第2章細胞工程第1節

植物細胞工程

照片中兩只可愛的小猴，分別叫“中中”和“華華”，它們誕生于2017年，一出生就轟動了全世界，這是我國科學家的研究成果。你知道它們是如何培育出來的嗎？

在這之前，科學家培育了胚胎細胞克降猴，你知道兩者有什么不同嗎？其實，自1996年首個體細胞克隆動物多莉羊（Dolly）誕生以來，人類已經成功克隆了馬、牛和豬等大型家畜，但為什么體細胞克隆猴的誕生能轟動世界呢？第2章細胞工程1902年，哈伯蘭特，提出細胞全能性的理論。1958年，斯圖爾德，發現胡蘿卜的體細胞可分化為胚，為細胞全能性理論提供了強有力的支持。1960年，科金，用真菌的纖維素酶分解番茄根的細胞壁，成功獲得了原生質體。1964年，古哈，在培養毛曼陀羅的花藥時，首次得到了由花藥中的花粉粒發育而來的胚。1971年，卡爾森，誘導煙草種間原生質體融合，獲得了第一株體細胞種間雜種植株。1974年，土壤農桿菌的Ti質粒發現。之后，該質粒應用于植物分子生物學領域，促進了植物細胞工程與分子生物學技術的緊密結合?！究萍继剿髦?/p>

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植物細胞工程的發展歷程】1975年，米爾斯坦和科勒，創立單克隆抗體技術1890年，希普，世界上首例胚胎移植成功1907年，哈里森，首創了動物組織體外培養法1951年，張明覺，發現哺乳動物精子獲能現象1958年，格登，體細胞核移植成功1959年，試管家兔誕生1978年，胚胎分割移植工程1981年，埃文斯，分離和培養小鼠胚胎干細胞1996年，克隆羊誕生2006年，山中伸彌，獲得誘導多能干細胞2014年，單細胞基因組測序進行遺傳病篩查的試管嬰兒誕生2017年，我國科學家首次培育了體細胞克隆猴【科技探索之路·動物細胞工程的發展歷程】

“其茅葺，其葉青青，猶綠衣郎，挺節獨立，可敬可慕。迨（dài）夫開也，凝情瀼（ráng）露，萬態千妍，薰風自來，四坐芬郁，豈非入蘭室乎！豈非有國香乎”這是我國歷史上第一部蘭譜——《金漳蘭譜》（宋·趙時庚）中對蘭花的一段描述。

從古至今，我國人民都把蘭花看作高潔、典雅的象征，很多人喜歡養蘭花。但是，蘭花種子通常發育不全，在自然條件下萌發率極低；傳統分株繁殖的方法又存在繁殖周期長、繁殖率低等問題，如果靠自然繁殖，蘭花的價格可想而知了。如何能讓名貴的蘭花大量、快速地繁殖，從而走入尋常百姓家呢？從社會中來利用植物組織培養技術可以大量、快速地培育蘭花。第1課時

