白地霉fl44菌株發酵條件的優化

豆腐生產應消耗大量的水和排放大量的廢水（主要是黃漿水）。黃漿水中有機物質很豐富,直接排放使水質COD、BOD值明顯增加,對環境造成嚴重污染,還浪費了大量有用的物質,非常可惜。酸漿是傳統工藝豆腐制作過程中所用的一種蛋白凝固劑,是黃漿水經多種微生物混合發酵的產物,具有特殊的酵香,同時還含有特殊的一些生物活性物質。從酸漿中分離篩選出一株高產蛋白的白地霉FL44,是適合利用豆腐黃漿水生產單細胞蛋白的優良菌株。如能利用黃漿水通過生物合成蛋白質,有化害為利,變廢為寶的重大意義。為此我們以豆腐生產廢液(黃漿水)為原料,進行了優良菌株的選育及工藝條件的探索。1材料和方法1.1材料表面主要原料:黃漿水(購于市場普通豆腐坊);廢糖蜜(購于山東高密糖廠);菌種:白地霉FL44菌株,從酸漿中分離篩選出,實驗室保存。1.2搖瓶種子培養基斜面活化培養基:葡萄糖2%,用黃漿水配制。搖瓶種子培養基:葡萄糖2%,用黃漿水配制。搖瓶發酵培養基:根據有關文獻和現有條件,在黃漿水中添加一定的營養物質。1.3設備和設備HZQ-Q振蕩器,TDL-5低速臺式大容量離心機,臺面式818型pH測試議,722分光光度計,電熱恒溫干燥箱。1.4方法1.4.1角瓶培養模式將菌種移接到斜面活化培養基上,30℃下活化24h后接1環于搖瓶種子培養基中,在30℃下振蕩培養約20h,然后按5%接種量接入裝有50mL發酵培養基的250mL三角瓶中,在30℃下振蕩培養48h(搖床轉速為180rpm)。1.4.2濕菌體的制備發酵液轉入離心管中,以3500rpm離心15min,自來水水洗兩次,去上清液得濕菌體;將濕菌體于50℃烘干24h,達恒重,電子天平稱重。1.4.3測定蛋白質含量的方法1.4.4測量血糖和ph值的目的2結果與討論2.1廢糖蜜對蛋白和生物量的影響由于黃漿水培養基中營養物質不能滿足菌體的大量生長,所以選擇添加一些比較經濟的營養物質,以利于菌體的生長。選擇黃漿水培養基外加碳源時,考慮添加0%~8%廢糖蜜,結果見表1。從表1可知添加廢糖蜜對白地霉FL44生物量和蛋白產量都有明顯的影響。隨著廢糖蜜添加量的增加,生物量和蛋白產量逐漸增加;但當廢糖蜜添加量大于6%時,生物量和蛋白產量的增加很小,綜合產量并結合成本等因素,初步選擇在黃漿水培養基添加6%廢糖蜜。2.2磷酸鹽對黃漿水培養基中fl49生物量和蛋白產量的影響在黃漿水培養基中添加硫酸銨、磷酸氫二銨、碳酸銨和尿素4種不同濃度的不同氮源,實驗結果見表2。由表2可知添加氮源可以明顯提高生物量和蛋白產量,而磷酸氫二銨對白地霉FL44生物量和蛋白產量提高最大,且在添加1%磷酸氫二銨時生物量和蛋白產量均已達到最高,因此選擇在黃漿水培養基中添加1%的磷酸氫二銨。磷酸鹽濃度對單細胞蛋白生產的影響極為顯著,磷酸鹽不足時,糖代謝受抑制,生長緩慢。添加磷源可以明顯提高產量。2.3發酵溫度對白地霉fl49生物量和蛋白產量的影響發酵溫度和培養基初始pH值對發酵結果的影響分別見表3和表4。從表3可見,發酵最適溫度以30℃為宜,此時白地霉FL44生物量和蛋白產量均最高。表4顯示,適宜的培養基初始pH值為5~6,可以作進一步實驗確定。2.4物量和蛋白產量的影響選擇接種量5%、10%和15%,考查白地霉FL44發酵時間、生物量和蛋白產量的影響,結果見圖1和圖2。從圖1和圖2中可以看出,5%~15%接種量對白地霉FL44的生長時間、生物量和蛋白產量沒有很大影響,因此可以考慮經濟因素,以小于5%接種量作進一步實驗。2.5搖瓶轉速對菌體產蛋白的影響因為白地霉是好氧發酵的菌株,所以發酵液中溶解氧對白地霉生物量和蛋白產量都有較大的影響。通過改變250mL三角瓶裝液量和搖瓶轉速來考察溶解氧對菌體產蛋白的影響。選擇250mL三角瓶裝液量為30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL和搖瓶轉速為0rpm、140rpm、180rpm、220rpm、260rpm,進行實驗,結果見圖3和圖4。從圖3可見,40mL/250mL三角瓶為最佳搖瓶裝液量,圖4顯示,可以選擇最佳搖瓶轉速為220rpm。2.6正交實驗結果根據以上單因素試驗,選擇對白地霉FL44產蛋白影響較大的不同水平的廢糖蜜、磷酸氫二銨、pH值、接種量,設計正交實驗L9(34),通過正交實驗,確定白地霉FL44生物量和蛋白產量的最優條件。實驗選取的因素及水平見表5,實驗結果見表6。通過正交試驗的優化組合,得到白地霉FL44最優培養條件是:5%廢糖蜜、1%磷酸氫二銨、初始pH值5.5、4%接種量,與單因素試驗比較,降低了廢糖蜜的用量,但達到了同樣的蛋白產量。2.7白地霉fl49生物量及菌體蛋白含量測定采用正交實驗優化組合的培養基進行搖瓶發酵,定時取樣測定生物量、蛋白產量、含糖量、pH值等,以了解碳源、菌體生長及生理代謝的變化情況。實驗結果見圖5。從圖5中可以看出,白地霉FL44生物量在培養8h左右進入對數生長期,30h左右進入穩定期,48h生物量達到最高,之后生物量開始緩慢下降。菌體蛋白含量則在32h~40h達到最高水平,之后,蛋白含量開始下降,到64h后,菌體蛋白含量穩定。生物量的多少直接影響到蛋白的總收率(=菌體生物量×菌體蛋白含量),綜合生物量和蛋白含量考慮,蛋白產量在48h達到最高,之后,開始下降,至60h穩定,因此,確定最適培養時間為48h。3蛋白和總糖含量測定通過實驗研究初步確定白地霉FL44利用黃漿水產蛋白的搖瓶培養基組成和培養條件為:5%廢糖蜜、1%磷酸氫二銨、初始pH值5.5、4%接種量,裝瓶量40mL/250mL三角燒瓶、搖瓶轉速220rpm、30