融合、斷頭、頭部異形、尾部異形）。所有1A序列的雄性F1均應檢測精子參數。解剖時，附睪稱重后，一側附睪留作組織病理檢查，從另一側附睪的尾部取精子樣本用于精子計數、精子活力及形態分析。其中，用于精子形態分析的樣本可以是濕樣本，也可以是固定樣本。精子形態分析應至少觀察200個精子，將其分為正常（頭、頸、尾均正常）和異常（頭部融合、斷頭、頭部異形、尾部異形）。若擬分析精子樣本來自于解剖時及時凍存的樣本或固定后的涂片，抑或直接采用精子分析儀等計算機輔助系統及時采集樣本圖像分析，那么精子參數的分析可僅限于高劑量組和對照組，僅在有受試物相關性時拓展至更低的劑量組。解剖及病理F0稱重并安樂死后，摘取以下臟器并稱重：子宮（含輸卵管和子宮頸）、卵巢；睪丸、附睪（整個）；前列腺（包含背外側、復側部）；精囊腺和凝固腺；跟給藥途徑相關淋巴結和遠端淋巴結；腦、肝、腎、心、脾、胸腺、垂體、甲狀腺（固定后）、腎上腺及其它已知毒性靶器官或組織。此外，不需稱重但需要保存的組織臟器包括：外周神經、肌肉、脊髓、眼及視神經、胃腸道、膀胱、肺、氣管（含甲狀腺和甲狀旁腺）、骨髓、輸精管、乳腺（雌雄均需保存）、陰道。高劑量組和對照組動物以上所列組織臟器應開展的完整組織病理學檢查。當觀察到受試物相關變化時，應將組織病理檢查拓展至更低劑量組。此外，在試驗中交配不成功，未孕，后代異常，動情周期異常，精子計數、活力或形態異常動物的生殖器官均需進行組織病理學檢查。序列1A動物應在性成熟后解剖。解剖前，安樂死并稱重所有動物，摘取以下臟器并稱重：子宮（含輸卵管和子宮頸）、卵巢；睪丸、附睪（整個）；前列腺（包含背外側、復側部）；精囊腺和凝固腺；跟給藥途徑相關淋巴結和遠端淋巴結；腦、肝、腎、心、脾、胸腺、垂體、甲狀腺（固定后）、腎上腺及其它已知毒性靶器官或組織。此外，不需稱重但需要保存的組織臟器包括：外周神經、肌肉、脊髓、眼及視神經、胃腸道、膀胱、肺、氣管（含甲狀腺和甲狀旁腺）、骨髓、輸精管、乳腺（雌雄均需保存）、陰道。以上所列所有1A組織臟器均需做組織病理檢查。對照組和各劑量組的淋巴結、骨髓、胸腺、脾臟（一半用以組織病理，一半用于淋巴細胞亞群分析，包括CD4+/CD8+T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞）、腎上腺，雄性的睪丸、附睪（至少一側）和雌性的卵巢均需做組織病理學檢查，除此之外的其它臟器和組織僅需在高劑量和對照組做組織病理學檢查。對于有受試物相關改變或肉眼可見損傷的組織/臟器應在中、低劑量中繼續觀察，以確定NOAEL。F1雌性卵巢的組織病理評價應包含對原始卵泡、生長卵泡和黃體的定量分析，并且應先在對照組和高劑量進行，如果高劑量組表現出不良反應則應繼續觀察中低劑量組。F1雄性睪丸的組織病理學檢查應包含對睪丸分化、發育和精子發生的評價?？赡艿那闆r下，可以檢查睪丸網，附睪頭、體、尾及輸精管的發育及親代雄性檢查中包含的其它參數。序列1B動物的以下臟器應稱重，并制成蠟塊：陰道（不稱重）；子宮帶子宮頸；卵巢；睪丸（至少一側制成蠟塊）；附睪；精囊腺和凝固腺；前列腺；垂體；已明確的其它靶器官。當序列1A結果可疑或懷疑有生殖或內分泌毒性時，以上蠟塊應制成切片并開展組織病理評價。潛在生殖毒性的追加評價當序列1B滿足觸發條件后，需交配以產生F2。