植物細胞工程的基本技術一、細胞工程與細胞全能性的概念1.細胞工程的概念：是指應用細胞生物學、分子生物學和發育生物學等多學科的原理和方法，通過細胞器、細胞或組織水平上的操作，有目的地獲得細胞、組織、器官、個體或其產品的一門綜合性的生物工程。動物細胞工程植物細胞工程植物組織培養植物體細胞雜交細胞工程2.細胞全能性（1）概念：細胞經過分裂和分化后，仍然具有產生完整生物體或分化成其他各種細胞的潛能。實例：胡蘿卜韌皮部細胞發育成完整植株受精卵發育成個體（動植物）蜜蜂受精卵發育成工蜂，卵細胞發育成雄峰用一片葉子、一片花瓣、一粒花粉繁殖出新的植株韌皮部細胞細胞團塊根或芽幼苗胡蘿卜植株葉子花粉花瓣細胞2.細胞全能性（2）體現細胞全能性的原因：生物體的每個細胞中都含有發育成為完整個體所需的全部遺傳物質。（3）生物體生長發育過程中并不是所有細胞都表現出全能性①不體現全能性的實例：②不體現全能性的原因：基因在特定時間、空間條件下選擇性表達芽原基的細胞只能發育為芽葉原基的細胞只能發育為葉生長點葉原基芽軸芽原基枝芽結構示意圖葉原基的細胞只能發育為葉芽原基的細胞只能發育為芽在特定的時間和空間條件下，細胞中的基因會選擇性表達（4）植物細胞表現出全能性的條件①離體②一定的營養物質、植物激素③適宜的溫度、pH、光照、無菌等外界條件（3）生物體生長發育過程中并不是所有細胞都表現出全能性分化程度低的＞分化程度高的分裂能力強的＞分裂能力弱的受精卵＞生殖細胞＞體細胞受精卵＞干細胞＞體細胞植物細胞＞動物細胞（5）細胞全能性大小比較：④不同生物細胞的全能性：①體細胞全能性與細胞分化程度：②體細胞全能性與細胞分裂能力：③不同類型細胞的全能性:2.細胞全能性二、植物組織培養技術1.植物組織培養（1）概念：是指將離體的植物器官、組織或細胞等，培養在人工配制的培養基上，給予適宜的培養條件，誘導其形成完整植株的技術。（2）生殖方式：無性生殖（3）分裂方式：有絲分裂1958年，美國科學家斯圖爾德（F.C.Steward）將胡蘿卜韌皮部的一些細胞進行培養獲得了完整的胡蘿卜新植株。二、植物組織培養技術2.原理：植物細胞一般具有全能性3.過程：外植體脫分化愈傷組織再分化芽、根試管苗移栽完整植株接種外植體誘導愈傷組織誘導生芽誘導生根脫分化再分化移栽成活（2）脫分化：在一定的激素和營養條件的誘導下，使已經分化的細胞失去其特有的結構和功能，轉變為未分化的細胞。（1）外植體：離體培養的植物器官、組織或細胞。接種外植體誘導愈傷組織誘導生芽誘導生根移栽成活脫分化再分化再分化3.過程：（3）愈傷組織：通過脫分化后的細胞，形成不定形的薄壁組織團塊。接種外植體誘導愈傷組織誘導生芽誘導生根移栽成活脫分化再分化再分化3.過程：接種外植體誘導愈傷組織誘導生芽誘導生根移栽成活脫分化再分化再分化3.過程：（4）再分化：愈傷組織在培養過程中重新分化成芽、根等器官的過程。4.探究·實踐：菊花的組織培養（1）實驗原理①植物細胞一般具有

；全能性②在一定的激素和營養等條件的誘導下，已經分化的細胞可以經過脫分化和再分化，形成胚狀體，長出芽和根，進而發育成完整的植株；外植體脫分化愈傷組織再分化根、芽等試管苗完整植株移栽胚狀體胚狀體（體細胞胚）：離體培養條件下，體細胞培養或生殖細胞培養，沒有經過受精過程，但是形成與經過受精后胚胎發育過程所形成的胚胎類似的胚狀類似物結構。植物組織培養的兩種途徑直接途徑間接途徑外植體胚狀體幼苗外植體胚狀體幼苗愈傷組織胡蘿卜根韌皮部的細胞愈傷組織胚狀體幼苗胡蘿卜胚狀體：離體培養條件下，沒有經過受精過程，但是經過了胚胎發育過程所形成的胚狀類似物，因而統稱為體細胞胚或胚狀體。胚狀體途徑4.探究·實踐：菊花的組織培養細胞分裂素生長素芽分化愈傷組織根分化生長分裂定方向高根低芽中愈傷（1）實驗原理③植物激素中生長素和細胞分裂素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關鍵激素，它們的濃度、比例等都會影響植物細胞的發育方向。適中：利于愈傷組織的形成低：利于芽的分化高：利于根的分化生長素細胞分裂素①了解植物組織培養的基本原理。②了解生長素和細胞分裂素的濃度、用量的比例對菊花愈傷組織形成和分化的影響。③嘗試進行植物組織培養。（2）實驗目的4.探究·實踐：菊花的組織培養（3）材料用具①外植體：幼嫩的菊花莖段（容易誘導形成愈傷組織）②體積分數為70%的酒精：對手、超凈工作臺、外植體進行消毒③質量分數為5%左右的次氯酸鈉溶液：對外植體進行消毒④無菌水：清洗外植體⑤培養基（參見本書116頁附錄1）包括無機營養成分（水和無機鹽）、有機營養成分（蔗糖、氨基酸、維生素等）、特定濃度和比例的激素（主要是生長素和細胞分裂素）蔗糖的作用：提供能量，調節滲透壓滅菌方法為：濕熱滅菌法4.探究·實踐：菊花的組織培養①培養基名稱：

