1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide1課程要求通過本課程的學習，掌握基因工程的一些基本原理和基本操作技術等。

總成績＝平時（20％）＋實驗（30％）＋考試（50％）

平時成績(考查遲到、早退，課堂提問、討論、遵守課堂紀律等方面)1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide2教材和參考文獻樓士林等，基因工程，科學出版社，2002吳乃虎，基因工程原理（第二版上、下冊），科學出版社，1998張惠展編著，1999年出版，《基因工程概論》，華東理工大學出版社。Watson,J.Detal.RecombinantDNA,W.H.FreemanandCompany,NewYork,2ed,1992RobertF.Weaver,MolecularBiology,科學出版社,2000（影印版）1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide3本課程內容第一章緒論第二章基因克隆的工具酶第三章基因工程的載體第四章目的基因的制備第五章目的基因導入和重組子的篩選第六章外源基因的表達第七章基因操作的基本技術第八章植物基因工程及應用第九章動物基因工程及應用第十章醫學基因工程及應用1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide4第八章植物基因工程及應用第一節高等植物的遺傳學特性第二節高等植物基因轉化第三節植物基因工程應用第四節轉基因的安全性1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide5第一節高等植物的遺傳學特性

a.

遺傳操作的簡易性

大多數高等植物可以開花授粉，通常可產生大量的后代，所以即使是非常稀有的基因突變和基因重組事件，其遺傳后果也易被觀察。

b.

整株植物的再生性

植物細胞具有全能性，單個細胞可以在適當激素濃度誘導下完成脫分化、再分化的過程，分化成為葉和根，莖，最終形成整株植株。所以轉化了外源基因的植物細胞可以再生形成完整的植株。

c.染色體的多倍體性

許多高等植物以多倍體的形式存在，大約三分之二的禾本科植物是多倍體，其染色體數目范圍從24至144不等！其特征是體細胞變異頻率高，在組織培養中植物細胞是遺傳不穩定的。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide6第二節高等植物基因轉化一.植物遺傳轉化的方法

植物遺傳轉化技術可分為兩大類：一類是直接基因轉移技術，包括基因槍法、原生質體法、脂質體法、花粉管通道法、電激轉化法、PEG介導轉化方法等，其中基因槍轉化法是代表。另一類是生物介導的轉化方法，主要有農桿菌介導和病毒介導兩種轉化方法，其中農桿菌介導的轉化方法操作簡便、成本低、轉化率高，廣泛應用于雙子葉植物的遺傳轉化。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide7二.農桿菌介導的基因轉化方法

(一)農桿菌的Ti質粒與T-DNA的整合機制

幾乎所有雙子葉植物都容易受到土壤農桿菌感染，而產生根瘤。它是一種革蘭氏陰性土壤桿菌（A.tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）質粒介導的。農桿根瘤菌之所以會感染植物根部是因為植物根部損傷部位分泌出酚類物質乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮，這些酚類物質可以誘導Vir（Virulenceregion)基因的啟動表達，Vir基因的產物將Ti質粒上的一段T－DNA單鏈切下，而位于根瘤染色體上的操縱子基因產物則與單鏈T－DNA結合，形成復合物，轉化植物根部細胞。T－DNA上有三套基因，其中兩套基因分別控制合成植物生長素與分裂素，促使植物創傷組織1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide8無限制地生長與分裂，形成冠癭瘤。第三套基因合成冠癭堿，冠癭堿有四種類型：章魚堿（octopine）、胭脂堿（nopaline）、農桿堿（agropine）、琥珀堿（succinamopine），使農桿菌生長必需的物質。

1.Ti質粒的結構

在發現根瘤農桿菌誘發冠癭瘤的本質是Ti質粒后，Ti質粒便成為冠癭瘤形成基因鑒定與分析的主要研究對象。

Ti質粒大約在160～240kB之間。其中T-DNA大約在15kb-30kb。Vir基因區在36kb左右。除此之外，Ti質粒上還存在Con區（regionencodingconjugation)和Ori區（originofreplication)。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide9Ti質粒的結構

1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide10表達載體pBIn19的結構1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide11T-DNA上共有三套基因和左右兩個邊界，LB和RB是長為25bp的末端反復重復順序，在切除及整合過程具有重要意義。

tms由兩個基因組成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH）

tmr由一個基因組成iptz：

tmt由若干基因構成，合成稀有氨基酸衍生物，稱為opines。它有三個成員：

octopine＝精氨酸與丙酮酸的縮合物

Napaline＝精氨酸與－酮戊二酸的縮合物

Agropine＝谷氨酸與二環糖的縮合物

據此可將Ti質粒分為三大類，感染的植物誘導合成這些有機堿，但不能利用它們，其分解酶基因在Ti質粒上，分解產物為氨基酸和糖類，供根癌農桿菌使用作為氮源及碳源。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide122.T-DNA的整合機制：

