前言人們在近幾十年中，對癌癥的基礎研究有了很大進展，發現了很多有效的抗癌聚合物。但是研究成果中的很大一部分都還是停留在實驗室研究，并沒有實際運用到臨床。造成這種情況的主要原因之一是沒有讓這些藥物抵達指定目的地的方法，而與此同時不會或者盡量少的發生對機體組織的破壞。但到目前為止，常規的靜脈注射給藥是沒有辦法做到的。例如，有文獻統計，把單克隆抗體注射到靜脈中，一般只有萬分之一到達期望值[1,2]。這不但使得治病花費大，藥物浪費，還達不到想要的治病目的。科學家們為了找到能夠增強藥效靶向的有效方法投入了很多人力、物力以及財力，可見該研究課題具有很重要的研究意義[3-5]。研究者想要得到一種可以有效的避開機體阻礙，能把藥物精準的運輸到靶向部位的這樣一種載體。但是，探索出一種行之有效的藥物載體是極具挑戰性的，這需要很多學科之間的相互配合。納米顆粒具有不易沉淀，流動性和穩定性好等優點，因此世界上的許多研究者都想使用納米技術靶向治療一些不可治愈或是治療方法副作用大的疾病。之前有文獻報道使用柔性納米脂質體治療乳房癌，正是通過使用注射靶向給藥的方法[6]。不同給藥方式，藥物運輸方式也不同，而微粒靶向給藥的傳輸方式主要是血液循環運送藥物去指定部位。微顆粒在血管中的運動范圍一般在血管壁附近的幾微米之內，這樣的目的就是為了躲開血管中心的紅細胞[7]。當微顆粒靶向給藥時，血液循環運送藥物到指定部位，微顆粒表面的配體和靶向部位的受體之間產生的吸引力使其二者相互粘附，使微顆粒產生內化作用，將藥物釋放于靶向部位，從而起到給藥治病的作用。本論文制備了不同粒徑大小和不同形狀的納米載體（脂質體、類脂囊泡與碳納米管）。將CpGODN包裹在其內部或吸附在其表面，并在細胞攝粒作用下將CpGODN分別引入免疫細胞與癌細胞，從而實現細胞給藥。探索其粒徑和形狀對免疫細胞激活的影響，及對癌細胞的殺傷作用。尋找相對合適的粒徑和形狀，從而為納米材料在醫藥領域的應用提供理論基礎。本研究以脂質體和類脂囊泡為載體，對新型雄激素受體抑制劑二甲基姜黃素制劑研究。將不溶于水且穩定性差的二甲基姜黃素包裹在脂質體和類脂囊泡中，考察了影響囊泡形成和包封率的處方和制備工藝條件，并對其進行了質量評價研究，為制備更穩定的二甲基姜黃素脂質體和二甲基姜黃素類脂囊泡制劑研究提供參考。西安交通大學網絡教育學院畢業論文2不同粒徑大小和不同形狀的藥物載體的制備2.1實驗儀器實驗操作用到的儀器見下表2-1。表2-1實驗儀器一覽表Tab2-1TheListofexperimentalinstruments儀器型號生產廠家旋轉蒸發器R205B上海申生科技有限公司超聲波清洗器PS-30AL深圳市深華泰超聲洗凈設備有限公司超聲波細胞粉碎機ESW-650N上海茸研儀器有限公司納米激光粒度儀NanoZS90英國馬爾文有限公司高分辨透射顯微鏡JEM-2100日本電子株式會社旋片式真空泵2XZ-2浙江臺州求精真空泵有限公司玻璃真空干燥器A-213北京鑫潤科諾儀器儀表有限公司電子天平JA1203上海良平儀器儀表有限公司循環水式多用真空泵SHZ-D3河南省予華儀器有限公司恒溫振蕩器IS-RSD3上海滬粵明科學儀器有限公司脂質體擠出器Mini-extruder美國AvantiPolarLipids2.2實驗試劑實驗試劑見下表2-2。