第二十六章

基因表達及功能分析的基本策略STRATEGIESFORANALYZINGGENEEXPRESSIONANDFUNCTION8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略第一節基因表達的分析策略StrategiesforAnalyzingGeneExpression8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略一、通過檢測mRNA揭示基因轉錄水平的表達特征根據分析方法的原理和功能特性，可將基因表達分析分為:封閉性系統研究方法:例如DNA微陣列、Northern印跡、實時RT-PCR等方法，其應用范圍僅限于已測序的物種，只能研究已知的基因。開放性系統研究方法:

如差異顯示PCR、雙向基因表達指紋圖譜、分子索引法、隨機引物PCR指紋分析等，可以發現和分析未知的基因。這里主要針對已知基因的常用表達分析方法做一介紹。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略（一）基于雜交原理的方法可檢測mRNA表達水平1．Northern印跡（Northernblot）既可分析mRNA表達又可驗證cDNA新序列是一種基于RNA-DNA雜交原理建立的一種RNA分析技術8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略Northern印跡分析原理示意圖8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略2．核糖核酸酶保護實驗（ribonucleaseprotectionassay，RPA）可用于mRNA定量和RNA剪接分析是一種基于雜交原理分析mRNA的方法，既可對mRNA進行定量分析又可研究其結構特征，靈敏度和特異性都很高。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略核糖核酸酶保護實驗原理示意圖8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略可對mRNA進行區域定位

是利用雜交原理建立的組織原位mRNA檢測技術，可對細胞或組織中原位表達的mRNA進行區域定位。同時也可作為定量分析的補充。通過設計與目標mRNA堿基序列互補的寡核苷酸序列，標記后作為探針；該探針能夠特異性地與目標靶序列雜交，檢測標記信號來確定基因在組織和細胞內表達的區位信息。雖然原位雜交在功能性方面提供的信息較少，但是該技術還是被廣泛用于組織中的基因表達分析，這是因為其較高的穩定性、較廣泛的靶點和組織適用性。3．原位雜交（insituhybridization，ISH）8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略（二）兩種變換的聚合酶鏈式反應是常用的mRNA檢測方法1．反轉錄PCR可用于mRNA的半定量分析

反轉錄PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）是一種簡單、快捷地對RNA進行定性、定量分析的方法。它是以mRNA為模板，體外擴增cDNA，再以cDNA為模板進行特定基因轉錄產物的PCR擴增。RT-PCR技術一般用于RNA的定性分析；如果設置陽性參照，則可對待測RNA樣品進行半定量分析。該方法適合對待測樣品進行初步篩選，目前已廣泛被實時定量PCR替代。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略常用于mRNA的定量分析實時定量PCR(Real-timeQuantitativePolymerasechainReaction,RQ-PCR)是定量分析mRNA的最通用、最快速、最簡便的方法，該方法是對PCR反應進行實時監測，具有很高的靈敏度和特異性。2．實時定量PCR8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略目前有5種技術用于實時定量PCR：其中最經濟、簡便的技術是利用熒光染料（如SYBRGreen

）與雙鏈DNA分子結合發光的特性，指示擴增產物的增加；其他4種方法都是以熒光染料標記的寡核苷酸為探針與正確的擴增子雜交，包括5’核酸酶法（即人們熟知的TaqManTM）、分子信標、ScropionsTM和探針雜交法，它們擁有更強的特異性，可以避免對PCR后溶解曲線的需求，以及后續的Southern雜交或對擴增子的測序鑒定，但是成本較高。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略SYBRGreen實時定量PCR分析原理示意圖8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略二、通過蛋白質檢測揭示基因翻譯水平的表達特征

Western印跡（Westernblot）是一種免疫印跡技術，其基本原理與核酸分子雜交相似，只是以偶聯標記物的抗體分子作為探針，檢測轉移到固相支持物上的蛋白質/多肽分子。當在蛋白質水平上檢測特定基因的表達活性時，最常用的方法就是利用Western印跡對細胞或組織的總蛋白質中的特異蛋白質進行定性和半定量分析。（一）采用特異抗體經Western印跡可直接測定基因編碼多肽8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略蛋白質樣品的制備SDS分離蛋白質轉膜特異抗體（即第一抗體）與膜上的蛋白質（抗原）印跡雜交再經偶聯了可檢測標記信號的第二抗體（即抗抗體，商品試劑盒中多采用偶聯辣根過氧化物酶的Ig）最后經與酶的底物反應而顯影、成像，經掃描后獲取免疫印跡信息Westernblot基本程序8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略