T-DNA的詳細整合機制尚不清楚，但有幾個環節是明確的：

T-DNA切除由Vir區編碼的特異性內切酶完成，分別在LB和RB的第三個堿基和第四個堿基之間產生缺口，并形成單鏈T-DNA。

T-DNA的LB和RB在整合中的作用是不對稱的，RB順序與整合有關，而LB無關。

T-DNA的整合可以是單拷貝的，也可以是多拷貝的，成串聯形式排列，但整合位點的特異性尚未確定。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide13T-DNA的整合機制1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide14(二).Ti質粒轉化植物細胞的戰略１.Ti質粒的改造

有以下理由使天然的Ti質粒不能作為表達載體使用：

a.生長在培養基上的植物轉化細胞產生大量的生長素和分裂素阻止了細胞再生長為整株植物，因此，必須除去生長素和分裂素基因。

b.有機堿的合成與T-DNA的轉化無關，而且可能會影響植物細胞生長，因為有機堿合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必須去除有機堿合成基因（tmt）

c.Ti質粒約為200kb，重組操作非常困難，也很難找到單一的酶切位點。

1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide15d.Ti質粒不能在大腸桿菌中復制，為了使重組質粒DNA的大量擴增，須添加入大腸桿菌復制子。加入植物細胞的篩選標記，如neor基因，使用植物細胞啟動子及末端polyA化信號，加入多聚人工接頭以利于外源基因的克隆。

植物中一般不存在質粒，為利用農桿菌的Ti質粒，發展了共整合系統和雙元載體系統，避免了在大的Ti質粒上進行分子重組操作的困難。

2.植物細胞轉化的共整合系統

T-DNA克隆在大腸桿菌質粒上，含有E.coli的選擇標記和植物選擇標記Kmr。首先在E.coli中篩選重組分子，然后將重組質粒轉化到農桿菌中，質粒與Ti質粒上的同源序列發生同源重組，將外源基因整合到Ti質粒上，用于侵染植物細胞。T-DNA重組分子整合到植物細胞染色體DNA上，Kmr篩選轉化細胞。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide16共整合載體1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide173.植物細胞轉化的雙元系統

目前T-DNA轉化植物細胞的標準方法是雙元系統，即穿梭質粒。插入外源基因的重組穿梭質粒直接轉化含有Ti質粒的根瘤農桿菌，經篩選后直接感染植物細胞。與共整合系統所不同的是，含外源基因的質粒可在農桿菌內自主復制并保留下來。農桿菌侵染植物細胞后，植物的創傷信號啟動Ti質粒上的Vir基因，隨后將穿梭質粒的T-DNA切割下來，轉移到植物細胞中。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide18雙元載體系統1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide19農桿菌轉化植物細胞1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide20(三).改良植物性狀的策略基因克隆技術提供了一種新的改良植物的方法，它可以直接的改變植物的基因型。有兩種策略可以應用。

1）基因附加：通過添加1個或多個基因改變植物的性狀。

2）基因扣除：利用基因工程技術使一個或多個植物已經存在的基因失活。

滅活植物基因是通過反義技術來實現的。將外源基因反向的連接到載體中，當基因轉錄成mRNA后，與正常的mRNA是反向互補的。我們稱這種反向互補為反義RNA，縮寫為asRNA。

反義RNA阻止原有基因表達的機理尚不明了，但可以肯定，正義和反義RNA之間的雜交與這一事件有關，可能雙鏈的RNA很快被核酸酶降解，或者反義RNA阻止了核糖體與正義RNA的結合。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide21反義技術的原理1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide221.基因附加的方法我們以抗蟲基因為例來說明。1.1

理想的殺蟲劑在農業生產中危害最嚴重的是昆蟲。為了減少損失，一般使用殺蟲劑。大部分殺蟲劑沒有選擇性，殺滅害蟲的同時也消滅了天敵，同時對生物圈中的其他生物產生影響，包括人，污染了環境。有一些生物生長在植物體內，可以避免農藥的傷害。理想的殺蟲劑具有的特性:它必須對害蟲有害，但毒性應該有選擇性，對其他生物無害。殺蟲劑能夠必降解，作物收獲后不存在殘留，并且對環境無污染。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide23可以保護整個植株，不單單是地上部，免受害蟲危害。到目前為止，我們還未發現這樣的理想殺蟲劑，最相近的是來自于蘇云金桿菌的δ-內毒素。a)