；②物理性質：

；③碳源：

。植物組織培養常用的培養基配方（P116）

MS培養基

固體培養基有機碳源（蔗糖）（4）方法步驟Ⅰ.用酒精擦拭雙手和超凈工作臺臺面Ⅱ.外植體的消毒4.探究·實踐：菊花的組織培養①消毒流水沖洗

→酒精消毒30s

→無菌水清洗2～3次

→次氯酸鈉溶液處理30min

→無菌水清洗2～3次將消過毒的外植體置于無菌培養皿中→用無菌濾紙吸去表面的水分→用解剖刀將外植體切成0.5～1cm長的小段。（4）方法步驟4.探究·實踐：菊花的組織培養②外植體的切段防止雜菌生長：①雜菌與培養物競爭（種間競爭）營養；②產生有害物質危害培養物。

在酒精燈火焰旁，將外植體的1/3～1/2插入誘導愈傷組織的培養基中。用封口膜或瓶蓋封蓋瓶口，并在培養瓶上作好標記。注意：接種時注意外植體的方向，不要倒插。

（形態學上端朝上，下端朝下）③接種外植體（4）方法步驟4.探究·實踐：菊花的組織培養注意：該過程一般不需要光照。

有光易形成維管組織，不易形成愈傷組織。④誘導愈傷組織

將接種了外植體的錐形瓶或植物組織培養瓶置于18～22℃的培養箱中培養。在培養過程中，定期觀察和記錄愈傷組織的生長情況。（脫分化）（4）方法步驟4.探究·實踐：菊花的組織培養

培養15～20d后，將生長良好的愈傷組織轉接到誘導生芽的培養基上。長出芽后，再將其轉接到誘導生根的培養基上，進一步誘導形成試管苗。

（再分化）注意：每日需要給予適當時間和強度的光照。

（光照培養，促進葉綠素合成）（4）方法步驟4.探究·實踐：菊花的組織培養⑤誘導生芽生根適中高低生長素細胞分裂素愈傷組織再分化芽根外植體脫分化再分化

移栽前先打開封口膜或瓶蓋，讓試管苗在培養箱內生長幾日。用流水清洗掉根部的培養基后，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環境中，待其長壯后再移栽入土。每天觀察并記錄幼苗的生長情況，適時澆水、施肥，直至開花。⑥移栽（4）方法步驟4.探究·實踐：菊花的組織培養（5）注意事項①實驗中使用的培養基和所有器械都要滅菌，接種操作必須在酒精燈火焰旁進行，并且每次使用后的器械都要滅菌。②接種時注意外植體的方向（形態學上下端），不要倒插。③誘導愈傷組織期間一般不需要光照，在后續的培養過程中，每日需要給予適當時間和強度的光照。4.探究·實踐：菊花的組織培養1.A、B過程分別為