序列1B動物持續處理至PND90以后，可以選擇同一劑量組不同窩的雌雄動物合籠2周以產生F2代。合籠時間應在從PND90開始，最遲不晚于PND120，合籠程序與F0相似。所產生的F2在PND4終止已足夠用以分析潛在的生殖毒性，而不一定非得持續至離乳或離乳后。潛在的神經發育毒性當序列2A和2B被觸發后，可在離乳后至成年前分階段開展以下試驗內容。在PND24天左右（±1天），2A序列所有動物進行聽覺驚嚇試驗。測試期間，保證測試條件穩定，并將受試物組和對照組交叉進行。所有檢測動物均需測試50次，10次測試為一組數據，每只動物共5組數據，記錄每組測試動物平均反應振幅。在PND63至PND75期間，2A序列所有動物進行功能組合測試（參照OECDTG424），觀察內容如下表：表1功能組合測試內容觀察項目檢測指標籠內或開放場地觀察姿勢、陣攣、強直、眼瞼閉合、豎毛、流涎、流淚、發聲、犬坐、步態異常、喚醒反射、刻板癥、特異行為、被毛污穢、呼吸異常。自主控制易于掙脫、易于保定、肌張力、趨向反射、觸感反射、聽覺反射、夾尾反射、反正反射、著地姿勢、前肢握力、后肢握力。生理指標體溫、體重、瞳孔反射、瞳孔大小。可以采用自動生理遙測系統對動物的運動活動進行測試（參照OECDTG426），但需要注意選擇好基線值以準確區分活動度增加或降低。2A和2B在完成行為學評價之后（PND75之后不超過PND90）和PND21（或PND22），解剖后取腦和疑似靶器官，其中腦需稱重。所有的對照組和高劑量組的上述組織應開展完全的組織病理檢查，當在高劑量組發現有受試物相關改變時，應繼續檢查中低劑量組。腦組織的檢查應包含嗅球、大腦皮層、海馬、基底神經節、丘腦、下丘腦、中腦(頂蓋、被蓋和大腦腳)、腦干和小腦，序列2A還應檢查眼（視網膜和視神經）、周圍神經、肌肉和脊髓。推薦以上每個腦區至少準備3個連續切面并從中選出最同源的進行評價，最好能做定量分析，如用立體定位分析特定腦區的體積或細胞數量。序列2A動物腦組織要求灌注固定，2B動物則可選擇灌注固定，且序列2動物數量不足時應優先保證2A。雖然要求每組全部動物腦組織均需取材進行組織病理評價，不過數量偏少也可接受，但最少不應低于6只/性別/組。未納入序列的動物如無進一步研究需求，在PND22天全部解剖，經大體觀察后按序列1A要求稱重及保存相關組織臟器。盡可能從較多的窩中選出至少10只/性別/窩的幼仔，稱重腦、脾、胸腺后固定保存。觀察到大體異常的組織或臟器、靶組織以及乳腺應保存并進行組織病理檢查。潛在發育免疫毒性評價當序列3被觸發后，在PND56（±3）天時，將動物用于T細胞依賴性抗原（可以選擇綿羊紅細胞或鑰孔戚血藍蛋白）抗體反應（TDAR）檢測。具體可采用抗體生成細胞檢測或IgM抗體檢測，具體方法如下：抗體生成細胞檢測：通過腹腔注射綿羊紅細胞（SRBC），于4天后取脾臟制成細胞懸液與一定量的SRBC混合，在補體的參與下，使分泌抗體的脾細胞周圍的SRBC溶解，形成肉眼可見的空斑，該空斑可以反映抗體生成細胞數。通過按時間變量設置亞組的方式可以更容易檢測到峰值，但需保證同一亞組內包含不同組別相同數量的雄性和雌性動物，且日齡一致。