蘇云金桿菌的δ-內毒素蘇云金桿菌在孢子形成的過程中，細胞內形成殺蟲晶體蛋白—稱為δ-內毒素，其活性很強，有時要比有機磷毒性高80000倍，而且選擇性很強，不同品系的細菌和成不同的毒蛋白。在細菌中積累的δ-內毒素是無活性的前體，昆蟲食用后，前毒素被蛋白酶消化后產生有毒性的蛋白，結合到昆蟲腸道內，破壞表皮細胞，使昆蟲不能進食，從而饑餓而死。不同昆蟲中，晶體結構不同產生了特異性。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide24CryI 鱗翅目幼蟲CryII 鱗翅目和雙翅目幼蟲CryIII 鱗翅目CryIV 雙翅目CryV 線蟲綱CryVI 線蟲綱1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide25蘇云金桿菌并不是最近才發現的，早在1904年即開始使用，可以作為無公害的殺蟲劑，但他很容易降解，所以要不斷的補充，增加了農民的成本。因此研究者試圖生產不需要連續補充的δ-內毒素，一種方法是利用蛋白質工程，修飾其蛋白結構使其更加穩定，另一種方法是通過基因工程是植物能夠合成自己的毒素。b)將δ-內毒素克隆到玉米中傳統殺蟲劑在玉米上效果較差，主要害蟲是玉米螟，生物技術學家試圖獲得能合成δ-內毒素的玉米。北卡萊羅納Ciba-Geigy實驗室使用Cry1A(b)內毒素，這是一個1155個氨基酸的蛋白，29-607位的片段具有毒性。Ciba-Geigy研究小組并沒有使用完整的基因，只使用了前648個密碼子，人工合成了這一片段，這樣可以對原始基因進行修飾，使用玉米偏愛的密碼子。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide26原始基因中GC含量是38%,而人工基因的GC含量為65%。將人工基因連接到盒式載體上，后接一個來自于CaMV的多腺苷酸化信號，利用微粒轟擊法將其引入玉米的胚中。胚胎長成植株后，利用PCR法鑒定。利用人工基因特異的片段作為PCR引物。下一步工作就是利用免疫技術鑒定轉基因植株是否合成了δ-內毒素，結果顯示人工基因確實具有活性。不同植株中產生的δ-內毒素數量不同，從250-1750ng/mg總蛋白，這種差異是由位置效應引起的。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide27位置效應1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide28轉基因植株是否對玉米螟有抗性呢？在田間調查了6周，應用兩條標準來衡量：害蟲對植株總的危害，以及蟲道的長度。轉基因植株表現了較好的抗蟲效果，對照蟲道長度40.7cm,轉基因植株蟲道只有6.3cm。1.2

其它的基因附加工程在水稻、棉花、馬鈴薯、番茄和其它作物上也進行了δ-內毒素工程，獲得昆蟲抗性也不僅僅是指有著一種方法。蛋白酶抑制劑也是較好的選擇，它可以一只昆蟲腸道內的蛋白酶活性，阻止或減緩害蟲生長，許多植物能產生蛋白酶抑制劑，如豇豆和commonbean,他們的基因已經被成功的轉移到其他植物中，但一般蛋白的表達量比較低。這種抑制劑對甲蟲的效果非常明顯，所以對需要長期貯存的種子作物是一種很好的選擇。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide292.基因扣除基因扣除（geneknockingout）這一詞語不是很恰當，因為并不去除基因，只是讓基因失活。有許多方法可以使基因失活，最成功的是反義技術。我們將以延長貨架期的工程番茄為例進行說明。2.1反義技術的原理在一個反義實驗中，克隆的基因是反向的連接到載體中，這意味著當克隆的基因轉錄成mRNA后，與正常的mRNA是反向互補的。我們稱這種反向互補為反義RNA，有時縮寫為asRNA。一個反義RNA阻止原有基因合成表達產物，我們尚不清楚其潛在的機理是什么，但可以肯定，正義和反義RNA之間雜交與這一事件有關，可能雙鏈的RNA很快被核酸酶降解，或者反義RNA阻止了核糖體與正義RNA的結合。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide302.2利用反義RNA延遲番茄果實的成熟美國的Calgene公司和英國的ICI種子公司利用反義技術改造番茄，延長其貨架期。a)

