川芎基于抗血小板聚集作用與藥效成分的質量評價中藥川芎來源于傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖,具有“活血行氣,祛風止痛”之功效。傳統鑒別經驗以“個大、飽滿、質堅實、斷面黃白色、油性大、香氣濃者”為佳。在2015年版《中國藥典》中,川芎以乙醇提取物(12%)和阿魏酸的含量(0.1%)為質量評價指標。顯然,這兩項指標難以有效地評價川芎的質量。現代研究表明,抗血小板聚集能夠反映川芎活血化瘀的功效。川芎的主要藥效成分(阿魏酸松柏酯、Z-藁本內酯、洋川芎內酯A等)大多數為油狀物,不穩定,難標化。為此,本論文建立以歐當歸內酯A為內參物的川芎一測多評法和抗血小板聚集作用的生物檢定法,對川芎的藥效成分和抗血小板聚集活性進行比較,以期為川芎的質量評價提供依據。研究內容包括以下三部分:第一、川芎抗血小板聚集作用的定量測定:(1)通過考察體外定量測定抗血小板聚集作用的各個影響因素,建立了定量測定川芎抗血小板聚集作用的方法,即家兔血液經800rpm二次離心(每次10min)得到富血小板血漿(PRP),經3500rpm離心得到貧血小板血漿(PPP);加入300μmol/LADP的誘導血小板聚集,供試品溶解加入15%助溶劑二甲基亞砜(DMSO),從取血到測定血小板聚集率的整個實驗操作在3h內完成。以阿魏酸鈉為陽性藥,在15~60mg/mL濃度范圍內與血小板抑制率呈良好的線性關系(r=0.9934,n=4)。川芎粉末用水提取4次,以水溶液為供試液,根據量反應平行線法(2.2)法,測定次數不少于4次,可靠性檢測(回歸項P值<0.01,偏離平行項P>0.05)滿足《藥典》的要求,重現性實驗RSD值為3.43%(n=6),精密度實驗的RSD值為6.98%(n=6),可信限率為23.90%(n=6),小于30%。說明該方法的測定結果準確,重復性良好。(2)從不同產地和藥材市場、飲片公司和藥店收集了13份川芎藥材樣品、2份川芎飲片(川芎飲片和酒炙飲片)、2份川芎相關的中成藥(速效救心丸和樂脈顆粒),測定其抗血小板聚集活性。結果表明,川芎藥材、飲片及其相關中成藥的抗血小板聚集活性分別為0.957U/g(n=13)、0.713(n=2)、0.646(n=2),說明建立的方法可以測定川芎藥材、飲片及其相關中成藥的抗血小板聚集活性。(3)根據川芎氣味,斷面顏色,將13份川芎藥材中的10份樣品分為一、二、三等:一等品香氣濃郁、斷面黃白色;二等品香氣濃郁、斷面黃色;三等品香氣較淡、斷面黃褐色。測定其抗血小板聚集活性,分別為1.306U/g(n=4,一等)、0.914U/g(n=3,二等)、0.722U/g(n=3,三等)。表明川芎抗血小板聚集活性的強弱與其氣味、斷面顏色的相關性強。第二、一測多評法測定川芎藥材中7種藥效成分的含量:(1)通過優化色譜條件,考察一測多評法的相關影響因素,建立了以歐當歸內酯A為內參物測定阿魏酸、洋川芎內酯I、H、A、魏酸松柏酯、Z-藁本內酯和歐當歸內酯A共7種藥效成分的方法。歐當歸內酯A與其他6種藥效成分的相對校正因子分別為1.14、1.46、1.44、0.54、0.30、0.81。通過在3臺色譜系統、2種色譜柱、3種流速和3種柱溫條件下測定的相對校正因子的RSD值均小于5%,表明方法的重現性良好。42份川芎樣品經外標法和內標法測定6種藥效成分(阿魏酸、洋川芎內酯I、H、A、阿魏酸松柏酯、Z-藁本內酯)含量的RSD值均小于5%,表明建立一測多評法可準確地測定川芎中這7種藥效成分的含量。