。A過程一般

光照，該過程細胞分裂方式是

，B過程細胞分裂方式是

，同時也進行

，該過程

光照，因為

。C是

。2.影響A、B過程的關鍵因素是

，主要是

和

，二者添加的

會影響A過程和B過程。3.植物組織培養是一個

（無性繁殖或有性繁殖）過程。有絲分裂細胞分化植物激素細胞分裂素生長素無性繁殖有絲分裂濃度和比例【即時練習】下列是植物組織培養流程圖，請回答：植物體根、芽或胚狀體外植體ABC脫分化、再分化愈傷組織不需要葉綠素的合成需要光照需要欲培育地上長番茄和地下結馬鈴薯的“超級作物”。你有什么妙招？【思考·討論】×土豆西紅柿1.通過有性雜交能實現嗎？為什么？不能，不同物種之間存在生殖隔離。植物體細胞雜交技術。2.有沒有方法可以打破生殖隔離，實現遠緣雜交育種，獲得“番茄-馬鈴薯雜種植株”呢？【思考·討論】1.概念：將不同來源的植物體細胞，在一定條件下融合成雜種細胞，并把雜種細胞培育成新植物體的技術。三、植物體細胞雜交技術2.技術流程去除細胞壁去除細胞壁脫分化再分化A細胞B細胞雜種細胞AB脫分化再分化雜種植株愈傷組織A原生質體B原生質體再生細胞壁2.技術流程AB原生質體原生質體融合去除細胞壁三、植物體細胞雜交技術原生質體：脫去細胞壁的細胞植物細胞=細胞壁+原生質體④酶解法原理：植物細胞的細胞壁主要由纖維素和果膠構成；酶具有專一性（1）去除細胞壁①去壁原因：細胞壁阻礙著細胞間的雜交（阻礙了原生質體間的融合）②方法：酶解法③相關酶：纖維素酶和果膠酶2.技術流程原生質體細胞壁細胞膜細胞質液泡細胞核概念辨析：原生質體和原生質層原生質體：脫去細胞壁的細胞，包括細胞膜、細胞質、細胞核。原生質層：成熟植物細胞的細胞膜、液泡膜和介于這兩層膜之間的細胞質?！咀⒁狻抠|壁分離的“質”指的是原生質層。原生質層2.技術流程②方法：物理法：電融合法、離心法等化學法：聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法等①原理：細胞膜具有一定的的流動性

（2）原生質體間的融合注意：去除細胞壁和誘導原生質體融合時，不能在低滲溶液中進行。將細胞放在等滲或略大于的溶液中，防止原生質體吸水而漲破，保持原生質體正常。剛剛開始融合（上）和已經融合（下）的原生質體除去了細胞壁的植物（煙草）原生質體煙草不同物種之間的體細胞雜交（3）雜種細胞培育成雜種植株2.技術流程①技術：植物組織培養技術②原理：植物細胞的全能性③根據植株性狀對雜種植株進行篩選2.技術流程②植物體細胞雜交完成的標志：（4）兩個標志①植物細胞融合完成的標志：再生出新的細胞壁，形成雜種細胞（在此過程中高爾基體參與、線粒體供能）培育出雜種植株（5）體細胞融合成功后，培養基中主要有5種類型的細胞（A、B、AA、BB、AB），其中兩兩融合細胞類型有3種（AA、BB、AB），而真正符合要求的是AB，因此要對融合細胞進行篩選。AB2.技術流程AAAA番茄BBBB馬鈴薯ABABAAAABBB（6）雜種細胞中染色體數、染色體組數，都采用直接相加的方法。A細胞基因型為Aabb，B細胞基因型為ccDd2.技術流程①假設用于體細胞雜交的雙方細胞都有2個染色體組，則雜種細胞有4個染色體組，由雜種細胞發育而來的雜種植株被稱為異源四倍體。該雜種植株聯會正常，表現為可育。1.雜種細胞AB染色體數為？2.雜種細胞AB染色體組數為？8條染色體4個染色體組（異源四倍體）3.雜種細胞AB基因型為？AabbccDd3.變異類型：染色體數目變異打破生殖隔離，實現遠緣雜交育種，培育植物新品種。5.意義：三、植物體細胞雜交技術屬于無性生殖，不遵循孟德爾遺傳定律4.生殖方式：6.植物體細胞雜交技術的實例①培育出了白菜—甘藍、普通小麥—長穗偃麥草等雜種植株。②在木本植物的體細胞雜交方面，培育出了多種柑橘屬不同種間的雜種植株。白菜甘藍白菜—甘藍×為什么“番茄—馬鈴薯”超級雜種植株沒有如科學家所想象的那樣，地上長番茄、地下結馬鈴薯？