多聚半乳糖醛酸酶在番茄果實成熟過程中的作用番茄從開花到收獲需要大約8周的時間，第6周開始，果實的顏色和風味開始變化，此時成熟過程的基因開始啟動，包括多聚半乳糖醛酸酶，使果實開始軟化。運輸過程中，造成傷害，降低了商品品質。b)

克隆多聚半乳糖醛酸酶基因在1980s中期，ICI種子公司的生物技術部與Nottinghan大學合作進行了實驗。從正常多聚半乳糖醛酸酶基因的5’端獲得了一個730bp的限制性片斷，包含了一半的編碼序列，將植物的多腺苷酸化信號連接到片段的頭部，CaMV啟動子連接到尾部，插入Ti質粒pBIN19中。引入植物后，轉錄后形成了反義RNA。降低了多聚半乳糖醛酸酶基因的表達。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide31延遲成熟番茄的構建過程1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide321/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide33pBIN19分子重組到根癌農桿菌中，用來侵染番茄莖端，轉移到含kan的培養基中，再生形成了完整的植株。實驗的結果通過4個途徑分析：1

Southern雜交檢測反義基因2

Northern雜交檢測反義基因的轉錄，利用只能與反義RNA雜交的單鏈探針。3

反義基因對正義多聚半乳糖醛酸酶基因表達量的影響，通過與正義RNA的Northern雜交檢測，使用與正義mRNA特異的探針。史研究顯示，轉基因植株的多聚半乳糖醛酸酶mRNA的表達量明顯低于對照。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide344

聚丙烯酰胺凝膠電泳結果顯示，多聚半乳糖醛酸酶的表達量明顯降低。轉基因果實雖然也在逐漸的成熟，但可以存放很長的時間。這意味著反義RNA雖然不能完全將多聚半乳糖醛酸酶基因失活，但可以有效的降低基因的表達量，延緩成熟過程。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide35轉基因番茄PG酶活性的變化1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide36三.病毒介導的遺傳轉化植物病毒廣泛存在，而且不受單子葉或雙子葉的限制。因此病毒作為植物基因工程的載體日益受到人們的重視。在已知300種特征清楚的植物病毒中，單鏈RNA病毒約占91%，雙鏈DNA病毒、單鏈DNA病毒各占3%。RNA不適合于作為克隆載體，因為RNA的操作非常困難。在植物上已知有兩種DNA病毒，花椰菜花葉病毒（Cauliflowermosaicvirus,CaMV）和雙聯體病毒（geminivirus），但都不是基因克隆的理想載體。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide37花椰菜花葉病毒載體已用來克隆了一個基因進入蕪箐甘藍，有兩個因素限制了其應用：

1）花椰菜花葉病毒基因組的大小，即使是切除了非必須序列，花椰菜花葉病毒載體的承載插入片段的能力還是有限的，只能插入很小的片段。

2）花椰菜花葉病毒的寄主范圍非常窄，主要是蕓苔屬植物如蕪菁、甘藍和花椰菜等。

這類病毒比較有潛力侵染重要的作物，如玉米和小麥，然而在侵染過程中，這類病毒重新排列并刪除部分序列，攪亂插入的DNA序列。這種病毒可引起破壞性的侵染，需要嚴格的防護，防止載體從寄主中逃逸侵染自然中的植物。所以花椰菜花葉病毒作為克隆載體還需要進一步的改造。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide38四.基因槍轉化法農桿菌侵染雙子葉植物獲得轉基因植株是非常成功的，自然界中的農桿菌只侵染雙子葉植物，對單子葉植物不敏感。雖然通過添加乙酰丁香酮類物質可使農桿菌侵染單子葉植物，但單子葉植物的再生比較困難，因而農桿菌轉化單子葉植物仍然是比較困難的。1984年，科學家發現，超螺旋結構的細菌質粒，雖然不能在植物細胞中復制，但可以重組整合到植物染色體內。受這一現象的啟發產生基因直接轉移技術。重組機制并不清楚。因為細菌質粒與植物DNA之間沒有同源性。事實上整合是隨機的發生在植物染色體的任何位點。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide39植物基因直接轉移的原理1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide40基因槍（particlegun）又稱微彈轟擊法（microprojectilebombardment,particlebombardment,biolistic)。最早是由Cornell大學研制的火藥基因槍。1990年，美國杜邦公司推出了商品基因槍PDS-1000系統。基因槍的組成部分有：點火裝置、發射裝置、擋板、樣品室、真空系統組成。基因槍轉化的基本步驟如下：

