3固態化學品經口鼻動式吸入染毒操作規程本文件確定了固態化學品經口鼻動式吸入染毒的程序，規定了經口鼻動式吸入染毒的實驗前準備和實驗操作內容。本文件適用于化學品毒性鑒定機構和其他科研機構的固態化學品經口鼻動式吸入染毒試驗。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T15670.12—2017農藥登記毒理學試驗方法第12部分：短期重復吸入染毒(28天)毒性試驗GB/T21605—2008化學品急性吸入毒性試驗方法GB/T21754—2008化學品28天/14天重復劑量吸入毒性試驗方法GB/T21765—2008化學品亞慢性吸入毒性試驗方法3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1經口鼻動式吸入染毒dynamicexposurefororal-nasalinhalation采用經口鼻動式吸入設備，將實驗動物保定在動物固定器內，使其口鼻部充分暴露在染毒腔，在一定時間內持續吸入通過專用發生裝置發生的質量濃度穩定的受試樣品的染毒方式。3.2半數致死濃度（LC50）medianlethalconcentration在一定時間內經呼吸道吸入受試樣品后引起受試動物發生死亡概率為50%的濃度，以單位體積空氣中受試樣品的質量(mg/m3)來表示。[來源：GB/T21605—2008，2.2]3.3質量中值空氣動力學直徑massmedianaerodynamicequivalentdiameter（MMAD）由空氣動力學直徑大小不一的顆粒組成的氣溶膠樣品中，小于和等于某一空氣動力學直徑（例如5μm）的顆粒占氣溶膠樣品總質量或總重量50%時，則該氣溶膠顆粒空氣動力學直徑即為此氣溶膠樣品的質量中值空氣動力學直徑（5μm）。[來源：GB/T15670.12-2017，3.8]4實驗前準備4.1受試物來源4DB32/TXXXX—2022受試物為固態化學品。受試物應注明樣品名稱、來源、批號、含量（或規格）、保存條件、開封日期、配制方法、配制日期及有效期等。如使用賦型劑，所用賦形劑應標明批號、規格和生產廠家。4.2受試物分類處理實驗前應使用合適尺寸的超分篩等設備把受試物篩出較細顆粒物。根據受試物特性，其發生處理方式可分為以下幾類：——流動性強，吸濕性較弱，易于發生的受試物，可使用相應粉塵發生器直接發生；——流動性強，吸濕性較強，開封后不能長時間放置的受試物，發生過程中應保持密封。可使用采用旋轉電刷式原理的發生器或者其他在發生過程中能夠保持受試物密封的發生器發生；——流動性弱的受試物，需與賦形劑混勻后發生處理。用于配比的賦形劑如無明確數據表明其毒性作用，實驗中應增加空白對照組確認賦形劑對受試動物的影響。4.3實驗動物準備根據實驗需要，選擇合適的實驗動物，嚙齒類動物首選健康成年大鼠，非嚙齒類動物首選健康成年犬，必要時可以選擇非人靈長類，也可以選擇其他敏感動物，但應說明原因。應使用具有質量合格證的實驗動物，同性別的各劑量組個體間體重相差不超過平均體重的±20%。試驗開始前，應進行固定器預適應，根據動物種屬選擇相應固定器，預適應時間由短逐漸延長至正式實驗時間長度，一般為3天至5天，非人靈長類宜增加適應性訓練的時間和頻率。在染毒時，動物固定器不宜對實驗動物施加不適當的物理、熱或壓迫力，過強的外力限制會影響動物的生理指標。4.4實驗儀器準備應使用經口鼻動式吸入儀器進行實驗。經口鼻動式吸入儀器包括但不限于粉塵發生器、吸入暴露塔、質量濃度檢測儀、流量稀釋器、濾膜采樣器、流量級聯撞擊器、粒徑譜儀、環境參數監測調節設備、送排風及廢氣處理設備等。正式實驗開始前，應進行預實驗以確定合適的實驗參數設置，包括進氣流量、抽氣流量、稀釋流量、采樣流量及時間、壓差、氣溶膠發生器的樣品進給速度，受試物的使用量等。