扁穗牛鞭草花粉管萌發的觀察

水稻科植物是水稻科植物的一種多年生根草本植物。它在中國西南的無性繁殖和灌溉。根據對四川農業大學1986年育成的‘廣益’(H.compressacv.Guangyi)和‘重高’(H.compressacv.Chonggao)扁穗牛鞭草品種多年觀測,發現這2個品種在野生狀態和人工栽培條件下結實率很低,“花而不實”一直是困惑扁穗牛鞭草研究者的難題。生產上廣泛使用的扁穗牛鞭草品種均由無性系選擇產生,也多采用無性繁殖的方式進行擴繁,由此限制了扁穗牛鞭草的進一步推廣。目前南方地區的人工草地建植及生態恢復重建都選擇該草種作為主打草種,但無性繁殖耗費大量人力、物力和財力,給實際生產應用帶來了困難,生產上迫切需要扁穗牛鞭草種子,同時提高結實率也是品種改良的關鍵。目前對該資源的研究主要集中在生態學、細胞學、分子生物學等方面,對其孢粉學的專項研究成果尚未見報道。為此,本試驗欲從花粉形態、花粉活力、花粉萌發等方面進行研究,探索‘廣益’扁穗牛鞭草結實率低的原因,旨在為扁穗牛鞭草育種研究提供理論依據。1材料和方法1.1試驗單元和樣品1.1.1土壤條件、濕度試驗地位于四川農業大學草業科學系基地(北緯38°8′,東經103°14′,海拔600m),屬北亞熱帶濕潤季風氣候區。年均氣溫16.2℃,最熱月(7月)均溫25.3℃,最冷月(1月)均溫6.1℃,極端最高氣溫37.7℃,年降水量1774.3mm,年蒸發量1011.2mm,相對濕度79%,年日照時數1039.6h,年無霜期304d,≥10℃年積溫5231℃。試驗地土壤系白堊紀灌口組紫色沙頁巖風化的堆積物形成的紫色土,土壤有機質含量14.62g/kg,全氮含量1.91g/kg,全磷含量0.06g/kg,全鉀含量11.58g/kg,速效氮含量100.63mg/kg,速效磷含量4.73mg/kg,速效鉀含量338.24mg/kg,pH值6.2。試驗期間,試驗區最高氣溫(8月中旬)29.04℃;最大濕度和平均濕度(9月下旬)分別為98.33%和76.92%;最大降水量36.16mm。1.1.2試驗材料于2006年采自四川農業大學草業科學系種植3年的‘廣益’扁穗牛鞭草草地,在其開花期間取小穗進行相關觀測。1.2測試方法1.2.1花粉的x射線檢測在7-11月整個開花期間,采含苞待放的花直接投入戊二醇溶液進行固定。集花粉標本,對其進行干燥前處理。將處理后的花粉樣品均勻地撒在載物臺上的雙面膠紙上,然后經鍍膜機鍍膜。把樣品置入KYKY1000B-掃描電子顯微鏡,選擇不同放大倍數,不同觀察角度,對花粉群體、極面、赤道面、溝間區和萌發孔進行觀察和攝影,并對其形態特征要點、各種技術參數進行必要的記載。利用顯微攝影后獲得的掃描照片,對每種花粉進行體積大小的測量,對表面紋飾、萌發孔結構等形態特征分別進行描述。有關花粉粒表面性狀的所有數據均來源于20?；ǚ鄣钠骄?。1.2.2花粉粒的測定采用碘染色法測定不同花序同一部位上即將開放的小花花粉活力。隨機取10個花藥于載玻片上,加1滴蒸餾水,用鑷子充分搗碎后滴加1或2滴I2-KI溶液染色,用德國生產的LeicaDM5000B顯微鏡觀察花粉粒著色情況,花粉粒完全被染成深藍色作為有活力花粉粒。每個花位的小花制片10張,每張片觀察3~5個視野。統計1個視野中花粉粒的總數和已染色的花粉粒數,計算每個花位觀察視野所得到的總數,按下式計算各花位小花的花粉生活力:花粉生活力(%)=被染色花粉粒數/花粉?？倲怠?00%。1.2.3樣品處理和掃描電鏡2006年夏季,在17∶00點左右采集尚未開放的小花,進行人工自花授粉后,1,2,3,4和5h各取樣1次,然后將完整的柱頭、花柱和子房一起剝離,材料置于卡諾固定液(酒精∶冰乙酸=3∶1),固定24h,70%酒精保存備用。蒸餾水沖洗數次。轉入8mol/LNaOH溶液,在25℃過夜使組織軟化,徹底沖洗去堿后,在0.1%苯胺藍(0.1mol/LK3PO4,pH值12.4)中染色35min,緩沖液洗3或4次,共30min,1%鋨酸再固定2h后用H3PO4緩沖液沖洗,30%,50%,70%,80%,90%和100%乙醇逐級脫水,每級15min,脫水后的樣品放入醋酸異戊酯中置換過夜,在HCP-2型臨界干燥器內進行干燥,用離子噴射儀真空噴金,在KYKY1000B-掃描電子顯微鏡下觀察并照相。