中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準SN/T4853.6—2017轉基因大米定量檢測數字PCR法第6部分：T2A-1品系Part6:EventT2A-1國家質量監督檢驗檢疫總局SN/T4853《轉基因大米定量檢測數字PCR法》系列標準共分為7部分：——第2部分：克螟稻品系；——第3部分：科豐6號品系；本部分為SN/T4853標準的第6部分。本部分按照GB/T1.1—2009給出的規則起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別這些專利的責任。本部分由國家認證認可監督管理委員會提出并歸口。I1轉基因大米定量檢測數字PCR法本標準規定了稻谷和大米中T2A-1品系的數字PCR定量檢測方法。本標準適用于稻谷和大米中T2A-1品系特異性的數字PCR定量檢測。本方法的定量檢測低限(LOQ)為0.1%(質量分數)。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T19495.1轉基因產品檢測通用要求和定義GB/T19495.2轉基因產品檢測實驗室技術要求GB/T19495.3轉基因產品檢測核酸提取純化方法GB/T19495.5轉基因產品檢測核酸定量PCR檢測方法GB/T19495.7轉基因產品檢測抽樣和制樣方法SN/T1194植物及其產品轉基因成分檢測抽樣和制樣方法3.1術語和定義下列術語和定義適用于本文件。SPS基因Thegeneofsucrosephosphatesynthase蔗糖磷酸合成酶基因，大米單拷貝內參照基因。T2A-1轉化體特異性序列event-specificsequenceofT2A-1外源DNA插入受體大米基因組后經重組產生的鄰接區序列。具體序列參見附錄A。源于水生棲熱菌的耐熱DNA聚合酶。數字PCR引物/探針擴增檢測的特定DNA片段。定量檢測低限limitofquantification;LOQ在相對標準差不超過25%的條件下，檢測方法所能定量的最低轉基因成分百分含量。2質控樣品qualitycontrolsample具有確定的SPS基因和轉化體特異性序列拷貝數的基因組DNA。微反應體系tinyreactionsystem將含有模板、引物/熒光探針、耐熱DNA復制酶及其緩沖液充分混勻之后分配至體積相同且相互物理隔離的油包水液滴或其他微孔、微室中所形成的小體積熒光PCR反應體系。轉換系數Conversionfactor將轉化體特異性序列和內參照基因拷貝數之比轉換為轉基因成分含量(W/W)時所用系數。在5'末端和3'末端分別連接熒光報告基團和淬滅基團的寡核苷酸。PCR擴增時，Taq酶的5'—3'外切酶活性將探針水解，使報告基團和淬滅基團分離，從而釋放出熒光信號。下列縮略語適用于本文件。數字PCR:數字聚合酶鏈式反應(digitalpolymerasechainreaction)DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonuleicacid)dNTP:脫氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate)bp:堿基對(basepair)NC:陰性對照(negaitivecontrol)NTC:空白對照(notemplatecontrol)PC:陽性對照(positivecontrol)4防污染措施數字PCR定量檢測過程的防污染措施應符合GB/T19495.2的規定。數字PCR(digitalPCR)是在熒光PCR基礎上發展起來的基因拷貝數定量檢測技術，用于核酸模板的絕對拷貝數的測定。通過將含有模板、引物/熒光探針、耐熱DNA復制酶及其緩沖液的熒光PCR反應體系充分混勻之后等量均分為相互隔離的大數量(大于10000個)微反應體系，使每個模板獨立隨機地分配至微反應體系中；所有微反應體系同時在相同的規定條件下進行PCR擴增反應之后，根據設定的熒光閾值判斷每個微反應體系的擴增結果；依據微反應體系的陽性率和泊松分布公式計算得到數字PCR反應體系中的模板濃度。依據樣品DNA溶液中的轉化體特異性序列(eventspecificsequence)和內參照基因(species6儀器和設備6.1超純水發生器(分子生物學級別)。36.2分析天平：感量0.1g和0.1mg。6.3生物安全柜。6.5數字PCR系統：微反應體系發生器或其他具有同樣功能的儀器、微反應體系熒光檢測儀或其他具有同樣功能的儀器。6.7樣品粉碎機：可將大米或稻谷樣品磨成60目左右的粉末。6.9渦旋振蕩儀。6.10離心機：最大離心加速度大于15000g,并適用0.2mL和1.5mL離心管。7試劑和材料除另有規定外，試劑和材料質量應符合GB/T1947.2數字PCR預混液：含有鎂離子、dNTPs和具有5'-3'外切活性的熱啟動TaqDNA聚合酶的數字PCR專用預混試劑。7.3引物和探針：SPS基因和T2A-1轉化體特異性序列的數字PCR檢測引物和探針信息詳見表1。7.4數字PCR微反應體系生成聯排管或芯片。7.596孔熒光定量PCR反應板和封膜。