傳播優(yōu)秀Word版文檔，希望對您有幫助，可雙擊去除！傳播優(yōu)秀Word版文檔，希望對您有幫助，可雙擊去除！傳播優(yōu)秀Word版文檔，希望對您有幫助，可雙擊去除！IPTG全面介紹：優(yōu)點(diǎn)·使用·配制·特點(diǎn)摘要:

異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑,不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定,因此被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。IPTG常用于需要誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶活性的克隆實(shí)驗(yàn)。它常與X-Gal或Bluo-Gal結(jié)合使用，用于重組細(xì)菌菌落的藍(lán)白篩選，這些菌落可以誘導(dǎo)lac操縱子在大腸桿菌中的表達(dá)。IPTG與lacI阻遏蛋白結(jié)合并改變其構(gòu)象而發(fā)揮作用，防止β-半乳糖苷酶編碼基因lacZ的抑制。中文名：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)英文名稱：Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside用途：異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑,不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定,因此被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。IPTG常用于需要誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶活性的克隆實(shí)驗(yàn)。它常與X-Gal或Bluo-Gal結(jié)合使用，用于重組細(xì)菌菌落的藍(lán)白篩選，這些菌落可以誘導(dǎo)lac操縱子在大腸桿菌中的表達(dá)。IPTG與lacI阻遏蛋白結(jié)合并改變其構(gòu)象而發(fā)揮作用，防止β-半乳糖苷酶編碼基因lacZ的抑制。使用方法：首先把IPTG配制成23.83mg/ml(100mM)的水溶液，并進(jìn)行過濾除菌后保存。然后在100ml的瓊脂培養(yǎng)基中，加入100μl的上述溶液、200μl的X-Gal(20mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和100μl的Amp(100mg/ml)，制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培養(yǎng)基。當(dāng)dna片段插入至pUC系列載體(或其他帶有l(wèi)acZ、Amp基因載體)，然后轉(zhuǎn)化至lacZ缺失細(xì)胞中后，涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培養(yǎng)基，可根據(jù)長出菌體的藍(lán)白色，而方便地挑選出基因重組體(白色為具有DNA插入片段的基因重組體)。配制方法：在8ml蒸餾水中溶解2gIPTG后，用蒸餾水定容至10ml，用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成1ml小份貯存于-20℃。優(yōu)點(diǎn)：1.能誘導(dǎo)酶的合成，但又不被分解的分子，稱為安慰誘導(dǎo)物。由于乳糖雖可誘導(dǎo)酶的合成，但又隨之分解，產(chǎn)生很多復(fù)雜的動力學(xué)問題，因此人們常用安慰誘導(dǎo)物來進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)。2.IPTG不被菌體代謝，為乳糖類似物，一旦進(jìn)入細(xì)胞就會產(chǎn)生持續(xù)長久的誘導(dǎo)效果，所以IPTG的誘導(dǎo)效率高，往往只需要很少量(1mmol/L)即可達(dá)到理想誘導(dǎo)效果。由于IPTG不被代謝，在胞內(nèi)專一誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)。不受細(xì)胞代謝的影響，誘導(dǎo)效果持續(xù)穩(wěn)定。乳糖有雙效作用，既能做為誘導(dǎo)劑異乳糖的前體物質(zhì)，又可以做碳源，在誘導(dǎo)過程中，很不穩(wěn)定，IPTG因其優(yōu)異的穩(wěn)定性決定了它適合做實(shí)驗(yàn)研究用。3.IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被抄送。4.半乳糖苷鍵中用硫代替了氧，失去了水解活性，但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物與酶位點(diǎn)的親和力相同，IPTG雖不為β–半乳糖苷酶所識別，但它是lac基因簇十分有效的誘導(dǎo)物。注意事項(xiàng)：培養(yǎng)噬菌體時(shí)，Topagar中的添加量為：25μl/3ml(24mg/ml)。含有IPTG的培養(yǎng)基4℃避光保存，須在1~2周內(nèi)使用。保存：2-8°C冷藏保存，配制好后保存于-20°C，室溫可放置一個(gè)月。遠(yuǎn)離熱源及氧化劑。IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的原理.材料.實(shí)驗(yàn)方法摘要:

E.coli的乳糖操縱子(元)含Z、Y及A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因,分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙酰基轉(zhuǎn)移酶,此外還有一個(gè)操縱序列O、一個(gè)啟動子序列P及一個(gè)調(diào)節(jié)基因I.I基因編碼一種阻遏蛋白,后者與O序列結(jié)合,使操縱子(元)受阻遏而處于關(guān)閉狀態(tài).在啟動序列P上游還有一個(gè)分解(代謝)物基因激活蛋白(CAP)結(jié)合位點(diǎn).由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點(diǎn)共同構(gòu)成lac操縱子的調(diào)控區(qū),三個(gè)酶的編碼基因即由同一調(diào)控E.coli的乳糖操縱子(元)含Z、Y及A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因,分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙酰基轉(zhuǎn)移酶,此外還有一個(gè)操縱序列O、一個(gè)啟動子序列P及一個(gè)調(diào)節(jié)基因I.I基因編碼一種阻遏蛋白,后者與O序列結(jié)合,使操縱子(元)受阻遏而處于關(guān)閉狀態(tài).在啟動序列P上游還有一個(gè)分解(代謝)物基因激活蛋白(CAP)結(jié)合位點(diǎn).由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點(diǎn)共同構(gòu)成lac操縱子的調(diào)控區(qū),三個(gè)酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié),實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達(dá).在沒有乳糖存在時(shí),lac操縱子(元)處于阻遏狀態(tài).此時(shí),I序列在PI啟動序列操縱下表達(dá)的Lac阻遏蛋白與O序列結(jié)合,阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié)合,抑制轉(zhuǎn)錄起動.當(dāng)有乳糖存在時(shí),lac操縱子(元)即可被誘導(dǎo).在這個(gè)操縱子(元)體系中,真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身.乳糖進(jìn)入細(xì)胞,經(jīng)b-半乳糖苷酶催化,轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘?后者作為一種誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白,使蛋白構(gòu)象變化,導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄.異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑,不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定,因此被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用.傳播優(yōu)秀Word版文檔，希望對您有幫助，可雙擊去除！傳播優(yōu)秀Word版文檔，希望對您有幫助，可雙擊去除！傳播優(yōu)秀Word版文檔，希望對您有幫助，可雙擊去除！材料：1、誘導(dǎo)表達(dá)材料：(1)LB(Luria—Bertani))培養(yǎng)基：酵母膏(Yeastextract)5g蛋白胨(Peptone)10gNaCl10g

瓊脂

(Agar)1-2%蒸餾水(Distilledwater)1000mlpH7.0適用范圍：大腸桿菌(2)IPTG貯備液：2gIPTG溶于10mL蒸餾水中,0.22μm濾膜過濾除菌,分裝成1mL/份,-20℃保存.(3)l×

凝膠電泳加樣緩沖液：50mmol/LTris-CI(pH6.8)50mmol/LDTT2%SDS(電泳級)0.1%溴酚藍(lán)10%甘油2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料：1)酶溶法(1)裂解緩沖液：50mmol/LTris-CI(pH8.0)1mmol/LEDTA100mmol/LNaCI傳播優(yōu)秀Word版文檔，希望對您有幫助，可雙擊去除！傳播優(yōu)秀Word版文檔，希望對您有幫助，可雙擊去除！傳播優(yōu)秀Word版文檔，希望對您有幫助，可雙擊去除！(2)50mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF).(3)10mg/mL溶菌酶.(4)脫氧膽酸.(5)1mg/mLDNaseI.2)超聲破碎法(1)TE緩沖液.(2)2×SDS凝膠電泳加樣緩沖液：100mmol/LTris-HCI(pH8.0)100mmol/LDTT4%SDS0.2%溴酚藍(lán)20%甘油實(shí)驗(yàn)方案：1、外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)：(1)用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化載體DNA和目的基因.(2)按連接步驟連接目的基因和載體,并轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的宿主菌.(3)篩選出含重組子的轉(zhuǎn)化菌落,提取質(zhì)粒DNA作限制性內(nèi)切核酸酶圖譜,DNA序列測定,確定無誤后進(jìn)行下一步.(4)如果表達(dá)載體的原核啟動子為PL啟動子,則在30-32℃培養(yǎng)數(shù)小時(shí),使培養(yǎng)液的OD600達(dá)0.4-0.6,迅速使溫度升至42℃繼續(xù)培養(yǎng)3-5h;如果表達(dá)載體的原核啟動子為tac等,則37℃培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)小時(shí)達(dá)到對數(shù)生長期后加IPTG至終濃度為1mmol/L.繼續(xù)培養(yǎng)3-5h.(5)取上述培養(yǎng)液1mL,1000g離心,1min,沉淀,加100μL聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后,作SDS檢測.2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質(zhì)純化：細(xì)菌的裂解傳播優(yōu)秀Word版文檔，希望對您有幫助，可雙擊去除！傳播優(yōu)秀Word版文檔，希望對您有幫助，可雙擊去除！傳播優(yōu)秀Word版文檔，希望對您有幫助，可雙擊去除！常用方法有：①高溫珠磨法;②高壓勻漿;③超聲破碎法;④酶溶法;⑤化學(xué)滲透等.前三種方法屬機(jī)械破碎法,并且方法①、②已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用,后三種方法在實(shí)驗(yàn)室研究中應(yīng)用較為廣泛.下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實(shí)驗(yàn)步驟.酶溶法.常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3-葡聚糖酶;β-1,6-葡聚糖酶;蛋白酶;殼多糖酶;糖昔酶等.溶菌酶主要對細(xì)菌類有作用,而其他幾種酶對酵母作用顯著.主要步驟為：4℃,5000rpm離心,15min,收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)液(100mL).棄上清,約每克濕菌加3mL裂解緩沖液,懸浮沉淀.試驗(yàn)進(jìn)行到了IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后跑SDS膠的環(huán)節(jié)，