每處理觀察計數10枚雌蕊。1.2.4自然傳粉實當田間種植的‘廣益’扁穗牛鞭草果穗成熟后,采回室內,統計開花總數和結實數(剝離檢查),計算其自然傳粉結實率:結實率(%)=結實數/開花數×100%。2結果2.1群體形態觀察在光學顯微鏡下觀察扁穗牛鞭草的花粉粒,粒大飽滿的圓形花粉粒能夠被I2-KI溶液染成黑色或深藍色,表明其生活力較強。未著色的花粉粒呈金黃色,通常是小圓粒和癟粒,癟粒有多種形狀,如橢圓形、三角形、不規則的多邊形等。在掃描電子顯微鏡低放大倍數(400倍)下觀察花粉粒群體形態,花粉粒為單粒,形態各有差異,有干癟的畸形花粉粒存在(圖1a)。正常的花粉粒通常呈球形或橢球形,具有較光滑的外壁紋飾,稍有起伏,個體大小近似。花粉粒近球形或扁球形,極面觀(P)變幅25.9~38.2μm,赤道面(E)變幅24.12~34.71μm,平均大小(P×E)32.2μm×29.24μm。單孔(遠極孔),孔明顯,圓形或橢圓形,極面觀變幅3.3~4.7μm,赤道面變幅2.3~3.8μm,萌發孔大小3.8μm×2.9μm,具孔環、孔帽,孔環內緣比較整齊,孔蓋較小,形狀不規則,孔蓋表面為較大的顆粒狀紋飾,孔環微外突。花粉粒表面為顆粒狀紋飾,顆粒大小不等,粗糙,分布較均勻(圖1b,c)。除部分干癟畸形花粉粒外,‘廣益’扁穗牛鞭草花粉形態、表面雕紋及萌發孔等,與其他禾本科植物花粉形態相似。2.2花粉活力與花粉?；盍乃氲捻敳克闫?第1節位小花記作第1朵小花。經調查統計,1枝完整的扁穗牛鞭草花序通常含小花33~43朵,平均為37朵,第1~33朵小花的平均花粉活力為29.96%,其中有柄小花花粉活力為29.72%,無柄小花花粉活力為30.21%。扁穗牛鞭草花粉活力以頂部最高,第1朵小花活力可以達到74.05%;向下活力開始降低,到中部的第16和第18朵小花達到最低,均低于8.00%;再向下活力開始上升,并趨近于平均活力(表1),這與吳彥奇和杜逸報道的“其基部第8或9小花以下的花粉粒全部無活力”有差別。該試驗結果可能受扁穗牛鞭草種植年限、當年氣候因素及花粉采集時期的影響,有關外界環境條件對花粉活力影響尚需要進一步研究。2.3自交不親和性特征適宜環境條件下,花粉在柱頭上萌發,然后長出花粉管插入柱頭。授粉后1,2,3,4和5h,花粉萌發率隨著花粉粒在柱頭上停留時間的增長而提高。授粉1h后花粉萌發很快,3h后大量花粉管進入柱頭表面的乳突細胞,花粉管生長無任何異?，F象,4h后花粉萌發率超過60%,反映出授粉時間長短與花粉管萌發狀況有一定的關聯。但總趨勢是花粉萌發率不高,授粉5h后發芽率僅為62.39%。隨授粉時間延長,花粉管增長。但在授粉1h內花粉管增長速度最快,為14.1μm/h,以后的增長速度減緩,為1.3~3.9μm/h(表2)。以自花授粉材料觀察花粉與柱頭的相互識別情況,結果發現在自花授粉后,因相同基因型的花粉在柱頭上表現出一定的不親和現象,有的與乳突細胞接觸不緊密,有的即使伸入柱頭乳突細胞,花粉管幾乎都有分叉、破裂(圖1d),證明‘廣益’扁穗牛鞭草存在自交不親和性。另外還觀察到,花粉在柱頭上附著量很少,即使有花粉附著,花粉萌發遲,花粉管不伸入柱頭乳突細胞,盤繞在柱頭表面(圖1e),或花粉管扭曲膨大(圖1f),甚至呈萎縮狀態。從觀測結果看,廣益‘扁穗牛鞭草自交不親和主要表現為以下3種類型:1)花粉不能萌發;2)花粉能萌發,花粉管盤繞在柱頭表面,不能進入;3)花粉能萌發,花粉管畸形或破裂,從而影響受精和結實。a:‘廣益’扁穗牛鞭草畸形花粉粒萌發GerminationofabnormalpollenofH.compressa.b:‘廣益’扁穗牛鞭草花粉粒的赤道面觀Pollen’sequatorialviewofH.compressa.c:‘廣益’扁穗牛鞭草花粉粒萌發孔Pollen’germinalapertureofH.compressa.d:花粉管進入乳突細胞,但尖端分叉Pollentubesenteringintopapillatebuttipsbursting.e:花粉萌發后盤繞在柱頭表面Pollenbindingtoandtwingingonthesurfaceofstigmaaftergermination.f:花粉萌發后花粉管尖端膨大Pollengerminationbuttipsoftubesinflation2.4穎果的枝條形態對取回室內的4889枚成熟果穗進行剝離檢查,共發現穎果57粒,其自然傳粉結實率為1.17%。