特異性IgM抗體檢測：腹腔注射SRBC或鑰孔戚血藍蛋白（KLH）5天后，用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）方法檢測血清中的特異性IgM抗體效價。數據處理、統計方法及結果評定應獲得的試驗結果食物消耗，飲水消耗（如有），食物利用率（每克食物增重，合籠和哺乳期除外），通過飼料和飲水給予受試物的還需要計算受試物的攝入；吸收數據（如有）；F0動物的體重數據；所選F1仔鼠離乳后體重數據；試驗期間動物死亡時間或動物是否存活至試驗結束；臨床癥狀的性質、嚴重程度和持續時間（是否可逆）；血液學、尿液和臨床生化數據，包括TSH和T4；脾細胞（T、B、NK細胞）表型分析；骨髓細胞；毒性反應數據；動情周期正?；虍惓５腇0、F1雌鼠數量及周期持續時間；交配時間（即從開始合籠配對到交配完成的天數）；生殖方面的毒性或其它效應，包括完成交配、妊娠、分娩和哺乳的動物數量和百分比，如與成功懷孕雌性配對的雄性數量及其百分比，難產、分娩延長或分娩困難的雌性數量及其百分比；妊娠周期，如有條件也可記錄分娩時長；著床數、窩大小和雄性幼仔百分比；胚胎著床后丟失、活產和死產的數量和百分比；窩重（包括窩雄性體重、窩雌性體重及全窩重）和幼仔體重數據，經確認為矮小的幼仔數量；有明顯大體觀察異常的幼仔數量；對子代的毒性或其它效應，包括對產后的生長發育、存活的影響；幼仔發育里程碑的相關數據及其它產后發育數據；F1代動物性成熟數據；幼仔和成年動物的功能觀察數據（如適用）；安樂死解剖時的體重，F0和成年F1的臟器絕對和相對重量數據；大體解剖觀察結果；詳細描述所有組織病理學發現；F0和F1附睪尾精子總數，前進運動精子百分比，形態正常和異常精子百分比；F1的男性；F0和F1雌性卵泡數量及其成熟階段（如適用）；F1雌鼠卵巢中黃體計數；對試驗結果進行合適的統計分析。序列2應獲得以下試驗結果：所使用的評分觀察系統，應詳細描述該標準化觀察的程序以及操作性定義；采用的試驗方法清單及其使用理由；詳細描述所使用的行為/功能、神經病理學和形態學測量方法，包括自動化設備的相關信息；需詳細描述所用行為學測試儀器的校準方法及如何確保組間和組內測試條件的一致性；簡潔介紹任何涉及專業判斷的理由；詳細描述所有行為/功能、神經病理和形態學測量結果，按性別和劑量分組，包括與對照組相比增加還是減少；腦重；任何被認為源于神經系統的癥狀和損傷，包括自發或條件致病；觀察到異常的標本的圖像資料；在組織形態學檢查中用于評估切面同源性的低倍圖片；結果的統計分析，包括統計方法以及結果，無論結果是否顯著；按性別和劑量組分析任何其他毒性作用與受試物的神經毒性具有的潛在關系；任何毒代動力學信息對結論的影響；試驗方法可靠性和靈敏度的支持數據（例如：陽性及歷史對照數據）；神經病理和功能效應之間的關系（如有）；按性別和劑量組分別確定母體動物和子代的NOAEL和基準劑量；對試驗結果的總體解釋加以討論，包括明確受試物是否引起神經發育毒性并給出相應的NOAEL。序列3應獲得以下試驗結果：血清IgM抗體滴度（對SRBC或KLH的致敏性），或脾IgM抗體滴度和空斑形成細胞（PFC）計數（對SRBC致敏性）；TDAR試驗應在試驗前進行方法驗證，首次開展該項試驗應設置陽性對照組，若兩次試驗間隔超過一年應設置陽性對照組，若兩次試驗間隔不足一年則無需設置陽性對照；對試驗結果的總體解釋加以討論，包括受試物是否引起發育免疫毒性并給出相應的NOAEL。