首先，我獲得了我的目的基因，與pET28a連接后，成功構(gòu)建載體。我進(jìn)行了菌液PCR驗(yàn)證，質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證，之后是送去測序。所有的結(jié)果足夠表明我已經(jīng)構(gòu)建載體成功了。

之后就是轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌株中。轉(zhuǎn)到BL21表達(dá)菌株時(shí)間大概是15年1月份左右，直到過年后回來開始搖菌，誘導(dǎo)，跑膠，問題就是這時(shí)候出現(xiàn)的。

以下是我做試驗(yàn)的整個(gè)流程，望大神給些建議。

1、誘導(dǎo)與提取目的蛋白

①菌種活化。重組載體pET-28a-SAMDC和空質(zhì)粒pET-28a的單菌落，分別接種于25mLLB液體培養(yǎng)基（KanR）的試管中，37℃，180r/min，過夜振蕩培養(yǎng)。

②菌種擴(kuò)培。取活化好的菌種按1%的量接種于100mL的LB液體培養(yǎng)基（KanR），搖勻，37℃，200r/min，振蕩培養(yǎng)3h。

③融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。向菌液中分別加入終濃度的IPTG（0.1、0.5、1.0mmol/L）作誘導(dǎo)劑，37℃，180r/min，振蕩培養(yǎng)4h（3、4、5、6h）。

④目的蛋白的提取。

A.經(jīng)誘導(dǎo)后取1mL菌液，4℃12000g，10min收集菌體;吸出菌液，用0.5mL預(yù)冷的50mmol/LTris-Cl（pH7.4）漩渦振蕩使沉淀的菌體復(fù)懸，4℃12000g，離心10min；再次吸出上清液，小心地吸凈管壁上的液滴，盡可能地使沉淀不帶有殘留的液體；加入100uLddH2O，漩渦振蕩使沉淀復(fù)懸，一旦菌體分散開來立即加入等體積的1%×SDS磷酸緩沖液，繼續(xù)振蕩20s；超聲波處理。超聲處理為7min，超3s，停10s，功率為75w。超聲波處理后，樣品4℃12000g，10min，將上清移至另一管中，沉淀用少量1%SDS溶解，分別加入等體積的2×SDS凝膠上樣緩沖液；快速離心，將菌懸液收集在離心管底部，沸水浴中放置5min；分別取15uL樣品進(jìn)行SDS電泳檢測。

圖片即為SDS膠跑完后的狀態(tài)。我的蛋白預(yù)測應(yīng)該是在40kDa左右，可是在40kDa左右處根本沒有我的目的蛋白。反而在30kDa處出現(xiàn)奇怪的條帶...

做了幾次都是這樣的狀態(tài)。同實(shí)驗(yàn)室的也有人在做這一步，她的蛋白預(yù)測大小為38kDa，但是跑出來的膠跟我的一模一樣。

還有一個(gè)同學(xué)她是前兩次做成功了可以明顯看到目的蛋白表達(dá)，在60kDa左右，但是從大概4月份開始條帶就沒有了，我們一直找不到原因，難道這個(gè)也是可以傳染的？

去問實(shí)驗(yàn)室的小老師，老師說可能是我們IPTG誘導(dǎo)的時(shí)間有問題，但是按照他說的方法重新試了也不行。難道是因?yàn)轳Z化時(shí)間太久所以BL21這個(gè)菌太淘氣了所以把我們的載體吐出去了？但是這種