4.5劑量設計根據實驗目的按照相應標準進行劑量設計，急性吸入毒性試驗劑量設計按照GB/T21605—2008中的5.2條款內容，28天/14天重復劑量吸入毒性試驗劑量設計按照GB/T21754—2008中的4.1.2條款內容，亞慢性吸入毒性試驗劑量設計按照GB/T21765—2008中的4.4條款內容，慢性吸入毒性試驗劑量設計參照《化學品毒性鑒定技術規范》(衛監督發〔2005〕272號)的相關規定。當儀器需要重復使用時，不同劑量染毒試驗應由低濃度到高濃度進行。5實驗操作內容5.1實驗動物染毒環境染毒時，應保持染毒腔內溫度在22℃±3℃,相對濕度在30%～70%范圍，氧含量不低于19%，二氧化碳含量不高于1%，染毒腔和設備外部通風櫥之間應保持微負壓，以保證染毒腔內的受試物氣溶膠不會擴散到外部通風櫥。至少每小時記錄一次環境參數和樣品使用量，并確保每個暴露口足夠的受試物氣溶膠通氣量。55.2染毒系統過程控制5.2.1染毒穩定狀態確定應用經口鼻動式吸入儀器進行染毒實驗前，應對染毒腔受試物濃度進行調試。如果連續兩次測定的結果能夠證明染毒腔內受試物的濃度相對恒定，即固體受試物在目標濃度的±20%范圍內波動，則認為染毒系統濃度是穩定的，并記錄到達穩定所需時間，否則需要繼續調試。待染毒系統濃度確認穩定后，將動物裝入固定器中并盡快固定于染毒腔，記錄實驗動物染毒開始與結束時間、染毒時進氣流量、抽氣流量、稀釋流量、采樣流量及時長、壓差、氣溶膠發生器的樣品進給速度、受試物的使用量等。5.2.2染毒濃度控制和采樣要求染毒實驗中，應對受試物經發生器產生的受試物濃度進行動態監測。受試物濃度應通過間斷（至少30分鐘采樣一次）或連續采樣進行測定。設置采樣流量時，應減少對染毒腔穩態氣流造成不必要的干擾，在必要情況下，如濃度較低可考慮增加采樣流量或延長采樣時間。應采用可靠的檢測方法進行濃度監控，如濾膜稱重法或光學檢測儀檢測。若使用光學檢測儀器檢測濃度，應提前校準光學檢測儀的顯示系數，并且定期檢測受污染程度確保在可接受范圍，在檢測多成分受試物時，應有相應證明氣溶膠狀態下物質和開始物質有相似的分析數據，如無法證明上述信息，則應在整個實驗過程中有規律的進行間隔采樣分析。固態化學品吸入染毒過程中，變異系數（CV值=標準差與平均濃度的比值%）不超過20%。5.2.3染毒濃度計算染毒濃度應直接測定動物呼吸帶的實際濃度，多次測定后取平均值，根據染毒濃度判定受試物的LC50。采用濾膜稱重法測定濃度時，至少每30分鐘測定一次，取平均值，以公式（1）計算：Q×TQ×T當受試樣品采用賦形劑稀釋時，以公式（2）計算：式中：C—染毒濃度（mg/m3）M2—稱重后濾膜質量（mg）M1—稱重前濾膜質量（mg）Q—采樣流量（L/min）T—采樣時間（min）R—受試樣品在賦形劑中的含量（%，質量比）5.2.4染毒氣溶膠的粒徑檢測對于固態化學品制備的氣溶膠，應對氣溶膠粒徑進行連續測定和監控，至少每30分鐘采樣一次，氣溶膠的MMAD值應在1μm～4μm范圍內，且連續兩次測定的MMAD值的波動范圍在10%之內，幾何標準差在1.5～3.0之間。5.2.5染毒過程中動物監護和記錄染毒過程中，應觀察受試物和固定器對受試動物的影響，并記錄實驗中的動物狀態。如動物出現體位反轉等異常情況，應及時調整，受試動物的體位變化可能導致吸入染毒濃度不足，或導致窒息死亡。6DB32/TXXXX—2022觀察并記錄動物外觀、肢體活動、行為方式以及呼吸狀態等變化發生的時間、程度和持續時間，尤其需要記錄口鼻部是否有異常分泌物以及眼球部是否有出血充血現象。5.3實驗結束后操作5.3.1染毒結束清洗消毒染毒結束后，按照染毒開始時的安裝順序，逐次取下固定器并取出動物，拆卸暴露腔和管路，將暴露塔底部沉積樣品收集后，對暴露腔和管路用洗滌劑浸泡，用清水沖洗干凈，避免