酶聯免疫吸附分析（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）也是一種建立在抗原-抗體反應基礎上的蛋白質分析基本方法。該方法不需經電泳分離待檢樣品蛋白質，而是預先將樣品包被在支持體上，以后反應過程與Western印跡大致相同——順序結合（即“吸附”）特異抗體（一抗）及與酶連接的第二抗體（也可預先包被抗體，“吸附”抗原），再進行酶-底物反應。反應后通過專門的酶標儀測定、記錄數據。（二）酶聯免疫吸附分析與Western印跡原理相似但形式不同8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略特點：具有特異性；靈敏度很高；穩定、操作簡便，標本用量少，適于大規模篩查，尤其適用于檢測體液中微量的特異性抗體或抗原；既可以做定性試驗也可以做定量分析。被廣泛應用于微生物學、寄生蟲學、腫瘤學和免疫學等領域。酶聯免疫吸附分析8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略

免疫組織化學（immunohistochemistry）與免疫細胞化學（immunocytochemistry）原理相同，都是利用標記的特異性抗體通過抗原-抗體反應和顯色反應，在組織或細胞原位檢測特定抗原（即目標蛋白質）的方法，簡稱為免疫組化實驗。近年來由于熒光標記抗體的廣泛應用，這兩種方法又被統稱為免疫熒光法。（三）免疫組化實驗可對組織/細胞表達的蛋白質進行原位檢測8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略（immunofluorescence），可應用熒光（倒置）顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡（confocalmicroscopy）對靶分子進行定性、定量和定位分析，激光共聚焦顯微鏡還可進行斷層成像，是在蛋白質水平分析基因表達的直觀方法。其中抗體對于蛋白質靶點的特異性、種間交叉反應、檢測系統的靈敏性以及細胞或組織的固定類型是該方法的關鍵因素。運用雙重著色或多重著色程序同時對多個感興趣的靶分子進行檢測，是一種揭示更多有關細胞群的功能和它們之間相互作用信息的有效方法。免疫組化主要是作為定性、定位的技術，若結合密度計量系統、圖像分析系統等測量工具也可以得到定量的數據。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略

流式細胞術（flowcytometry）在細胞水平分析特定蛋白質的基本原理也是抗原-抗體反應，它利用熒光標記抗體與抗原的特異性結合，經過流式細胞儀分析熒光信號，從而根據細胞表達特定蛋白質的水平對某種蛋白質陽性細胞（即特異基因表達的細胞）作出判斷。（四）流式細胞術用于分析

表達特異蛋白質的陽性細胞8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略流式細胞術可以檢測活細胞，也可以檢測用甲醛固定的細胞。廣泛應用于細胞表面和細胞內分子表達水平的定量分析，并能夠根據各種蛋白質的表達模式區分細胞亞群。此外，流式細胞術可以使用多個熒光標記的抗體同時對多個基因產物進行標記和監測，是對細胞進行快速分析、分選、特征鑒定的一種有效方法。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略三、高通量檢測技術成為基因表達研究的有力工具

高通量篩選(Highthroughputscreening，HTS)技術是在大量核酸、多肽信息累計（即資料庫）基礎上，采用微板作為分子載體，制作集成“芯片”，以自動化操作系統進行分子雜交的試驗過程。因為快捷、靈敏、信息量大，適合大規模操作，故稱“高通量”。高通量檢測技術適合“組學”（omics）研究，更適合生命活動過程相關的基因表達譜分析。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略基因芯片已成為基因表達譜分析的常用方法基因芯片（genechip）又稱DNA微陣列(DNAmicroarray)、DNA芯片（DNAchip）,是將大量已知序列的核酸片段（包括寡核苷酸、cDNA、基因組DNA、microRNA等)集成在同一基片上，組成密集分子排列，通過與標記樣品進行雜交，檢測、獲取細胞或組織的基因信息。其中基因表達譜（expressionprifile）分析是目前基因芯片應用最多的一個方面，主要采用cDNA芯片，基因表達譜芯片便于對不同狀態（如生理和病理條件）下的基因表達譜進行比較，揭示轉錄組（transcriptome）差異表達的規律，對探索發病機制、評價治療效果、篩選藥物靶標具有重要意義。（一）基因芯片和高通量測序技術可在基因水平高通量地分析基因表達8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略2.高通量測序技術是新一代基因表達譜分析方法高通量測序技術可以一次對幾十萬到幾百萬個DNA分子片段進行序列測定，從而快速獲得轉錄組或基因組的全貌,又被稱為深度測序(deepsequencing)。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略