DNA微彈的制備

DNA-微彈載體的制備

靶外植體準備

DNA微彈轟擊

轟擊后外植體的培養

基因槍轉化率差異很大，一般在10-3~10-2之間。McCabe在大豆上高達2%，而有的報道僅有10-4。相對于農桿菌介導的轉化率要低得多，而且基因槍轉化1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide41成本高；嵌合體比率大遺傳穩定性差。即使這樣，該方法在單子葉植物上也有廣泛應用，有如下優點：

a)無宿主限制，無論是單子葉植物和雙子葉植物都可以應用。

b)受體類型廣泛，原生質體、葉圓片、懸浮培養細胞、莖、根、以及種子的胚、分省組織、愈傷組織、花粉細胞、子房等幾乎所有具有分生潛力的組織或細胞都可以用基因槍進行轟擊。

c)可控度高，商品化的基因槍都可以根據實驗需要調控微彈的速度和射入濃度，命中特定層次的細胞。

d)操作簡便迅速。

正因為基因槍這些優點，使基因槍成功的應用于：植物基因轉化，特別是單子葉植物的轉化；外源基因導入植物細胞器；種質轉化（莖尖分生組織、配子體、胚胎細胞）。

e)植物基因表達調控研究。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide42第三節植物基因工程的應用一.利用植物轉基因技術研究基因的表達與調控（一）轉報告基因研究植物基因的表達與調控

植物對環境中的光、重力等因素尤為敏感。這些因素均可誘導基因的表達。利用報告基因環境因素的變化對基因表達的影響，是植物分子生物學的重要內容。在植物中常用的報告基因有：

I大腸桿菌的β－葡萄糖苷酸酶（GUS）:

相當于在微生物及動物系統中使用的β－半乳糖苷酶，只是其作用底物為葡萄糖苷酸。該酶在脊椎動物和微生物中表達，植物細胞中幾乎不表達。當gus基因轉入植物細胞內表達時，若與X－葡萄糖苷酸酶（X-gluc，與X-gal相似），保溫后，就會產生藍色反應，借此可以預測報告基因表達程度，但是該酶不能分泌在細胞外，因此在測定酶活時，須將細胞殺死，破碎。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide43

II昆蟲的熒光素酶基因：

植物活細胞基因表達的檢測可用昆蟲的熒光素酶基因作為報告基因，其工作原理如下：

將昆蟲熒光素和ATP表達熒光素酶的植物細胞混合，該酶催化昆蟲熒光素的氧化反應，并生成AMP、CO2和光，表達該酶的植物細胞或組織便可用感光膠片檢測。例如，葉子的表面用砂紙磨損然后注入含有昆蟲熒光素和ATP的緩沖液中，晾干，將X－光膠片覆蓋在葉子上，則表達昆蟲熒光素酶的細胞就會使膠片感光與同位素檢測方法一樣。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide44熒光素酶基因在植物中的表達1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide45（二）T-DNA插入滅活基因及克隆基因

Ti質粒上的T-DNA能隨機整合入植物染色體中，因而已廣泛應用于植物基因的定性及分離上。T-DNA插入某植物基因，便可導致其插入滅活，性狀發生改變。以此在體內鑒定滅活基因的生物學功能。此外，T-DNA還可用于克隆植物基因。

將含有NPTII標記基因的PBR322重組質粒導入含有T-DNA兩側邊界順序的Ti質粒中，轉化根瘤農桿菌，并將此菌侵染植物。獲得轉基因植物后，挑選各種突變株，并提取DNA，用SalI水解DNA，T-DNA區域及NPTII中無SalI切口，但pBR322上有一個SalI切口，位于Tcr基因內，連接后轉化大腸桿菌，切下植物基因組片段，作探針雜交植物cDNA文庫，便可獲得滅活的整個植物基因。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide46(三）利用轉座元件克隆植物基因轉座子可以從基因組的一個位置移動到另一個位置，如果插入到基因的編碼序列內，可以導致基因的失活，導致形狀變異。目前已在多種植物中發現轉座子的存在，如玉米的轉座子AC-DS系統，將這些轉座子導入其他植物中，篩選變異株，就可以將相關的基因克隆出來。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide47二.利用轉基因植物生產外源蛋白質一旦植物的轉基因技術發展起來，人們就感興趣利用轉基因植物作為生物反應器，生產異源蛋白質及其它高分子化合物。