7.60.2mL和1.5mL離心管。擴增基因名稱序列(5'-3')PCR擴增片段長度SPS基因上游引物GAGGTCACCAAGGCTGCCAGTG下游引物GCACTCCTGATTCTTCCAGGCTTC探針VIC-TAGGCTTCCCAGCAGGCAACCAA-BHQ1T2A-1轉化體特異性序列上游引物AAAGCTAGCCTCGTTTATTCCT下游引物CTAGCGTTCGTACAGTTTAAGCT探針FAM-CAACGAATCTTCCTGTCTGCCTGCT-BHQ1注1:表中PCR體系中引物/探針的終濃度可根據每合成批次的驗證結果進行適當調整。注2:熒光探針的發光基團應與數字PCR儀的熒光通道匹配，通常用5'-FAM/3'-BHQ1或5'-VIC/3'-BHQ1方式標記。48實驗步驟8.1抽樣按照GB/T19495.7的規定執行。8.2樣品制備除另有規定外，樣品制備按照GB/T19495.7或SN/T1194的規定執行。將樣品適度破碎、均一化，取出至少200g,全部放入樣品研磨機中，研磨至60目左右粒度。破碎和研磨過程中應調整設備的操作參數，避免過熱并防止樣品粘連。8.3核酸提取純化8.3.1核酸提取及PCR抑制物的判斷除另有規定外，DNA提取純化及PCR抑制物的判斷按照GB/T19495.3中的規定執行。稱取2份(每份2g)研磨后樣品作為測試樣，分別提取基因組DNA。采用PicoGreendsDNA熒光定量試劑盒或其他具有等效結果的儀器/方法測定DNA溶液的濃度，具體操作步驟參照相關儀器/試劑盒說明書。數字PCR體系中的模板數應不高于微反應體系數的5倍。為保證定量結果的準確性，體系中總模板數應不低于400個拷貝。將樣品DNA溶液作適度稀釋，選擇模板濃度在100拷貝/μL～20000拷貝/μL范圍內的稀釋液分別用于SPS基因拷貝數和轉化體特異性序列拷貝數的數字PCR定量檢測。按表2將各組分加入潔凈離心管中，充分混勻。表2數字PCR反應體系終濃度內源基因反應體系2×數字PCR預混液SPS基因正向引物(10μmol/L)SPS基因反向引物(10μmol/L)SPS基因熒光標記探針(10μmol/L) dH?O(無菌水) 外源基因反應體系2×數字PCR預混液T2A-1正向引物(10μmol/L)5SN/T4853.6—2017表2(續)終濃度T2A-1反向引物(10μmol/L)T2A-1熒光標記探針溶液(10μmol/L)DNA模板dH?O(無菌水)注：數字PCR反應體系的總體積可根據不同廠家、型號的數字PCR儀作相應調整。PCR體系配制及轉移時盡量避免產生氣泡。8.4.2微反應體系生成、數字PCR擴增及結果讀取根據儀器要求，將配制好的數字PCR反應混合液，加入微反應體系生成裝置的加樣孔中，按儀器操作說明生成微反應體系。將微反應體系放置于PCR擴增儀中，按以下參數進行PCR擴增：95℃,5min(1℃/s),1個循環；94℃,15s,60℃.Imin(1℃/s),50個循環；98℃10min(1℃/s),1個循環；12℃保存反應產物。對微反應體系進行熒光檢測，記錄陽性和陰性微反應體系數量及其比值。根據比值分別計算數字PCR反應體系中的SPS基因拷貝數(拷貝/μl)和T2A-1轉化體特異性序列拷貝數9檢測質量控制9.1對照設置陰性對照(NC)、空白對照(NTC)和陽性對照(PC)的設置如下：a)NC:采用非轉基因大米的基因組DNA作為數字PCR反應模板；b)NTC:采用水作為數字PCR反應模板；c)PC:采用質控樣品的基因組DNA作為數字PCR反應模板。每個測試樣和PC的SPS基因或T2A-1轉化體特異性序列的數字PCR需設置至少3個平行，且3個平行實驗結果的相對標準偏差應不高于20%。9.2檢測結果有效性判定以下結果中若有一項不符合，則樣品檢測結果無效，應查找原因并重做試驗：a)NC和NTC的T2A-1轉化體特異性檢測無陽性擴增；b)PC的SPS基因或T2A-1轉化體特異性序列檢測有陽性擴增；c)PC的定量結果與已知值相符。10結果計算10.1數字PCR儀運行后經軟件計算得出每個測試樣的SPS基因拷貝數和T2A-1轉化體特異性序列拷貝數，取3個平行試驗的均值，按照式(1)計算測試樣的轉基因成分含量： (1)6式中：A——轉基因大米品系T2A-1的含量(%);B--T2A-1轉化體特異性序列拷貝數；C——水稻內標準基因SPS拷貝數；D-—轉換系數。10.2如兩個測試樣的T2A-1品系含量的相對相差大于或等于35%,則測試結果應放棄，并應重做樣品制備及后續試驗。相對相差的計算參照GB/T19495.5中的規定執行。10.3如兩個測試樣的T2A-1品系含量的相對相差小于35%,則樣品的定量檢測結果等于兩個測試樣轉基因大米品系T2A-1成分含量的平均值。11結果表述定量檢測結果有四種情況，每種檢測結果的表述如表3所示。表3結果表述檢測結果結果表述未檢出SPS基因未檢出大米成分檢出SPS基因，但未檢出T2A-1轉化體特異性序列未檢出轉基因大米T2A-1品系成分檢出SPS基因和T2A-1轉化體特異性序列，但其含量小于定量方法檢測低限檢出轉基因大米T2A-1品系成分，但含量低于本定量方法的LOQ(0.1%)檢出SPS基因和T2A-1轉化體特