第12章轉基因生物和基因打靶Transgenicanimalandgenetargeting第一節轉基因動物transgenicanimal概念:指用人工方法將外源基因導入或整合到基因組內，并能穩定傳代的一類動物。特點：分子及細胞程度的操作，組織和整體程度的表達。目的：培育新種，獲取人類所需的生物產品，或進展基因功能的研討。轉基因研討大事記1974年，美國學者Jaenisch運用顯微鏡注射法把基因導入真核細胞。1981年，美國科學家將外源基因導入動物胚胎，創建了轉基因動物技術。1982年獲得轉基因小鼠。1987年，世界上第一只商業化轉基因綿羊在英國著名的羅斯林研討所誕生。這只轉基因母羊的乳汁中可以分泌α—抗胰蛋白酶。1989年，意大利學者用精子作為載體，勝利地獲得了純系轉基因小鼠。

1997年2月，英國羅斯林研討所維爾穆特博士科研組公布體細胞克隆羊“多利〞培育勝利。1997年10月，英國羅斯林研討所宣布已克隆出3只攜帶有人凝血因子Ⅸ基因轉染綿羊。1999年2月，上海遺傳研討所宣布轉基因試管牛“滔滔〞誕生，其體內被檢測到帶有人的血潔白蛋白基因，這項成果被評為當年“中國十大科技進展〞之一。2000年6月22日晚8時整，生物胚胎工程專家張涌教授在西北農林科技大學種羊場順利接生了一只雌性體細胞克隆山羊陽陽。談家楨院士〔左〕、著名老中醫徐蔚霖教授〔右〕，曾溢滔院士〔中〕，轉基因試管牛“滔滔〞思索題轉基因動物的制備應包括那些環節？制備轉基因動物能夠會遇到哪些問題？他以為可采用哪些方法去處理？三、轉基因動物建立流程1、待轉移的目的基因的獲得與設計2、動物遺傳背景及種系的選擇在進展轉基因動物研討時要思索遺傳背景及種系的問題。

3、常用的細胞1〕受精卵：受精卵→基因操作→注射假孕動物子宮→胚胎→個體。2〕胚胎干細胞：從著床前的動物胚胎中分別多功能胚胎干細胞→基因操作→注射入動物囊胚→構成嵌合體胚胎→嵌合個體。

5、導入基因顯微注射法：用顯微注射儀將外源基因直接注射入實驗動物受精卵中，利用外源基因整合到DNA中，從而得到轉基因動物。特點：導入速度快，操作簡單，對DNA大小無限制，不需求載體，整合效率較高，它可以直接獲得純系。缺陷：需求貴重精細儀器，技術操作較難，并且外源基因的整合位點和整合的拷貝數都無法控制，易呵斥宿自動物基因組的插入突變，引起相應的性狀改動，重那么致死逆轉錄病毒感染法：將目的基因重組到逆轉錄病毒載體上，制成高濃度的病毒顆粒，人為感染著床前或著床后的胚胎，也可以直接將胚胎與能釋放逆轉錄病毒的單層培育細胞共孵育以到達感染的目的，經過病毒將外源目的基因插入整合到宿主基因組DNA中去。特點：用于分裂后的早期胚胎，特別適于禽類的轉基因研討。單點單拷貝插入，外源基因的完好性不易被破壞。精子載體法：經電穿孔等方法把外源基因導入精子，令其與卵子結合，受精。6、接受外源基因的個體的產生1〕受精卵：受精卵→基因操作→注射假孕動物子宮→胚胎→個體。2〕胚胎干細胞：從著床前的動物胚胎中分別多功能胚胎干細胞→基因操作→注射入動物囊胚→構成嵌合體胚胎→嵌合個體5．轉基因動物模型的建立建立鼠系轉基因動物中外源DNA的檢測染色體和基因程度：分別基因組DNA，進展斑點雜交，Southern雜交和PCR分析，原位雜交等以評價外源基因的整合情況。轉錄程度：Northern雜交，RT-PCR。蛋白質程度：Western印漬分析。動物轉基因技術面臨著一些問題消費效率低基因整合效率不高消費周期長，本錢高轉基因動物死亡率高常出現不育導致轉基因難以傳代無法大規模消費轉基因克隆動物一、轉基因克隆技術是轉基因技術和動物克隆技術的有機結合。它以轉基因細胞為核供體，采用體細胞核移植技術產生轉基因克隆動物，實現種質創新。