在DNA水平上，可以大規模地分析基因組甲基化、篩選突變基因、檢測基因多態性；在RNA水平上，可以對RNA片段進行掃描、定量與鑒定，對全基因組進行廣譜表達研究。1）目前，高通量測序技術不僅僅在DNA測序中起到重要的作用，并且已經應用于基因組分析的各個方面：2）高通量測序另一個被廣泛應用的領域是小分子RNA或非編碼RNA(ncRNA)研究。測序方法能輕易地解決芯片技術在檢測小分子時遇到的技術難題(短序列,高度同源),而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量測序的長度,同時測序方法還能在實驗中發現新的小分子RNA。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略基因芯片的缺點:在于它是一個“封閉系統”,它只能檢測人們已知序列的特征(或有限的變異)。高通量測序的優勢:在于它是一個“開放系統”,它的發現能力和尋找新信息的能力從本質上高于芯片技術。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略（二）蛋白質芯片和雙向電泳可在蛋白質水平高通量地分析基因表達

蛋白質芯片（proteinchip）是一種對蛋白質的表達和功能進行高通量分析的技術。是將具有高度親和特異性的探針分子（如單克隆抗體）固定在基片上，用以識別復雜生物樣品溶液中的目標多肽；蛋白質功能芯片可用來研究蛋白質修飾、蛋白質-蛋白質/DNA-蛋白質/RNA-蛋白質，以及蛋白質與脂質、蛋白質與藥物、酶與底物、小分子-蛋白質等的相互作用。1．蛋白質芯片有多種形式和用途8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略蛋白質檢測芯片包括:抗體芯片抗原芯片配體芯片碳水化合物芯片等根據蛋白質芯片制作方法和用途不同，可將其分為1.蛋白質檢測芯片2.蛋白質功能芯片兩大類8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略目前比較和鑒定蛋白質表達譜更多采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳結合質譜技術。雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術又稱二維電泳（two-dimensionalelectrophoresis,簡稱2-D電泳）。原理:

根據蛋白質分子的兩個屬性——等電點和分子質量——將蛋白質混合物進行分離。電泳結果經染色后，即可對不同樣品中蛋白質的表達譜進行比較；還可從凝膠中將特定的蛋白質點切下，經胰蛋白酶消化后得到短肽片段，利用質譜（massspectrum）技術進行定性分析，對差異表達的蛋白質進行鑒定。可同時分離數成百上千的蛋白質。2．雙向電泳結合質譜普遍用于蛋白質表達譜的分析和鑒定8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略第二節生物信息學在預測基因功能中的應用