（一）異源蛋白藥物

利用哺乳類動物細胞產生蛋白藥物是極其昂貴的，而植物生長成本較低，農田里可換得大量蛋白質藥物。目前這方面的項目仍在實驗室里進行：如人的腦腓肽、人血清蛋白、及小鼠的單克隆抗體等。舉例說明：

將小鼠的抗體輕鏈和重鏈基因分別在兩種煙草植物中表達，轉基因植物由根瘤農桿菌介導的基因轉化方法構建。然后兩種植物品系雜交，產生的子代植物表達小鼠的重鏈輕鏈兩種蛋白。從煙草的葉子里可檢測到完整的抗體分子，含量為葉細胞蛋白總量的1.5%實驗還表明，植物的蛋白分泌系統能夠識別小鼠抗體前體的信號肽順序。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide48（二）食用或工業用油首批大規模生產并取得商業效益的非食用性轉基因植物產品是工業用油，其中包括制造肥皂和去垢劑的月桂酸（12個碳原子）。科學家們僅表達一個特殊的基因就使油菜生產月桂酸而不是通常的18個碳原子的不飽和脂肪酸。這個實驗田試驗結果極其成功，經濟效益顯著。此外，利用油菜易于生長及產量高的特點，人們還致力于用它生產其它工業用油。如，作用潤滑油及尼龍生產的原料芥酸；用于麥淇淋生產的6－十八碳烯酸等等。

（三）高分子材料

通過轉基因植物獲得的高分子原材料范圍極其廣泛。包括：可被生物降解的聚羥丁酯塑料（PHB）以及天然棉花與聚酯的混合纖維等。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide49三.改良植物品種（一）控制果實成熟的轉基因植物

蔬菜和水果成熟后，其組織呼吸速度及乙烯合成速度普遍加快，并迅速導致果實皺縮和腐爛。通過基因工程抑制乙烯的合成和信號傳導，既可延長果實的壽命及存架期，也為果實的運輸提供了條件，具有重要的經濟意義。

1990年和1991年，兩位科學家分別用反義RNA技術，分別抑制了番茄中的ACC合成酶基因及EFE基因的表達，乙烯合成分別抑制了97%和99.5%明顯增加了番茄的保存期。

目前有關的研究工作仍在繼續，并已擴展到了草莓、梨、蘋果、香蕉、芒果、桃、甜瓜等。另外，切斷乙烯的信號傳導也可延緩轉基因果實的成熟，1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide50目前已經克隆乙烯的受體基因CTR1和ETR1等，轉基因果實的成熟被大大延遲。

減少水果由于損傷（如機械搬運）而變質的另一種思路是：

植物尤其是成熟果實中表達大量的半乳糖醛酸酶（PG）。它能水解果膠而溶解植物的細胞壁，使成熟果實易于損傷，降低PG的表達量也能有效地減少果實的損傷。具體方法是：將PGcDNA5'端區域反向接在花椰菜花斑病毒（CaMV）啟動子的下游。構成表達PG反義RNA的基因。這個基因重組入大腸桿菌－根瘤農桿菌的Ti穿梭質粒上。通過根瘤桿菌進入番茄細胞內。這種轉基因番茄表達大量的PG反義RNA。顯著地減少了PG的活性，使番茄不易軟化破損腐爛，并成為首次上市的轉基因植物，其商標為FLAVRSAVRTM。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide51（二）抗蟲害的轉基因植物昆蟲對農作物的危害是極大的。在美國，農場主每年花費幾十億美元去對付危害農作物的昆蟲。目前對付昆蟲的最主要武器仍是化學殺蟲劑。這些農藥不同程度地對人畜有害，污染環境。利用轉基因技術可望培養出抗蟲害的農作物優良品種。大致有三種戰略：

I含細菌內毒素的轉基因植物構建：

天然的微生物殺蟲劑，如蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis,Bt）已用了三十年了。該細菌能產生一種結晶蛋白，編碼基因位于Bt中一個75kb的質粒上。基因的表達依賴于Bt孢子形成。這種結晶蛋白分子量約為125KD，對許多昆蟲的幼蟲表現毒性。但對成蟲和脊髓動物無作用。Bt合成的只是無活性的原毒素（1178aa.）。當被幼蟲進食后，1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide52

其消化道中的蛋白酶便將毒素原蛋白水解成68kD的毒性片段。這個片段與幼蟲中腸細胞表面的受體結合，從而干擾這些細胞的正常功能。然而靠商業生產Bt孢子是有限的，且毒性蛋白原在體外并不穩定，因而保護期很短。最近含有修飾的毒性蛋白的轉基因抗蟲棉已問世。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide53