(2)從不同產地和藥材市場收集了44份川芎藥材樣品,根據藥材的氣味和斷面顏色分為三個等級。測定其7種藥效成分含量,并計算主成分分析的綜合得分。結果表明,一、二等品之間沒有顯著性差異(P>0.05),一、二等品與三等品之間有極顯著性差異(P<0.01),且一等品(﹣15.192,n=7)、二等品(﹣17.290,n=25)>三等品(﹣7.062,n=10);系統聚類分析可以將三等品與一、二等品分開,但一、二等品之間無法分開。分別以酚酸類成分、苯酞類成分、酚酸類和苯酞類成分總和的含量為指標,一、二等品之間沒有顯著性差異(P>0.05),一、二等品與三等品之間有極顯著性差異(P<0.01),且一、二等品>三等品。以單一藥效成分的含量為指標,Z-藁本內酯的含量與不同等級川芎藥材呈正相關,一、二、三等品之間有極顯著性差異(P<0.01),即一等品(13.492mg/g,n=7)>二等品(9.899mg/g,n=25)>三等品(5.818mg/g,n=9)。(3)從不同產地收集了31份川芎藥材(四川都江堰7份,四川彭州13份、四川眉山11份),測定7個藥效成分的含量。根據主成分分析的綜合得分結果表明,四川彭州(6.11,n=13)>四川眉山(5.44,n=11)>四川都江堰(5.28,n=7);經方差分析結果表明,四川眉山與四川都江堰之間沒有差異(P>0.05),四川眉山、四川都江堰與彭州之間有差異(P<0.01),即四川彭州>四川都江堰和四川眉山。酚酸類成分、苯酞類成分、酚酸類和苯酞類成分總和的含量在3個產地之間沒有顯著性差異(P>0.05);以單一藥效成分含量為指標,Z-藁本內酯的含量在四川都江堰與四川彭州之間沒有顯著性差異(P>0.05),而在四川都江堰、四川彭州與四川眉山之間有極顯著性差異(P<0.01);洋川芎內酯A的含量在四川彭州與四川眉山之間沒有顯著性差異(P>0.05),在四川彭州、四川眉山與四川都江堰之間有極顯著性差異(P<0.01);其余的藥效成分的含量在這3個產地的樣品之間無顯著性差異(P>0.05)。說明不同產地川芎藥材Z-藁本內酯和洋川芎內酯A的含量不同。第三、川芎藥效成分與抗血小板聚集活性之間的相關性研究:(1)建立了川芎經不同濃度(100%、70%、50%、30%、0)乙醇提取的提取物的HPLC指紋圖譜,根據對照品的保留時間和紫外光譜,鑒定了9個色譜峰,分別為阿魏酸、洋川芎內酯I、H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A、E-藁本內酯、Z-藁本內酯、丁烯基苯酞,歐當歸內酯A。經灰色關聯度分析,這9種藥效成分與抗血小板聚集活性的關聯系數從大到小依次為0.6492(E-藁本內酯)、0.6316(洋川芎內酯H)、0.6198(阿魏酸)、0.6163(洋川芎內酯I)、0.6101(阿魏酸松柏酯)、0.6071(洋川芎內酯A)、0.5588(丁烯基苯酞)、0.5703(Z-藁本內酯)、0.5230(歐當歸內酯A)。說明這9種藥效成分與抗血小板聚集活性之間的相關性相近。苯酞類和酚酸類成分之和、酚酸類成分、苯酞類成分與抗血小板聚集活性之間的關聯系數分別為0.6105、0.6099和0.6098,說明這幾類成分與抗血小板聚集活性之間的相關性也相近。(2)測定了川芎藥材水提物中的藥效成分(阿魏酸、洋川芎內酯I、H、A)的含量,對不同等級川芎水提取物中的藥效成分含量與其抗血小板聚集作用的生物效價進行曲線估計,只有阿魏酸與川芎水提物的抗血小板聚集活性的曲線估計通過t檢驗,呈現S形變化