BioinformaticsApplicationinPredictingGeneFunction8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略一、利用生物信息學方法進行基因功能注釋(一）通過序列比對預測基因功能序列比對是生物信息學最基本的分析技術之一，最常用的方法是將目的DNA或蛋白質序列與已知的DNA和蛋白質序列數據庫進行比對，搜索到與目的序列高度同源的功能已知的基因或蛋白質，用這些基因和蛋白質預測目的基因和蛋白質的功能。局部比對搜索工具BLAST是進行序列比對的基本工具，它允許用戶選擇一條查詢序列與一個數據庫進行比對，找到數據庫中與輸入的查詢序列相匹配的項。BLAST是一個序列數據庫搜索程序家族，其中包括許多有特定用途的程序。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略程序查詢序列類型數據庫類型注BLASTNDNADNABLASTP蛋白質蛋白質BLASTXDNA蛋白質將待搜索的核酸序列按6個閱讀框翻譯成蛋白質序列，然后與數據庫中的蛋白質序列比對TBLASTN蛋白質DNA將數據庫中的核酸序列按6個閱讀框翻譯成蛋白質序列，然后與待搜索的蛋白質序列比對TBLASTXDNADNA無論是待搜索的核酸序列還是數據庫中的核酸序列都按6個閱讀框翻譯成蛋白質序列，然后比對BLAST序列數據庫搜索程序家族8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略（二）利用生物信息學方法分析基因芯片數據最常用的方法有：差異表達分析（又稱基因表達差異分析）聚類分析差異表達分析的目的：識別兩個條件下表達差異顯著的基因，即一個基因在兩個條件中的表達水平，在排除各種偏差后，其差異具有統計學意義8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略倍數分析：計算每個基因在兩個條件下的表達比值；統計分析中的t檢驗和方差分析：通過計算表達差異的置信度來分析差異是否具有統計學意義；建模的方法：通過確定兩個條件下的模型參數是否相同來判斷表達差異的顯著性。差異表達分析常用的分析方法有3類：8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略聚類分析所依據的基本假設：若組內基因具有相似的表達模式，則它們可能具有相似的功能，例如受共同的轉錄因子調控的基因，或者產物構成同一個蛋白復合體的基因，或者參與相同調控路徑的基因。在具體應用中可按照相似的表達譜對基因進行聚類，從而預測組內未知基因的功能。目前已經有很多種聚類的方法應用到基因芯片的研究當中，如層次聚類(Hierarchicalclustering)、K均值聚類(K-meansclustering)、自組織映射(selforganizingmap)、PCA(principlecomponetanalysis)等。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略

在氨基酸序列整體同源性不明顯的情況下，對蛋白質的功能域進行分析將對預測基因功能提供極其有價值的信息。目前已通過多序列比對將蛋白質的同源序列收集在一起，確定了大量蘊藏于蛋白質結構中的保守區域或序列，如結構域（domain）和模體（motif），這些共享結構域和保守模體通常與特定的生物學活性相關，反映了蛋白質分子的一些重要功能。

（三）通過生物信息學方法分析蛋白質結構來預測蛋白質功能8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略運用蛋白質序列模體搜索工具預測蛋白質功能的方法是：首先收集現有的蛋白質家族，構造模體數據庫；而后通過搜索該數據庫確定查詢序列是否具有可能的序列模體，判斷該序列是否屬于一個已知的蛋白質家族；然后根據該蛋白質家族的已知功能預測未知蛋白質的功能。常用的模體數據庫有INTERPROSCAN、PROSITE、SMART等。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略基因組功能注釋常用數據庫數據庫網址描述AAThttp://genome.cs.mtu.edu/aat基因組分析和注釋工具COGhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/直系同源體簇分析數據庫EcoCychttp://ecocyc.pangeasystems.com/ecocyc/ecocyc.html大腸桿菌的基因與代謝OMIMhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/在線人類孟德爾遺傳資料PEDENThttp://pedant.mips.biochem.mpg.de/frishman/pedant.html完整基因組的生物信息學分析SAShttp://www.biochem.ucl.ac.uk/cgi2bin/sas/query.cgi結構為基礎的基因組序列分析WIThttp://www.cme.msu.edu/WIT/基因組代謝途徑重構8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略

現在人們已經越來越清楚地認識到，生物功能大多不是只由一個或幾個基因控制的，而是通過生物體內眾多的分子（如DNA、RNA、蛋白質和其他小分子物質）共同構成的復雜生物網絡實現的。當前生物學面臨的巨大挑戰之一就是，了解生物體內復雜的相互作用網絡以及它們的動態特征。要想全面系統地解析這些復雜的生物網絡需要大量相關數據的積累，現代基因芯片、蛋白質芯片等大規模數據采集技術大大加快了這一進程。目前人們已經利用生物技術和信息技術建立了各種生物網絡數據庫和網站，可為研究者提供基因調控、信號轉導、代謝途徑、蛋白質相互作用等方面的信息。二、利用生物網絡全面系統地了解基因的功能8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略

