我國新城疫病毒ndv的分子遺傳研究

新城病（nd）是一種由同一只鳥類引起的急性和烈性感染疾病，主要屬于雞和雞。發病率和死亡率很高。這是中國養雞業最嚴重的疾病之一。國際獸醫衛生組織(OIE)將其定為A類動物疫病,中國將其定為一類動物傳染病。NDV雖然只有一個血清型,但毒株眾多,毒力差別較大,給ND的防制帶來極大困難。NDV是一種具有囊膜的單股、負鏈、不分節段的RNA病毒,由15186個核苷酸組成。基因組包含6個基因,分別編碼3′NP_P_M_F_HN_L5′六個主要多肽(即NP核蛋白、P磷蛋白、M基質蛋白、F融合蛋白、HN血凝素-神經氨酸酶和L聚合酶)。NDV的囊膜由F和HN兩個糖蛋白組成,F糖蛋白能夠融合宿主細胞膜,使病毒侵入宿主細胞內;HN糖蛋白具有血凝素和神經氨酸酶活性,在病毒侵染過程中識別細胞受體、介導病毒吸附細胞膜。這兩種基因產物決定著NDV的毒力強弱。因此,對F和HN進行分子遺傳變異研究,對了解和把握NDV的變異規律具有重要意義。然而,國內外尚未有F和HN基因遺傳變異相關性的研究報告。本文對近年來在國內分離、鑒定的NDV,分別進行了F和HN基因克隆測序,并對二者的遺傳變異做了相關比較。1材料和方法1.1材料表面1.1.1h9和h771999～2005年間山東、江蘇等NDV分離株,采用HA和HI交叉抑制試驗,排除H9和H5亞型禽流感、減蛋綜合癥(EDS_76)等具有HA特性的病毒。利用CEF對分離株進行蝕斑純化3代后接種10日齡SPF雞胚,進行病毒增殖,利用差速離心法進行濃縮病毒。1.1.2試劑和增強劑TRIzol為GibcoBRL產品;AMV逆轉錄酶、Rnasin、pGEM_TEasyVector購自Promega公司;DNA回收試劑盒、dNTPs購自TaKaRa(大連)公司。PCRMasterMix增強劑購自北京朋遠公司。DH5α由山東農科院家禽所禽病重點實驗室保存;SPF種蛋由山東家禽所SPF雞場提供。1.1.3hn基因pcr擴增參照GenBank中NDV的F和HN序列,利用Primer設計兩對引物,T1和T2用于擴增F基因(1700bp),HN1和HN2用于擴增HN基因(1801bp)。引物由上海Sangon合成,序列為:T1:5′_ATGGGCTCCAAACCTTCTAC_3′,T2:5′_TTGTAGTGGCTCTCATC_3′;HN1:5′_TCCGTTCTACCACATCACCA_3′,HN2:5′_CGTCTTCCCAACCATCCTAT_3′。考慮到NDV不同編碼基因均有共同的起始序列,設計通用RT引物:5′_ACGGGTAGAA_3′。1.2加入rol/lrt的/amv體系按照TRIzol試劑盒說明提取病毒RNA,加入經DEPC處理的滅菌超純水12μL溶解RNA。取7μLRNA,加入10mmol/LRT引物4.5μL,經70℃變性5min后,冰浴5min,依次加入下列體系:5×RTbuffer4μL;10mmol/LdNTP2μL;40U/μLRNasin0.5μL;10U/μL的AMV2μL,反應總體積20μL,混勻,37℃水浴1h。然后,95℃5min,冰浴5min,-20℃保存。合成的cDNA可作為PCR擴增F和HN的模板。1.3循環時間的選擇F(HN)反應條件:94℃3min;94℃1min,54℃1min,72℃2.5min(HN為2min),33(HN為32)個循環;72℃延伸10min。反應產物1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗。1.4yvector的培養回收PCR產物,將回收物連接16℃1.5h至pGEM_TEasyVector,轉化至感受態DH5α,均勻涂布于含Ampicillin、IPTG、X_Gal的LB固體培養基平板,37℃培養14～16h。挑取白色菌落小量培養,作EcoRⅠ酶切鑒定和PCR擴增雙重鑒定。1.5ndv毒株的構建將陽性質粒送上海博采生物技術有限公司測序。另從GenBank中獲取同時發表F和HN序列且代表不同基因型的11個NDV毒株(表1),用于這兩個基因的比較。利用DNAStar6.0軟件,按傳統基因分型方法對F基因分型。1.6不同中毒豬f和hn基因遺傳變化之間的相關比較1.6.1氨基酸aa同源性分析利用DNAStar6.0軟件分別對NDV不同F和HN基因片段進行核苷酸(nt)和氨基酸(aa)同源性比較,利用SPSS8.0統計學軟件對其同源性進行相關分析。以不同NDV毒株F全長基因的nt同源性為縱坐標,以不同毒株F基因高變區(1～374nt)的nt同源性為橫坐標作圖。按同樣方法構建HN基因及其高變區(1～270nt)相關圖。1.6.2基因同源分析利用DNAStar6.0軟件分別對NDV的HN與F基因之間進行核甘酸同源比較,利用統計學軟件SPSS8.0進行相關分析。以不同毒株間F基因的全長核甘酸同源性為橫坐標,以HN基因的全長核甘酸同源性為縱坐標作圖。2結果2.1內毒株的基因型和基因分型14個NDV野毒株的F和HN基因均擴增出了目的片段。經雙向測序后,F基因開放閱讀框(OpenReadingFrame,ORF)全長1662bp,編碼553個氨基酸;HN基因ORF全長1716bp,編碼571個氨基酸。序列已被GenBank收錄(表1)。14株NDV野毒株基因分型結果:8株為基因Ⅶ(57.1%);4株為基因Ⅱ(28.6%);2株為基因Ⅸ(14.3%)。基因Ⅶ仍是目前NDV流行的優勢毒株。2.2同源性分析結果表2為國、內外不同基因型的25個NDV毒株F基因全長和不同片段的核甘酸(nt)和氨基酸(aa)的相關比較結果。結果表明,不同毒株的1～374nt(125aa)、375～960nt(126～320aa)、961～1662nt(321～554aa)和全長的nt(aa)之間,核甘酸:r≥0.973;氨基酸:0.911≤r≤0.952,遺傳變異高度相關。上述表明:不同NDV毒株在F基因上全長和片段的遺傳變異都是密切相關的。其中,前374nt(125aa)最具代表性。F基因全長及其前374bp的核甘酸同源性比較見表3。圖1更具體顯示了NDV不同毒株間F全長基因與其前374bp遺傳變異的一一對應的相關性。對近300個點的分析表明:當兩個毒株間F基因全長nt同源性高時,其前374bp片段的同源性亦高,反之,亦然。推導公式為:Y=18.5+0.816X(Y表示F基因全長之間的nt同源性,X表示F前374bp之間的nt同源性)。2.3hn基因的基因型分布25個NDV毒株HN基因全長和不同片段的核甘酸和氨基酸的相關比較結果見表4。結果表明,1～270nt(90aa)、300～960nt(100～320aa)、961～1716nt(321～572aa)和基因全長的核甘酸和氨基酸之間,核甘酸:r≥0.983;氨基酸:0.924≤r≤0.968遺傳變異高度相關。上述表明:不同毒株在HN基因全長和片段的遺傳變異都是密切相關的。其中,前270nt(90aa)最具代表性。HN基因及其前270bp的核甘酸同源性的比較見表5。圖2更具體顯示了不同NDV毒株間,HN基因全長與其前270bp片段遺傳變異的一一對應的相關性。