數據的總結和評定數據以報告附件的形式用表格匯總。報告中應包含以下內容：試驗開始時的動物數量；試驗中發現死亡或因人道原因處死的動物數量、時間；可生育的動物數量；懷孕的雌性動物數量；分娩雌性動物數量；出現毒性反應動物數量；毒性反應癥狀的描述、發病時間、持續時間和嚴重程度。數據應采用合適的、可接受的統計方法進行評估。應適當處理非正態數據（如計數數據）、刪失數據（如有限的觀察時間）、非獨立性數據（如窩效應和重復測量）和方差不齊。報告中應包含具體的統計分析方法和用于統計分析的軟件信息。根據試驗中觀察到的結果（包括大體觀察結果和顯微鏡檢查結果）評價受試物的生殖發育毒性效應。包括是否存在劑量相關的異常、病變發生率和嚴重程度變化。此外，還包括靶器官、生育力、臨床異常、生殖和產仔性能、體重變化、死亡率以及其他任何毒性和發育影響。需特別注意性別特異性變化。為了準確評價受試物的影響，也可以結合受試物的理化性質，以及TK數據(包括胎盤透過和乳汁排泄)進行分析。結果解釋擴展一代生殖發育毒性研究資料可以提供受試物在生殖周期所有階段重復暴露的影響。尤其是提供了有關生殖系統以及子代最長至PND90的生長發育、存活情況及功能終點的信息。該研究的結果應結合受試物相關資料分析，包括物化特性、TK和毒性效應特征，其它相關信息，如結構類似物毒性資料，該受試物已有的毒理研究資料（例如急性毒性、重復劑量毒性、毒理機制研究以及關于種屬特異性的定量及定性體內外代謝特征研究）。大體解剖和臟器重量結果可以與其他重復劑量毒性研究結果相結合進行評估。子代生長的遲緩可能與受試物對乳汁成分影響有關。對序列2的解釋：神經行為和神經病理學結果應放在整個研究中解釋，使用證據權重法有利于做出更專業的判斷。若發現行為模式或形態學改變，應在劑量-反應關系中探討。對神經發育毒性的評估，可以援引包括人類流行病學研究或病例報告，以及實驗動物研究資料（如毒代動力學數據，結構-活性信息，其他毒性研究的數據）加以解釋。對數據的評價應包括對生物學和統計學意義的討論。若觀察到神經病理改變和行為模式改變，那么應討論二者之間的關系。對序列3的解釋：通過TDAR評估免疫功能的抑制或增強應放在整個研究中解釋。TDAR結果的顯著性可以通過其它免疫相關指標予以支持（例如，骨髓細胞，淋巴組織重量及組織病理形態，淋巴細胞亞群分布）。若其它毒性僅在更低劑量水平觀察到，那么TDAR產生的效應可能意義不大。附圖受試物暴露期圖1擴展的一代生殖發育毒性試驗流程圖附表序列編號觸發指標觸發條件序列1Ba親代生育力改變（著床數、妊娠率、妊娠期長短）生殖系統的組織病理學結果并未出現生物學相關或劑量相關的改變。F1動情周期改變雖然出現生物學相關或劑量相關的動情周期改變但未見嚴重的母體毒性。bF1窩大小的降低在缺乏母體毒性或母體致死的情況下，出現了生物學相關或劑量相關的窩大小降低。bF1發育節點的改變（AGD、乳頭數目、進入青春期、PPS、VO）在無體重變化介導的情況下，左側參數出現生物學相關或劑量相關效應。產后F1幼仔存活率降低在缺乏嚴重母體毒性的情況下，出現左側參數的變化。bF1幼仔出現畸形在缺乏嚴重母體毒性的情況下，出現左側參數的變化。