生物體任何細胞的遺傳信息、基因都是相同的，但同一個基因在不同組織、不同細胞中的表達卻不相同。一個基因的表達既影響其他的基因，又受其他基因的影響，基因之間相互促進、相互抑制，構成一個復雜的基因調控網絡。基因調控網絡研究就是：利用生物芯片等高通量技術所產生的大量基因表達譜數據，以及蛋白質-DNA間的相互作用等信息，結合實驗室研究結果，用生物信息學方法構建基因調控模型，對某一物種或組織的基因表達關系進行整體性研究，從而推斷基因之間的調控關系，揭示支配基因表達和功能的基本規律。

（一）利用生物網絡研究基因調控8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略常用基因轉錄調控數據庫數據庫網址描述EPD真核生物啟動子數據庫包含已被實驗證明的轉錄起始位點和組織特異性等啟動子的一般信息TFD轉錄因子數據庫是轉錄因子及其特性的專門數據庫，收集有關多肽相互作用信息TRANSFAC數據庫.com/pub/database.html#transcompel提供轉錄因子結構、功能、序列、DNA結合譜以及分類，還包括基因的轉錄因子結合位點的信息TRRD轉錄調控區數據庫trrd/celcyc/收集了關于真核基因整個調控區分級結構和基因表達模式的信息8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略信號轉導是生物系統的重要生命活動過程，機體通過信號轉導通路中分子之間的相互識別、聯絡和相互作用,實現整體功能上的協調統一。由于細胞內各種信號通路之間存在著緊密的聯系和交叉調控,形成了非常復雜的信號轉導網絡。信號轉導網絡研究的目的是期望通過建立細胞信號傳導過程的模型，找出參與此過程的各個蛋白質間的相互作用關系，闡明其在基因調控、疾病發生中的作用。生物信息學方法利用已知數據和生物學知識進行通路推斷,可以幫助闡釋信號分子作用機制,輔助實驗設計,節省大量的人力物力。有關信號轉導通路的網上數據庫資源較多。

（二）利用生物網絡研究信號轉導8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略常用信號通路數據庫數據庫網址描述Biocarta.biocarta.com信號通路圖片及注釋數據庫Reactome.reactome.org生物核心通路及反應的挖掘知識庫PID.nci.nih.gov從其他數據庫導入及文獻挖掘的人信號通路數據庫STKE.sciencemag.org參與信號轉導的分子及其相互作用關系的信息AfCS.signaling-gateway.org參與信號通路的蛋白質相互作用和信號通路圖DOQCS.ncbs.res.in細胞信號通路的量化數據庫,提供反應參數及注釋信息SigPath.org提供細胞信號通路的量化信息8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略代謝網絡處于生物體的功能執行階段，其結構組成方式反映了生物體的功能構成。代謝網絡把細胞內所有生化反應表示為網絡形式，反映了代謝活動中所有化合物及酶之間的相互作用。通過基因組注釋信息可以識別出編碼催化生物體內生化反應的酶的基因,結合相關的酶反應數據庫就可以預測物種特異的酶基因、酶以及酶催化反應，由此產生了許多優秀的代謝數據庫,可以方便地檢索某一生物代謝網絡中的代謝反應。