對近300個點的分析表明:當兩個NDV毒株間HN基因全長nt同源性高時,其前270bp片段的同源性亦高;反之,亦然。推導公式為:Y=36.2144+0.6357X(Y表示HN全長之間的nt同源性,X表示HN前270nt之間的nt同源性)。2.4dnav毒株間f和hn基因同源性分析25株NDVF與HN基因全長的核甘酸同源性具有顯著的相關性(р<0.01),r=0.312**。圖3具體顯示了NDV不同毒株間F和HN基因遺傳變異的一一對應的相關性。對近300個點的分析表明:當兩個毒株間F基因全長同源性高時,其HN基因同源性大多數較高,但個別偏低。這表明:F與HN基因全長的遺傳變異,呈現弱相關,既具有聯系性,又具有相對的獨立性。3討論3.1f、hn基因不同片段的遺傳變異國外學者對NDV研究發現:利用F、HN等基因中的不同片段所繪制的系統發育樹十分相似,甚至利用較短的核甘酸序列所繪制的進化樹與其全長基因所構建的進化樹是一致的;國內秦智鋒、曹殿軍等也有類似的推論,但均缺乏有力的證據。本實驗通過對代表不同基因型的25株NDV毒株的F和HN基因不同片段的核甘酸和氨基酸同源率進行比較,并通過統計學分析證實:不管是F還是HN基因,其不同片段的核甘酸和氨基酸與其全長之間息息相關,反應出NDV遺傳變異的規律。F和HN基因內部不同片段之間遺傳變異高度相關,反應出F或HN基因在自然界中的突變可能是隨機的、均勻分布的。可以利用其中一個片段來推測F或HN基因全長的遺傳變化。但應注意到:不同株NDVF或HN基因的不同片段,其核苷酸和氨基酸之間尚有一定差別,不同片段繪出的系統進化樹有差異。因此,在進行遺傳變異比較時,最好選擇核甘酸和氨基酸(特別是后者)與全長均密切相關的片段,例如:F基因的1～374nt或HN基因的1～270nt。因為氨基酸與抗原性的關系更密切,更準確。3.2f與hn基因同源率低,其遺傳變異國內外對NDVF或HN遺傳變異的研究大都局限在對其自身的研究,其中對F基因的研究占了多數,對HN研究較少。本文把F和HN基因的遺傳變異統籌考慮,通過對不同毒株NDV的F和HN基因全長之間進行核甘酸同源相關比較,證實F和HN基因之間的遺傳變異既具有聯系性,又具有獨立性。聯系性:國內10個NDV野毒株基因Ⅶ(本實驗8株和2個國內株)之間,F基因核甘酸同源率為93.6%～99.1%,HN基因核甘酸同源率94.8%～100%,與疫苗株如LaSota(基因Ⅱ)的F和HN基因同源率均較低(80%左右)。表明目前流行的NDV基因Ⅶ野毒株與傳統毒株相比,其F與HN基因均發生了較大的遺傳變異,但野毒株之間具有較高的一致性。獨立性:4個NDV基因Ⅱ野毒株與傳統疫苗株LaSota(基因Ⅱ)相比,F基因同源率較高(98.9%～99.5%),HN基因同源率較低(79.2%～82.3%)。進而證實:基因型相同(F核甘酸同源率高),HN核甘酸同源率可能高(野毒株基因Ⅶ),也可能低(基因Ⅱ野毒株),具有不確定性;反之,亦然。例:國內NDV所有分離株HN之間高度同源(同源率94.8%～100%),但F基因同源率:同一基因型之間較高,不同基因型,則較低。因此,F基因分型的結果與HN同源率高低無關,反應出F與HN基因在遺傳變異過程中各自的獨立性。研究還發現:國內外不同國家和地區的情況也有差異:同一個地區,基因型相同,同源較高,否則,同源相對較低。如我國與歐洲NDV野毒株基因Ⅶ之間,F基因同源率不到90%,顯示出地域差異。此外,國內NDV野毒株之間,不論是家禽,還是水禽,HN基因高度同源。何種原因導致此種現象值得進一步研究。3.3hn基因高度同源近年來,高抗