II蛋白酶抑制劑

BT轉基因植物容易產生抗性，而且抗蟲譜較窄。胰蛋白酶抑制劑是廣泛存在于種子和塊莖中一類蛋白質，在防御昆蟲和病原菌侵染中起重要作用。其抗蟲機理是：與昆蟲消化道內的蛋白消化酶結合，形成EI復合物，阻斷或減弱蛋白酶對外源蛋白的消化；EI還可以刺激昆蟲過量分泌消化酶，產生厭食反應。

胰蛋白酶抑制劑用于抗蟲植物培育一般不會產生抗性，而且抗蟲譜廣。但在植物中的表達強度較低，抗蟲性不強。

III細菌毒素與絲氨酸酶蛋白酶抑制劑的混合植物實驗結果表明：混合比單獨毒素提高20倍。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide54（三）抗病的轉基因植物

1.抗病毒

農作物感染病毒是個嚴重的農業問題。感染導致生長緩慢、產量降低、質量減退。構建抗病毒轉基因植物有以下幾種策略：

I病毒外殼蛋白基因

Cp基因導入植物細胞后，可能以下述作用方式使植物獲得保護：（1）當裸露的病毒遺傳物質進入植物細胞后，立即被外殼蛋白包裝，阻止了病毒核酸的翻譯與復制。（2）在Cp水平上阻止病毒脫殼。TMV外殼蛋白CP的轉煙草植物，該轉基因植物在TMV存在條件下，能抗病毒感染30天左右，正常植物3~4天之后使被TMV感染。最近的實驗結果表明，CP表達抵御病毒侵襲也在其它谷物中成功，如馬鈴薯、番茄、苜蓿等。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide55II轉表達復制酶亞基反義基因的植物：

將TMV5'端基因片段（含復制酶亞基因）作為目的基因，成功地構建了其反義基因的轉煙草植株。實驗結果表明，病毒RNA的合成抑制了25~50倍。系統的病毒侵染癥狀特征消失或大量減少。

此外，衛星RNA、核糖體失活蛋白基因、干擾素也成功的應用于轉基因抗病毒植物的培育。

2.抗細菌基因工程

細菌性病害防治較為困難，藥劑常常不能完全奏效，同時又易造成環境污染。某些情況下，作物本身缺乏抗性材料，限制了抗病育種的發展。重組DNA技術開辟了一條解決問題的新途徑。常用的抗細菌基因有：殺菌肽、溶菌酶。

1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide563.抗真菌基因工程

基于對植物防御機制的初步了解，目前提出了以下基因工程抗真菌病害的技術路線：

幾丁質酶與β-1,3-葡聚糖酶

過氧化酶

防御素

植物本身抗病基因和病原菌無毒基因

阻礙真菌蛋白質合成的抗真菌蛋白，核糖體失活蛋白（RIP）

滲透蛋白基因（osmotin）抗毒素（phytoalexin）、植保素等。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide57（四）抗除草劑的轉基因植物在農作物大田里，雜草的存在可使農作物減產10%。目前使用的除草劑專一性不強，或多或少對農作物生長有影響，這就限制了除草劑的大量使用。現有三種戰略構建抗除草劑的農作物：

I強化表達除草劑的靶蛋白（酶）基因：

目前使用的大量這類的除草劑中，只有少數幾種除草劑的細胞靶部位被鑒定。5-烯醇式為酸基莽草酸－3－磷酸鹽合成酶（EPSPS），是植物葉綠體中芳香族必需氨基酸生物合成中的一個酶，而除草劑草甘磷glyphosate（glifoseit）是通過強烈抑制該酶而殺死植物的。glyphosate在除草劑中使用最為廣泛。因為它很少的劑量就能殺滅廣譜雜草，對環境的危害也比其它除草劑小，進入土壤后能被微生物迅速降解。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide58將來自矮牽牛花的EPSPScDNA轉入植物中，轉基因酶活比非轉基因植物提高了20倍，使得轉基因植物較好地耐受glyphosate的存在。但轉基因植物生長緩慢。

II克隆表達除草劑的突變靶蛋白（酶）基因：

Klebsiellapneumoniae中的EPSPS對草甘磷親和性降低了16倍

鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium)分離出了一個EPSPS突變體，轉入煙草，表現出了較好的耐性。Monsanto公司的Kishore在E.coli分離出了一個突變體SM-1，對草甘磷的耐性提高了8000倍。

