微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用課題2:土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)一、課題目標(biāo)

研究培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇作用，進(jìn)行微生物數(shù)量的測(cè)定。

二、課題重點(diǎn)與難點(diǎn)

重點(diǎn)：對(duì)土樣的選取和選擇培養(yǎng)基的配制。難點(diǎn)：對(duì)分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)。三、研究思路

微生物的選擇培養(yǎng)，是指利用培養(yǎng)基的組成使適宜生長(zhǎng)的特定微生物得到較快繁殖的技術(shù)，也稱為微生物的“選擇培養(yǎng)”。

（一）篩選菌株在本課題提供的選擇培養(yǎng)基的配方中，尿素是培養(yǎng)基中的惟一氮源，因此，原則上只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長(zhǎng)。但實(shí)際上，微生物的培養(yǎng)是一個(gè)非常復(fù)雜的問(wèn)題，有些微生物可以利用其他微生物的代謝產(chǎn)物生長(zhǎng)繁殖，因此能夠在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物不一定是所需要的微生物，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

A同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能的解釋有兩種。一是由于土樣不同；二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。

（三）設(shè)置對(duì)照究竟是哪個(gè)原因，可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。另一種方案：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。通過(guò)這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說(shuō)服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。實(shí)驗(yàn)方案有兩種一種方案：可以由其他同學(xué)用與A同學(xué)一樣的土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無(wú)誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問(wèn)題。四、實(shí)驗(yàn)案例

實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟如下:

1.土壤取樣

從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。土壤中某樣品細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基將菌液稀釋相同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對(duì)照，用來(lái)判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。由于初次實(shí)驗(yàn)，對(duì)于稀釋的范圍沒(méi)有把握，因此選擇了一個(gè)較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103～107。每個(gè)稀釋度下需要3個(gè)選擇培養(yǎng)基，1個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，因此共需要15個(gè)選擇培養(yǎng)基，5個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。此外，還需要準(zhǔn)備8個(gè)滅菌的試管和1個(gè)滅菌的移液管。

2.制備培養(yǎng)基

將10g土樣加入盛有90mL無(wú)菌生理鹽水的錐形瓶中（錐形瓶體積為250mL），充分搖勻，吸取上清液1mL，轉(zhuǎn)移至盛有9mL的生理鹽水的無(wú)菌大試管中，依次等比稀釋至107稀釋度，并按照由107～103稀釋度的順序分別吸取0.1mL進(jìn)行平板涂布操作。按照濃度從低到高的順序涂布平板，不必更換移液管。

3.微生物的培養(yǎng)與觀察

將涂布好的培養(yǎng)皿放在30℃溫度下培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)有不同的菌落產(chǎn)生。比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。挑選選擇培養(yǎng)基中不同形態(tài)的菌落接入含酚紅培養(yǎng)基的斜面中，觀察能否產(chǎn)生如課本中圖2-10的顏色反應(yīng)。為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？

答：這是因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量（單位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2185萬(wàn)，放線菌數(shù)約為477萬(wàn)，霉菌數(shù)約為23.1萬(wàn)。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。思考題4.細(xì)菌的計(jì)數(shù)

當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對(duì)應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。

關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。五、操作提示

無(wú)菌操作

做好標(biāo)記

規(guī)劃時(shí)間

六、課題成果與評(píng)價(jià)

（一）培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落

對(duì)照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基沒(méi)有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說(shuō)明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。

伊紅—美藍(lán)培養(yǎng)基是鑒別培養(yǎng)基，可以用來(lái)檢測(cè)自來(lái)水中的大腸桿菌是否超標(biāo)，因?yàn)榈拇x產(chǎn)物與伊紅—美藍(lán)結(jié)合，使菌落呈深紫色并帶有金屬光澤，使大腸桿菌的菌落顯示出來(lái)，并沒(méi)有促進(jìn)大腸桿菌的生長(zhǎng)和抑制其他微生物的生長(zhǎng)。例如：鑒別大腸桿菌培養(yǎng)基大腸桿菌呈黑色中心,有或無(wú)金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)上典型特征