bF1幼仔出生存活率降低在缺乏嚴重母體毒性的情況下，出現左側參數的變化。bF1幼仔體重降低幼仔出現生物學相關或劑量相關的體重降低并不伴有母體動物體重的持續遞減。序列2A&2Bc經確證具有干擾內分泌機制的活性構效關系分析或化學分類上具有神經毒性經確證具有干擾內分泌機制的活性經確證具有神經行為毒性在成年動物或人具有功能或形態上的神經毒性翻正反射可致翻正反射降低甲狀腺臟器重量和病理可致甲狀腺重量降低或出現相關的病理改變序列3c構效關系分析或化學分類上具有免疫毒性經確證具有干擾內分泌機制的活性淋巴器官出現臟器重量或病理變化。骨髓、脾臟、胸腺、淋巴結細胞成分改變白細胞分類計數改變在成年動物或人具有功能性免疫毒注：a，所列指標均有充裕時間留給研究人員以判斷是否需要進行F1代交配，觸發結果為是否產生F2。b，需要考慮母體毒性的類型、發生率及嚴重程度。c，觸發結果為是否開展該序列研究。AGD：肛殖距；PPS：包皮龜頭分離；VO：陰道張開?！啊睒耸镜挠|發條件為外部因素，即該類數據非來自本次試驗，可源于各種可信資料。附件12兩代生殖發育毒性試驗方法Two-GenerationReproductiveToxicityStudy范圍本規范規定了兩代生殖發育毒性試驗基本原則，試驗方法和技術要求。本規范用于檢測化妝品原料的生殖發育毒性。試驗目的提供關于受試物產前、產后暴露對雌性、雄性動物生殖功能、生育力及子代發育影響的確切信息。定義生殖毒性Reproductiontoxicity對后代產生有害作用，并損傷雄性和雌性的生殖功能和生殖能力。發育毒性Developmentaltoxicity生殖毒性的表現，具體表現為后代在產前、圍產期、產后發生的結構和功能紊亂。母體毒性Maternaltoxicity受試物引起親代雌性妊娠動物直接或間接的健康損害效應，表現為增重減少、功能異常、毒性反應、甚至死亡。未觀察到有害作用劑量NOAEL通過動物試驗，以現有的技術手段和檢測指標未觀察到任何與受試物相關的毒性作用的最大劑量。觀察到有害作用的最低劑量LOAEL在規定的條件下，受試物引起實驗動物組織形態、功能、生長發育等有害效應的最小作用劑量。試驗的基本原則通過對實驗動物以受試物暴露，考察其對雄性和雌性動物生殖功能、生育力及生殖系統形態的影響。若該暴露（直接或間接）持續至子代，則還可以繼續考察受試物對子代發育，甚至子代生殖功能和生育力的影響。受試物配制化妝品生殖發育毒性試驗一般采用經口途徑給予受試物，但基于人的可能暴露途徑或受試物的特性而選擇經皮或吸入也是合適的。溶媒對照應采用與之相同的給予途徑。若設置陽性對照，其處理方式可以不同于受試物處理組。一般情況下首選水作為溶媒，可以是水溶液也可以是混懸液，其次可以選擇玉米油作為溶媒配制成乳濁液，也可以將其與水混合配制成油溶液。使用水以外的其它溶媒，應闡明其毒性并保證所配制溶液的穩定性。其它應納入考慮的因素包括：溶媒是否影響受試物化學特征繼而改變受試物毒性；溶媒是否影響受試物的吸收、代謝、分布和蓄積；溶媒是否影響動物食物和飲水攝入繼而影響營養狀況；溶媒本身是否有潛在毒性。經口灌胃時，以大鼠為例，水溶性液體的灌胃體積一般不超過10mL/kg體重，最大不超過20mL/kg體重；油溶性液體的灌胃體積不超過4mL/kg體重。經飼料或飲水給予時，應充分考慮溶媒添加量和動物熱量的攝入。