（三）利用生物網絡研究代謝途徑8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略常用代謝網絡數據庫數據庫網址描述KEGG包括了700個以上物種的代謝、信號轉導、基因調控、細胞過程的通路BioCyc包括了260個物種的代謝通路及基因組數據PUMA2存放了預先計算的超過200個物種的代謝通路信息BioSilico整合信息的數據庫，提供對多個代謝數據庫的訪問8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略（四）利用生物網絡研究蛋白質相互作用從某種程度上可以說，細胞進行的生命活動，是蛋白質在一定條件下相互作用的結果，若蛋白質相互作用網絡被破壞或穩定性丟失，會引起細胞的功能性障礙。闡明蛋白質相互作用的完整網絡結構，有助于從系統的角度加深對細胞結構和功能的認識。近年來各種預測蛋白質相互作用的計算方法被不斷提出，將這些方法與實驗方法結合，挖掘出了蛋白質相互作用網絡中更多的相互作用節點，目前已有多個蛋白質相互作用的數據庫應運而生，可用來研究蛋白質相互作用的生物學過程。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略常用蛋白質互作網絡數據庫數據庫網址描述BIND.bind.ca提供參與通路的分子的序列和相互作用信息DIP專門存放實驗確定的蛋白質之間相互作用的數據,既包括經典實驗手段也包括高通量實驗手段確定的蛋白質相互作用數據STRING存儲實驗確定的和預測得到的蛋白質相互作用數據，并對各種預測方法得到的結果的準確性給出了相應的權重MIPS包括酵母和哺乳動物的PPI,可靠性很高,被作為準金標準使用YeastInteractome綜合多種來源的由酵母雙雜交技術確定的酵母PPI數據集,利用基因表達信息、蛋白亞細胞定位信息以及已知的各種知識對其進行驗證形成高可信度的相互作用數據8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略三、復雜疾病的生物信息學研究策略包括信息提取、分析和建模癌癥、糖尿病、高血壓等復雜疾病對人類健康影響巨大，這類疾病的發病機制一般與多種遺傳或非遺傳因素，以及它們之間的相互作用有關，不能通過單基因、單通路、單層次的變化解釋。以系統的觀點解釋復雜疾病中遺傳與環境的關系、描述復雜疾病中基因的特征、分析疾病基因型與表現型之間的關系，已成為生物信息學研究復雜疾病的基本觀點，針對復雜疾病的研究模式，也開始從傳統的“序列→結構→功能”向“相互作用→網絡→功能”轉變。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略①疾病的基因組合及相互作用信息的提取：即對復雜疾病相關靶基因的識別，以及利用SNPs、基因、蛋白質等不同類型的信息，構建疾病驅使相關基因網絡。②生物信息分析及多層次信息的融合：即從不同層次對疾病的遺傳復雜性進行分析，對不同遺傳網絡間的映射算法進行研究，進而將SNPs、基因、蛋白質等不同水平的信息進行融合。③分子調控網絡建模：即綜合生理病理相關的基因、SNPs、基因表達狀況，蛋白質功能狀態以及臨床治療等信息，以系統的方法將不同的測量數據、各種因素的辨識、各個層次上的相互作用關系進行整合，建立數學模型，深入了解疾病過程、揭示復雜疾病的發病機制。復雜疾病的基本研究策略——8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略第三節基因的生物學功能鑒定技術MethodsforIdentifyingBiologicalFunctionsofGenes8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略目前在已知的2.5萬～3萬個人類基因中，大約70%的基因我們還不清楚它們的功能，有90%的基因我們不知道它們在體內的確切生理作用，因此，利用各種技術手段研究基因組中功能未知基因的作用，將是“后基因組時代”功能基因組學研究的主要內容。生物信息學利用已知數據和生物學知識進行合理推斷,可以節省大量的人力物力，但基因功能的鑒定最終仍需要通過實驗來驗證。通常采用基因功能獲得和/或基因功能缺失的策略，觀察基因在細胞或生物個體中的，細胞生物學行為或個體表型遺傳性狀的變化，來鑒定基因的功能。此外，基于正向遺傳學的隨機突變篩選技術也成為揭示基因功能的重要手段。由于基因的功能必須在完整的生物個體及其生命過程中才能得到完整的體現，因此從整體水平研究基因的功能是必然的選擇。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略基因功能獲得策略即通過將目的基因直接導入某一細胞或個體中，使其獲得新的或更高水平的表達，通過細胞或個體生物性狀的變化來研究基因的功能。常用的方法有轉基因和基因敲入技術等。一、采用功能獲得策略鑒定基因的功能8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略

轉基因技術（transgenictechnology）是指將外源基因導入受精卵或胚胎干細胞中，通過隨機重組使外源基因插入細胞染色體DNA，再將受精卵或胚胎干細胞植入受體動物的子宮，使得外源基因能夠隨細胞分裂遺傳給后代。（一）用轉基因技術獲得基因功能8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略