如果學(xué)生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，需要進(jìn)一步分析產(chǎn)生差異的原因。（二）樣品的稀釋操作是否成功如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30～300的平板，則說(shuō)明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。

（三）重復(fù)組的結(jié)果是否一致本課題知識(shí)小結(jié):七、例題解析

例1．對(duì)細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律測(cè)定的正確的表述是A．在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行B．至少接種一種細(xì)菌C．接種一個(gè)細(xì)菌D．及時(shí)補(bǔ)充消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)解析：細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律的測(cè)定是人們?cè)谝欢l件下進(jìn)行的。這些條件是：一種細(xì)菌、恒定容積的培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基、定時(shí)測(cè)定細(xì)菌總數(shù)。在這些條件下，才能測(cè)定出細(xì)菌的生長(zhǎng)規(guī)律。測(cè)定時(shí)只能用一種細(xì)菌的子細(xì)胞群體的變化規(guī)律表達(dá)微生物的生長(zhǎng)；恒定容積是給微生物提供一定的生存環(huán)境；液體培養(yǎng)基才能通過(guò)樣品推測(cè)細(xì)菌總數(shù)。若接種多種細(xì)菌，則會(huì)發(fā)生種間斗爭(zhēng)而不能測(cè)定一種微生物的生長(zhǎng)規(guī)律。在接種時(shí)，要保證一定的接種量。答案：A例2．在微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律的測(cè)定中，種內(nèi)斗爭(zhēng)最顯著最激烈的時(shí)期是

A．調(diào)整期B．對(duì)數(shù)期

C．穩(wěn)定期D．衰亡期

解析：種內(nèi)斗爭(zhēng)是一種生態(tài)因素。種內(nèi)斗爭(zhēng)反應(yīng)了種內(nèi)生物對(duì)生存空間和生活資源的爭(zhēng)奪。在生活空間充裕，營(yíng)養(yǎng)充足的時(shí)候，種內(nèi)斗爭(zhēng)的程度是比較低的。隨著微生物個(gè)體數(shù)目的增加，每個(gè)個(gè)體的生存空間越來(lái)越少，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也越來(lái)越少，每個(gè)個(gè)體對(duì)生存空間和資源的爭(zhēng)奪也越來(lái)越激烈，種內(nèi)斗爭(zhēng)就越來(lái)越激烈。由此可知，在穩(wěn)定期的種內(nèi)斗爭(zhēng)最激烈。在衰亡期，微生物的數(shù)目已經(jīng)開(kāi)始減少，pH已經(jīng)極度不適于微生物的生存，次級(jí)代謝產(chǎn)物積累到很高的程度，這時(shí)的微生物的生存斗爭(zhēng)主要是與無(wú)機(jī)環(huán)境的斗爭(zhēng)。答案：C例3．（2005年江蘇）抗生素作為治療細(xì)菌感染的藥物，其高效性和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值使抗生素工業(yè)經(jīng)久不衰。其中青霉素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用具有劃時(shí)代的意義。⑴青霉素發(fā)酵產(chǎn)生青霉素。青霉菌的新陳代謝類型是

，青霉素是青霉菌的

代謝產(chǎn)物。⑵在生產(chǎn)和科研中，常選用處于

期的青霉菌作為菌種或研究材料，此時(shí)的青霉菌代謝旺盛，

和

比較穩(wěn)定。⑶對(duì)青霉菌菌體生長(zhǎng)情況的測(cè)定：取一定體積的發(fā)酵液，經(jīng)離心分離、反復(fù)洗滌后，

，再計(jì)算發(fā)酵罐中菌體的總重量。異養(yǎng)需氧型次級(jí)對(duì)數(shù)個(gè)體的形態(tài)生理特性稱菌體的濕重（烘干后重量）

解析：青霉菌屬于真菌，其代謝類型應(yīng)為異養(yǎng)需氧型，而青霉素作為它的代謝產(chǎn)物，并不是它生長(zhǎng)、繁殖所必需