III除草劑的降解、解毒基因

溴腈衍生物（Bromoxynil）是一種抑制光合成反應的除草劑，Klebsiellaozaenae有一基因編碼一種腈水解酶，能將Bromoxynil降解為3,5－二溴－4羥－苯甲酸。將該細菌基因轉入煙草中已獲成功。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide59（五）改變花型及花色的轉基因植物全世界花卉產業的產值高達上百億美元，通過插花工藝來裝飾花束和花籃，需要培育各種花卉植物。目前構建具有不同花型及花色特征的轉基因花已成可能。有關研究工作主要集中在世界最大的花卉出口國荷蘭。

花冠的顏色是由花冠中的色素組成決定的。在大多數花卉中，色素為黃酮類物質。它由苯丙氨酸通過一系列的酶促反應生成。而顏色主要取決于黃酮類似物質側鏈取代基的不同性質及結構。比如花青素衍生物呈藍色。

在黃酮類色素物質的生物合成途徑中，苯基苯乙烯酮合成酶（CHS）是一個關鍵酶。

在矮牽牛屬植物中已成功地應用反義RNA技術抑制1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide60了CHS基因的表達，使得在轉基因植物中花冠的顏色從野生型的紫紅色轉變成了白色。并且因對CHS基因表達的抑制程度差異而出現了一系列中間類型的花色。在煙草中，反義RNA抑制CHS基因表達，使野生型的桃紅色轉變成了白色花冠。

天然的玫瑰沒有藍色的花冠，因為薔薇科植物缺少合成藍色色素的酶系，從矮牽牛花中克隆了一個控制合成藍色素的基因。目前正在將該基因轉入玫瑰植物中，期望出藍色的玫瑰。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide61（六）抗環境壓力的轉基因植物環境大氣層中的氧自由基（超氧化物負離子）對植物的損傷是嚴重的。在生理狀況下，植物體內的超氧化歧化酶（SOD）將之轉化為過氧化氫，后者經過氧化酯作用后，分解釋放出水和氧氣。但過量的氧自由基則對植物的某些組織如花卉的壽命有所影響。將SOD基因轉入花卉植物中，可以節省氧氣的需求量，以增加鮮花的保存期。

另外，抗鹽、抗堿、抗寒、抗旱抗熱的轉基因植物也在研究中。常用的抗逆基因主要有以下幾種：抗凍蛋白（antifreezeprotein,AFP）

脯氨酸合成酶

甜菜堿合成酶

滲調蛋白（osmotin,OSM）

乙醇脫氫酶1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide62（七）改良作物的品質傳統的植物育種以及雜交回交技術在過去一段時間內培育出許多農作物優良品種，但這種技術已接近極限，植物的轉基因技術有望打破這種限制：

1.植物淀粉合成的控制：

淀粉由直鏈淀粉與支鏈淀粉組成，淀粉的質量與淀粉的組成有關。植物淀粉合成中的兩個重要的酶是淀粉合成酶（GBSS）以及分支酶（BE）。分別控制直鏈淀粉與支鏈淀粉的合成。淀粉的應用領域包括食品、化學、造紙和紡織工業。不同的用途對淀粉的性質有不同的要求。工業上一般要求淀粉中直鏈淀粉的量要盡可能少。進入九十年代，人們已將內衣和外源GBSS的反義基因成功地導入馬鈴薯中，使其GBSS活性降低了70%~100%。完全的抑制可得到不含直鏈的淀粉，但淀粉的總量不變。另外，導入EB的反義基因，也可得到無支鏈的淀粉。1/14/20244:40PM歡迎02級農業生物技術班同學們聽課！Slide63

2.油科植物中脂肪酸合成的控制

植物油的組分大都是含有雙鏈的不飽和脂肪酸，故在室溫下多呈液態。人造黃油的工藝是將植物油催化加氫，使其熔點升高，加工成本很高，并且會導致順式雙鏈變成對健康不利的反式雙鏈。將植物內控制脫飽和反應的硬脂酰－ACP脫飽和酶基因的反義基因導入植物中，即可有效地提高飽和脂肪酸的含量。

3.植物種子儲存蛋白合成的控制

一般的農作物糧食種子儲存蛋白的營養價值因缺少幾種氨基酸而受到限制（Lys、Met），人們將蠶豆中的一種廣譜蛋白基因植入玉米中，獲得了高營養價值。下一進是進行土豆及水稻的改良。

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