若使用溶媒，那么對照組應按受試物組的最高使用量添加；若不使用溶媒，且受試物會造成攝食量或食物利用率的降低，那么可以通過將其飼喂未交配動物作為配對對照組，但是，如有資料表明食物消耗的降低并不影響生殖相關參數，可以不設置配對對照。若無特殊理由建議通過口服給藥。經皮給予受試物時，應考慮受試物濃度對皮膚的刺激性。若在既定劑量下的濃度產生較為嚴重的皮膚刺激性，應將濃度適當降低。當然，這種降低可能也伴隨劑量的降低。如果因濃度過高，在早期就出現皮膚嚴重受損的情況下，應終止試驗并選擇合適的濃度重新開始。受試物皮膚暴露面積應達到動物全身皮膚的10%，毒性過高的受試物也可以小于10%?？梢圆捎眉啿己蜔o刺激性膠帶將受試物固定在皮膚表面，需要保證每天6小時的接觸時長，同時也可以采用非保定方式（如防抓咬保護脖套）防止動物攝入受試物或弄掉封閉膠帶。經吸入給予受試物時，一般采用氣體、蒸汽、氣溶膠或以上混合形態進行受試物暴露。吸入受試物所采用的暴露物態應根據其理化性質、擬定濃度和/或其實際應用時的物態加以確定。不論采用頭鼻暴露還是全身暴露，染毒柜內氧氣濃度含量不低于19%，二氧化碳含量低于1%，同時確保受試物濃度穩定。實驗動物和飼養環境實驗動物選擇首選種屬為大鼠，若選擇其它種屬動物應有合理理由，同時應避免選擇生育力低且具有明顯發育缺陷的動物種屬。所選動物應健康且未經歷任何試驗，其中雌性動物應為未經產或未孕動物。試驗開始時動物體重的差異應不超過平均體重的±20%，若有必要還應基于發情周期篩選動物，將發情周期正常的雌性納入試驗。動物數量應保證每組至少有20只懷孕雌性動物，在極端情況下，未能產生足夠的懷孕動物時，不表明研究數據無效，需個案分析。雄性動物數量推薦與雌性動物保持一致。動物的準備和飼養動物抵達實驗設施后，應有不少于5天的環境適應期。實驗動物及實驗動物房應符合國家相應規定。選用標準配合飼料，飲水不限制。但應注意飲食和墊料中植物雌激素的含量，避免影響某些生殖終點。所用批次飼料留樣并適當保存至報告完成，以便在某些情況下進行回溯分析。動物交配前可以多只動物飼養于一籠，雌性動物交配成功后（檢查到陰栓或陰道涂片陽性）應單籠飼養于含墊料的籠具內，其所產F1代同籠飼養至離乳。離乳后的F1代應按組別、性別分籠飼養，如有合理理由亦可單籠飼養。暴露途徑的選擇推薦采用經口方式（包括飼料、飲水和灌胃），除非其它暴露途徑（經皮或吸入）更為合適。劑量和分組常規劑量設計通常情況下，設置3個劑量組和1個溶媒對照組。劑量水平的選擇應參考已有毒理資料，如非妊娠動物的TK數據，受試物的血乳屏障透過率，人體暴露估計等。在有TK數據的情況下，相關資料表明受試物具有劑量依賴飽和特征，且人體暴露量遠低于飽和劑量，設置受試物高劑量時選擇動力學曲線向非線性轉變的拐點比較適合，可避免出現飽和。在缺乏TK數據支持的情況下，劑量水平的選擇應基于受試物的毒性，如高劑量應產生一定程度的全身毒性，但不致死或造成動物嚴重的痛苦。在高劑量以下按等比關系設置中低劑量，低劑量應能夠確定NOAEL或可以用于推導基準劑量（Benchmarkdose,BMD）。通常2-4倍的劑量間距較為合適，不宜采用過大的間距，如擬設間距超過10，則應采用增加劑量組的方法以降低間距。若通過飼料給予受試物，則劑量間距不應超過3倍。