沒有結成穎果的果穗幾乎都可以發現枯萎的雌蕊,說明極低的結實率與生殖生理等因素有關,與穎果是否脫落等物理原因無關。扁穗牛鞭草進入結實期后,花序上、下部的穎果成熟時間極不一致,花序軸干脆易折,統計每個花位結實數目非常困難,給穎果的收集工作帶來不便。3‘廣益’排穗牛鞭草花粉的形態特征扁穗牛鞭草在長期的自然選擇和人類不自覺的選擇下,無性繁殖方式在生產上已被默認,以至延續至今,這可能是造成其結實率低的主要原因之一。由于其強大的橫走根莖能夠很快在地面長出新的植株,新的植株又能迅速向周圍蔓延,在地上形成了嚴密的覆蓋層,這就造成了扁穗牛鞭草產生的種子不易下土,即使下土后也很難長出新的植株。同時,利用這種高產優質牧草也是在持續放牧或適時刈割時,幾乎不會等到其開花結實,這些都在無意識中加速了對其種子繁殖生殖方式的淘汰,使其更加適應于無性繁殖。Heslop-Harrison指出牧草花粉在結構和功能上具有不同程度的特異性,花粉是否具有育性及其活力的強弱都將可能影響結實的成敗;并且花粉粒的形態特征符合遺傳的穩定性和多樣性規律,完全可以反映科、屬、種間的一致性及差異。禾本科植物的花粉粒均為圓球形,單孔,顆粒狀紋飾,而在種間存在著性狀細節中的差異?；ǚ鄣难莼厔轂橹坌巍v長形(單溝)→球形→扁球形(具溝)→扁球形或圓球形→長球形?；ǚ鄣谋砻婕y飾演化趨勢為表面光滑→表面條紋狀、網狀→表面疣狀、刺狀等。依據上面的觀點,從‘廣益’扁穗牛鞭草花粉的外觀形態、外表紋飾等特征推斷,除干癟粒以外,其花粉粒具有比較進化的外觀特征,基本屬于正常粒。此外,已萌發的花粉粒中也有干癟現象出現,這可能是其自身遺傳作用的結果,也可能是后天氣候條件甚至是營養條件所致。電鏡掃描觀測研究結果表明,‘廣益’扁穗牛鞭草自交不親和與萌發的花粉管有許多異常現象有關。有研究認為提出自交不親和是由S基因控制,但植物生殖過程是復雜的,‘廣益’扁穗牛鞭草自交不親和的遺傳機制也是復雜多樣的,可能存在2種或2種以上遺傳機制同時在起作用,這需要進一步研究。關于花粉管在花柱中破裂的現象,與外界溫度和花柱內不適合的滲透壓有關,因而不能受精。在遠緣雜交情況下,發生花粉管破裂更是常有的現象。在所有這些情況下,花粉管的破裂是一種生物學上不適應的表現,其后果是導致部分或完全的不孕。目前有大量文獻表明花粉管破裂有其積極的生物學意義,花粉管泄出的內含物對雌蕊組織和正在發育的幼胚有深刻影響,并能促進相鄰花粉萌發和生長?！畯V益’扁穗牛鞭草不結實顯然與花粉管的破裂有一定關系,但是盡管‘廣益’扁穗牛鞭草結實率相當低,受精作用仍然可以成功完成,精核來源于自花還是異花尚需研究。另外,‘廣益’扁穗牛鞭草花柱中生長的花粉管及其流出的內含物中,含有許多營養物質和生理活性物質,這些物質是積極參與雌蕊的代謝從而影響受精與胚胎發育,或僅是無謂的消耗,尚需用試驗驗證。花粉活力偏低也是造成扁穗牛鞭草結實困難的原因之一,并且不同花位花粉活力不同。位于花序頂部的小花花粉活力較高,可能是由于頂端優勢,使其有充分的營養供應和時間來完成生理成熟,育性較高。而中部的小花在成花過程中既要面臨上部小花開花對營養的需要,又要面對下部小花抽穗及成花對營養的爭奪,所以育性普遍偏低?；啃』ㄓ捎谖挥谶\輸營養物質的花序軸基部,在營養的獲得上明顯更占有優勢,所以其花粉生活力較中部小花有一定的提高。‘廣益’扁穗牛鞭草花器官的正常發育、授粉和受精在其繁殖中是最重要也是關鍵的過程,對這些復雜生理過程的研究也顯得迫切。因為它是生產上廣泛使用的重要草種,其危機是它不能夠產生正常的、能夠發芽生根的種子,這就是為什么“花而不實”是‘廣益’扁穗牛鞭草花粉研究中所面臨的最大問題。在今后的研究中,對其“花而不實”機理進