轉基因動物（transgenicanimal）是指應用轉基因技術培育出的攜帶外源基因，并能穩定遺傳的動物。其基本制作過程包括：轉基因表達載體的構建，外源基因的導入，轉基因動物的獲得和鑒定，轉基因動物品系的建立以及外源基因表達的鑒定。1.轉基因動物可在整體水平研究基因的功能8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略轉基因動物制作原理示意圖8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略優點：利用轉基因動物模型研究外源基因，能夠接近真實地再現基因表達所導致的結果，及其在整體水平的調控規律，把復雜的系統簡單化，具有系統性和獨立性，是目前層次最高的實驗體系。利用轉基因技術建立的疾病動物模型具有遺傳背景清楚、遺傳物質改變簡單、更自然更接近疾病的真實癥狀等優點。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略但轉基因動物模型仍存在一些亟待解決的問題：外源基因插入宿主基因組是隨機的，可能產生插入突變，破壞宿主基因組功能；外源基因在宿主染色體上整合的拷貝數不等；整合的外源基因遺傳丟失而導致轉基因動物癥狀的不穩定遺傳等。雖然轉基因技術本身仍存在一些問題，但其在醫學研究中的重要地位是毋庸置疑的，隨著轉基因技術的不斷完善，其在醫學及生物學領域必將有更加廣泛的應用。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略目前，科學家已經采取了多種方法使轉基因技術更加完善：為了更為精確地調控轉基因的表達，使其獲得時空特異性的調控，在構建轉基因表達載體時，選擇只在特定的細胞類型或特定的生命時期才啟動基因表達的啟動子，即可使外源基因獲得時空特異性的表達。可調控的基因表達系統也是一種常用的方法：例如四環素調控系統，該表達系統可使轉基因動物體內外源基因的表達受誘導劑（四環素）的調控，通過加入或去除誘導劑，就可以實現對外源基因表達時間及水平的控制。2.轉基因技術在不斷完善8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略當前轉基因動物所涉及的轉基因片段長度大多在幾十個kb以下，但是，隨著科學研究需要進行大片段DNA、多基因或基因簇的轉基因。克隆大片段DNA常應用酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)等，可獲得200kb以上的大DNA片段，能攜帶包含完整的基因或多個基因，以及基因的所有外顯子，和附近的染色體調控區，為目的基因提供與其在正常染色體上一致的環境，保證了轉基因在正常細胞中的時空表達。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略（二）基因敲入可以實現基因的定向插入

基因敲入(geneknock-in)是通過同源重組的方法，用某一基因替換另一基因,或將一個設計好的基因片段插入到基因組的特定位點，使之表達并發揮作用。通過基因敲入，可以研究特定基因在體內的功能；也可以與之前基因的功能進行比較；或將正常基因引入基因組中置換突變基因以達到靶向基因治療的目的。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略基因敲入是基因打靶技術的一種，基因打靶技術是20世紀80年代后半期發展起來的，一種按預期方式準確改造生物遺傳信息的實驗手段。該技術的巧妙之處在于把胚胎干細胞技術和DNA同源重組技術“結合”起來，實現對染色體上某一基因的定向修飾和改造，從而深入地了解基因的功能。除基因敲入外，基因打靶還包括基因敲除、點突變、缺失突變、染色體組大片段刪除等。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略基因打靶的原理和基本步驟首先,從小鼠囊胚分離出未分化的胚胎干細胞,然后利用細胞內的染色體DNA可以與導入細胞的外源DNA，在相同序列的區域內發生同源重組的原理，用含有正-負篩選標記的打靶載體，對胚胎干細胞中的特定基因實施“打靶”；之后將“中靶”的胚胎干細胞移植回小鼠囊胚(受精卵分裂至8個細胞左右即為囊胚,此時受精卵只分裂不分化),移植進去的中靶胚胎干細胞鉆入囊胚胚層,與囊胚一起分化發育成相應的組織和器官；最后誕生出具有基因功能缺陷的“嵌合鼠”。由于中靶的胚胎干細胞保持分化的全能性,因此它可以發育成為嵌合鼠的生殖細胞,使得經過定向改造的遺傳信息可以代代相傳。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略

基因打靶的原理示意圖8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略基因功能研究的功能失活策略是通過觀察，細胞或個體的某一基因功能被部分或全部失活后，細胞生物學行為或個體遺傳性狀表型的變化，來鑒定基因的功能。常用的方法主要有基因敲除基因沉默二、采用功能失活策略鑒定基因的功能8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略