若有溶媒對照，溶媒對照應采用受試物處理組用到的最大體積作為本組動物的給予體積。限制劑量試驗人的可能暴露水平低于1000mg/kg，是開展限制劑量試驗的前提條件。在重復劑量毒性試驗中高于1000mg/kg的情況下無毒性表征，或者無結構或代謝類似物的相關資料，那么僅設計1000mg/kg的單劑量水平已足夠。若在此劑量水平觀察到生殖發育毒性，則需要在更低劑量水平確定NOAEL。試驗內容試驗步驟F0大鼠從5到9周齡開始連續給予受試物。雌性通常持續暴露至F1代離乳，雄性在不需進行其它生殖效應評價后可以人道處死，但是，所有F0代動物均應保證交配前共計10周，交配期共計2周的受試物暴露期。（流程見附圖）F1離乳時，從每窩選擇一雌一雄用于交配，自離乳開始每日給予受試物，若暴露途徑為飲水或食物，則其實際暴露可能始于哺乳期。交配期前連續暴露至少10周，并在交配期仍持續暴露2周，一直持續至F2代離乳（流程見附圖）。不用于交配的F1和所有F2均于離乳時人道處死，并從每窩分別選取一雌一雄用于大體解剖觀察。交配同劑量組的雌雄大鼠按1:1進行交配，交配最多持續2周。通過在早晨檢查陰栓或陰道涂片來確定交配成功與否，一旦確定交配成功的雌性應單獨飼養，并把發現交配成功的當天定為妊娠第0天（G0）。如若交配不成功，應選擇同組已成功交配的其它雄性繼續交配，配對信息應準確記錄。在離乳動物中，從每窩選取至少一雌一雄在性成熟后進行交配且交配應在同組不同窩間開展。F1的選取應遵循隨機原則，但體重不應低于每窩平均體重兩個標準差。通常情況下不推薦進行二次交配，因為二次交配將不得不失去著床信息。但是，如出現受試物相關的窩產仔數變化或第一次交配中觀察到可疑的結果，仍建議F0或F1再次交配。同時，也建議將未成功懷孕的雌性動物與能正常生育的雄性進行二次交配，以確證雌性生育力。二次交配的時間應選在最后一胎離乳后大約一周左右。窩的標準化在出生后第4天，通過隨機選擇調整窩的大小，盡可能達到每窩每性別5只，若難以達到，做部分調整也可接受（例如：4只雌性和6只雄性）。窩的標準化不宜以體重及肛殖距（AGD）為依據。臨床觀察每天應進行一般臨床觀察，在灌胃給藥的情況下，其觀察時間點應考慮到給藥后預期的毒性效應高峰時期。觀察并記錄行為改變、難產或長時間分娩以及所有毒性癥狀。更詳細的臨床觀察至少每周一次，可以在給動物稱重時進行。每天兩次籠旁觀察，觀察內容包括嚴重的毒性反應、發病率和死亡率。每天應進行一般臨床觀察，在灌胃給藥的情況下，其觀察時間點應考慮到給藥后預期的效果高峰時期，觀察F1和F2是否有行為改變，是否有外觀異常，是否出現毒性癥狀。此外，F1還應觀察是否難產或長時間分娩。更詳細的臨床觀察至少每周一次，可以在給動物稱重時進行。每天兩次籠旁觀察，觀察內容包括嚴重的毒性反應、發病率和死亡率。在分娩后（LD0）應盡快檢查每窩幼仔，以確定幼仔的數量和性別、存活與否以及是否存在明顯外觀異常。在第0天發現死亡的幼仔，如果不是浸軟胎，建議檢查可能存在缺陷和/或死亡原因，并將其保存。子代其它額外的發育信息，如睜眼，耳廓分離，萌牙，出毛的發生時間可以結合性成熟數據分析，如陰道口張開及包皮龜頭分離時的日齡和體重。如果沒有單獨的功能觀察組合試驗，那么在F1（非交配用）離乳前后可以觀察運動能力，感覺功能，個體反射（出現明顯的發育異常時可以不開展功能觀察組合試驗）。