二、轉基因克隆動物技術顯示出現的優勢：1、消費效率高2、周期短，本錢低3、可以決議后代性別轉基因動物的運用研討不同發育階段基因組織和功能，細胞發育的潛能性，細胞核與細胞質的相互關系，胚胎發育調控，腫瘤，神經與發育等。動物新種類的培育構建醫用或食用蛋白的反響器用于疾病相關的研討及建立疾病的動物模型可作為器官移植的供體第二節轉基因植物概念:指用人工方法將外源基因導入或整合到基因組內，并能穩定傳代的一類植物。方法：獲取目的基因→受體細胞培育→將目的基因導入受體細胞〔載體直接轉化或先轉化農桿菌，后者再轉化受體細胞〕→培育轉化細胞→挑選陽性細胞→培植陽性植株→轉基因植株的鑒定另外，也有用病毒介導的基因轉移，電擊法，基因槍法，顯微注射，脂質體介導法，多聚物介導法，激光束穿孔法等轉基因植物實踐上，可以被看作生物制備器，主要用于：消費藥物蛋白制備口服疫苗獲得質量更好的中藥材獲得新的農作物種類：抗蟲棉花，抗旱小麥等轉基因植物的運用基因打靶

genetargeting一、概述：基因打靶是利用DNA同源重組原理，在基因組中的某一特定部位進展定點的基因重組，是研討基因的功能的有效手段。包括基因敲除〔geneknockout〕和基因敲入〔geneknockin〕。同源重組的分子過程1、兩段較長的同源DNA或同源染色體彼此靠攏，在二條一樣極性上斷裂2、產生交叉構造3、在交叉處橫斷內切，產生4種含有異源雙鏈的重組產物二、基因敲除的根本程序1、構建打靶載體1〕同源序列

2〕打靶載體常含兩種挑選標志neor：新霉素抗性基因，陽性挑選標志，neor基因插入用于打靶的外源DNA中，當重組后，細胞能在含新霉素的培育基中生長。neorHSV-tkHSV-tk：單純皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因，陰性挑選標志，該基因產物可分解單核苷酸類似物而生成毒性產物，產生自殺效果。HSV-tk基因插入外源基因外側的載體序列中。同源重組時，Tk-基因往往喪失；隨機整合時，Tk-基因連同打靶載體整合到核基因組上，而同時獲得neo和HSV-tk兩個基因的打靶細胞。啟動子HSV-TK同源序列同源序列Neo2、將載體導入ES細胞選取發育第4-5天的胚胎干細胞(ES)。把外來基因轉入胚胎肝細胞。并挑選打靶勝利的細胞。隨機整合同源重組3、將基因敲除ES細胞注射入胚泡，構成嵌合胚胎。4、將10-20個胚泡植入假孕小鼠子宮。5、獲得子代小鼠，挑選帶有靶基因的小鼠。常有的方法有：Southern印記、Northern印記把胚胎注入假孕小鼠Southern印記把細胞注入胚泡6、雜和小鼠〔+/-〕間雜交，獲得子二代小鼠〔+/+、-/-、+/-〕。7、挑選的-/-、+/-子二代小鼠。〔+/-〕〔+/-〕〔+/-〕〔-/-〕〔+/+〕〔+/-〕〔+/-〕〔+/-〕〔+/-〕〔+/+〕〔-/-〕三、基因打靶在醫學中的運用1、采用基因打靶技術可建立基因缺陷型的疾病模型，用于研討遺傳疾病發生的分子機制。2、基因打靶與腫瘤的研討研討基因改動與腫瘤發生及治療的關系3、基因打靶可用于構建高效的動物反響器或植物反響器，用于藥物消費。小結轉基因技術是在基因重組根底上建立新的多細胞真核生物的方法。這是一個具有艱苦意義的革命性的突破。它為我們培育新的物種提供了新的思緒，為我們研討基因的功能，研討疾病發生的機理提供了有力的手段。