基因敲除（geneknock-out）屬于基因打靶技術的一種，其操作步驟和原理與基因打靶技術相同。基因敲除技術是利用細胞染色體DNA可以與導入的外源DNA在相同序列的區域發生同源重組的現象，在ES細胞中定點破壞內源基因，然后利用ES細胞發育的全能性，獲得帶有預定基因缺陷的雜合子，通過遺傳育種最終獲得目的基因缺陷的純和個體。1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細胞基因敲除的小鼠模型，此后基因敲除技術得到進一步的發展和完善，目前該技術已經成為研究基因功能最直接、最有效的方法之一。（一）基因敲除可以使基因的功能完全缺失8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制：有些重要的靶基因被敲除后會引起胚胎早期死亡，使得無法分析該基因在胚胎發育晚期和成年期的功能；某些基因在不同的細胞類型中執行不同的功能，完全敲除會導致突變小鼠出現復雜的表型，使研究者很難判斷異常的表型是由一種細胞引起的，還是由幾種細胞共同引起的。近年來，條件性基因打靶（conditionalgenetargeting）系統的建立，使得對基因靶位時間和空間上的操作更加明確，效果更加精確可靠，已達到對任何基因在不同發育階段和不同器官、組織的選擇性敲除。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略Cre/loxP系統作用原理示意圖8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略這一技術亦存在一些缺點：費用太高周期較長許多基因在剔除后并未產生明顯的表型改變，可能是這些基因的功能為其他基因代償所致條件性基因打靶的優勢：克服了重要基因被敲除所導致的早期致死并能客觀、系統地研究基因在組織器官發生、發育以及疾病發生、治療過程中的作用和機制8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略

基因沉默(genesilencing)是指由外源基因導入引起的生物體內的特定基因不表達或表達受抑制的現象。該現象最早發現在轉基因植物中，后來這種現象在線蟲、真菌、果蠅、斑馬魚、小鼠早期胚胎中也有發現。目前最常用的基因沉默技術包括：RNA干涉（RNAinterference，RNAi）反義寡核苷酸（antisenseoligonucleotide，ASON）（二）基因沉默可以使基因的功能部分缺失8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略RNAi是指雙鏈RNA介導同源序列的mRNA特異性降解，導致的轉錄后基因沉默。RNAi是機體的一種天然防御機制，具有防御病毒感染、入侵等功能。目前利用RNAi能夠在短時間內高效特異地抑制靶基因表達的特點研究基因的功能已成為功能基因組學的熱點之一。1.RNA干涉技術可用來研究基因的功能8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略RNAi的作用機制：外源dsRNA可直接被導入細胞，或者通過轉基因、病毒感染等方式進入細胞，并整合到基因組中獲得表達；各種來源的dsRNA被核酸酶RNaseⅢ家族中，特異識別dsRNA的Dicer酶，以一種ATP依賴的方式逐步切割成長約21~23nt的雙鏈小干擾RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)；siRNA識別mRNA鏈上的同源區域之后，結合一個核酶復合物形成RNA誘導的沉默復合體（RNA-inducesilencingcomplex，RISC）；RISC定位到靶mRNA轉錄本上，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略RNAi的作用機制示意圖8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略目前有5種方法可用于制備siRNA：化學合成法體外轉錄法長鏈dsRNA的RNaseⅢ體外消化法siRNA表達載體法siRNA表達框架法前3種方法是在體外制備然后導入到細胞中；后兩種則是基于具有合適啟動子的載體或轉錄元件，在哺乳動物或細胞中轉錄生成。目前多采用RNA聚合酶Ⅲ啟動子構建siRNA的表達載體或表達框架，常用的RNA聚合酶Ⅲ的啟動子有人、鼠U6啟動子、人H1啟動子。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析基本策略研究者既可以將siRNA導入特定細胞，在細胞水平上研究基因的功能；也可以通過轉基因的方法，在動物體內實現特異、穩定、長期地抑制靶基因的表達，從而在整體水平上研究基因的功能。若將RNAi技術與Cre/loxP重組系統以及基因表達調控系統相結合，建立轉基因動物模型，則不僅具有穩定、可遺傳、可誘導等特點，而且無需使用胚胎干細胞技術和基因打靶技術，與基因敲除相比具有簡單、易操作、周期短等優勢。已被作為一種簡便和有效的工具廣泛用于基因功能的研究。8年制生物化學與分子生物學第26章基因表達及功能分析