若F1的性別比或性成熟時間出現受試物相關改變后，則需在PND0測量F2的肛殖距。體重、攝食及飲水親代動物（F0和F1）受試物處理第一天應稱體重，此后至少每周稱一次。其中，雌性應在妊娠第0天、第7天、第14天和第20天（或第21天），以及解剖當天稱重，哺乳期與幼仔同一天稱量，但哺乳期第4天可以不稱重。子代在哺乳期第0天、第4天、第7天、第14天和第21天及解剖當天稱重。交配前和妊娠期間，每周至少測量一次食物消耗量。如果受試物經飲水給予，則至少每周測量一次飲水。動情周期交配前和交配期間通過陰道涂片進行雌性動情周期的評估，直到確認交配成功。在制作陰道涂片時，應注意避免過度刺激粘膜從而誘導假孕。精子參數解剖時，稱重睪丸和附睪，至少保留一側用于組織病理學檢查。每組至少10只雄性的睪丸和附睪分別用于超聲勻漿耐受精子細胞頭部計數和附睪尾精子計數。用于精子計數的附睪，還可以用于評估精子活力和精子形態，也可另外從輸精管采集精子用于以上分析。其中，用于精子形態分析的樣本可以是濕樣本，也可以是固定樣本。精子形態分析應至少觀察200個精子，異常精子形態包括頭部融合、斷頭、頭部異形、尾部異形。若擬分析精子樣本來自于解剖時及時凍存的樣本或固定后的涂片，抑或直接采用精子分析儀等計算機輔助系統及時采集樣本圖像分析，那么精子參數的分析可稍后進行，否則應在動物尸體剖驗時立刻進行分析。先分析高劑量組和對照組，在有受試物相關性時需擴展至更低的劑量組。如果上述精子評估參數中的任何一項已經在90天或更久的系統毒性研究中進行了檢查，則相應的精子參數不必在兩代生殖發育毒性試驗中重復。解剖與病理F0在解剖當日早上完成體重測量后，制作雌鼠陰道涂片以確定動情周期，便于結合卵巢的組織病理結果分析。解剖時大體觀察所有組織臟器，尤其應重點關注生殖系統，并記錄所有大體觀察異常情況和子宮著床痕數量。以下臟器在完成肉眼觀察后應稱重，成對的臟器需單獨稱重。子宮、卵巢；睪丸、附睪（整體和尾部）；前列腺；精囊腺、凝固腺及其分泌物（整體稱重）；腦、肝、腎、脾、垂體、甲狀腺和腎上腺及已知靶器官。所保存的臟器中，需要開展組織病理檢查的臟器包括：陰道、子宮（含宮頸）、卵巢；睪丸、附睪、前列腺、精囊腺、凝固腺；已明確的靶器官；通常先在對照組和高劑量組開展組織病理檢查，若發現受試物相關改變可繼續檢查其它劑量組。此外，疑似生育力降低的情況（未交配成功、未孕、未正常分娩、產生非健康后代、動情周期異常、精子參數改變等）需要對生殖系統進行組織病理檢查，大體解剖肉眼觀察異常的組織臟器也應進行組織病理檢查。睪丸的組織病理檢查建議關注是否有精子潴留，上皮形態及細胞層數是否改變，是否有多核巨細胞的形成，管腔內是否有脫落上皮。附睪的檢查應包含完整的頭、體、尾縱切面。建議關注是否有白細胞浸潤，管腔內是否有異常形態的精子細胞，是否發生巨噬細胞的吞噬現象。卵巢的組織病理檢查則主要采用定量的方法以檢測原始卵泡是否減少，也可以結合初級卵泡進行比較。定量分析時，應保證每組至少10只動物，同時還要考慮連續切片抽取間距及切片厚度等因素。需要解剖并大體觀察的子代包括：F2離乳時從每窩隨機挑選的一雌一雄及其親代F1；F1離乳時從每窩隨機挑選的非交配用一雌一雄；所有臨床觀察異?；蛲?/p>