表2-2實驗試劑一覽表Tab2-2TheListofexperimentalreagents藥品（試劑）名稱規格生產廠家DOTAPD6182-250mgSigma-Aldrich膽固醇C0318-25g同上司盤60國藥集團化學試劑有限公司三氯甲烷分析純同上無水乙醇分析純同上無水葡萄糖分析純天津市北辰方正試劑廠超純水機DW100-L上海和泰儀器有限公司磷酸鹽緩沖溶液pH7.2-7.4北京諾博萊德科技有限公司CpGODN5`-TCGACGTTTTGACGTTTTGACGTTTT-3`蘇州泓迅生物科技有限公司碳納米管HipcoPurifiedBatchP1-0011.0gpowderNanoIntegri2.3不同粒徑大小和不同形狀的的藥物載體的制備及表征2.3.1CpGODN/脂質體復合體的制備2.3.1.1四種方法制備不同粒徑大小的脂質體為了制備不同粒徑大小的CpGODN/脂質體復合體，最開始本文嘗試了四種制備方法：薄膜分散法、逆相蒸發法、冷凍干燥法及乙醇注入法。薄膜分散法：用電子天平稱取0.0023g卵磷脂放入燒杯1，膽固醇0.0027g放入燒杯2，在燒杯1和2中分別加入適量氯仿溶解，混勻燒杯1和2中的溶液，倒入梨形瓶，37℃恒溫加熱，使用旋轉蒸發儀除去溶劑。然后放入真空干燥器內干燥24h。24h后，梨形瓶中加5%葡萄糖溶液10mL，超聲5min，然后將脂質體5%葡萄糖溶液倒入15mL離心管。接著用探頭超聲18min，每分鐘超聲30s，停30s，即得脂質體。逆相蒸發法：用電子天平稱取0.0614g卵磷脂放入燒杯1，膽固醇0.0208g放入燒杯2，在燒杯1和2中分別加入適量氯仿溶解，混勻燒杯1和2中的溶液，倒入50mL離心管，用探頭超聲3min，每超聲5s，停3s，倒入離心瓶，使用旋轉蒸發儀除去溶劑。真空，過夜，37℃搖床30min，加適量5%葡萄糖溶液，超聲10min，即得脂質體。冷凍干燥法：用電子天平稱取0.0023g卵磷脂放入燒杯1，膽固醇0.0027g放入燒杯2，在燒杯1和2中分別加入適量氯仿溶解，混勻燒杯1和2中的溶液，倒入梨形瓶，37℃恒溫加熱，使用旋轉蒸發儀除去溶劑。然后放入真空干燥器內干燥24h。24h后，梨形瓶中加5%葡萄糖溶液10mL，手搖10min，超聲10min，然后將脂質體5%葡萄糖溶液倒入15mL離心管。將離心管放入-80℃冰箱10min，取出放入真空冷凍干燥箱48h。48h后，將離心管取出加入適量5%葡萄糖溶液，即得脂質體。乙醇注入法：用電子天平稱取0.0023g卵磷脂，膽固醇0.0041g放入燒杯1，加入適量無水乙醇，攪拌使溶。打開水浴鍋，調到65℃，在燒杯2中加入80mL5%葡萄糖溶液，將其放入水浴鍋中。當燒杯2中的溫度達到65℃時，將燒杯1中的溶液通過注射器勻速注入燒杯2中，緩慢攪拌10min，水浴保溫半小時。冷卻后取出，濾膜過濾，即得脂質體。2.3.1.2薄膜分散法制備不同粒徑大小的脂質體使用薄膜分散法制備脂質體。本文考察了兩種磷脂（卵磷脂和DOTAP）與膽固醇作為成膜材料，且改變卵磷脂/DOTAP與膽固醇的比例（1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、2：1、3：1、4：1）來制備脂質體。用電子天平稱取適量卵磷脂/DOTAP放入燒杯1，膽固醇放入燒杯2，在燒杯1和2中分別加入適量氯仿溶解，混勻燒杯1和2中的溶液，倒入梨形瓶，37℃恒溫加熱，使用旋轉蒸發儀除去溶劑。然后放入真空干燥器內干燥24h。24h后，梨形瓶中加5%葡萄糖溶液10mL，超聲5min，然后將脂質體5%葡萄糖溶液倒入15mL離心管。接著用探頭超聲18min，每分鐘超聲30s，停30s，即得脂質體。將之前制備好的脂質體與5%葡萄糖溶液溶解的CpGODN以7.5:1(摩爾比)的比例混合，并在37℃下放置30min形成CpGODN/脂質體復合體。脂質體擠出器過濾CpGODN/脂質體溶液，納米激光粒度及Zeta電位分析儀25℃測定脂質體粒徑及Zeta電位。并使用TEM觀察CpGODN/脂質體復合體的形態。2.3.2CpGODN/類脂囊泡的制備采用薄膜分散法制備CpGODN/類脂囊泡。本文考察了三種非離子表面活性劑（Span40、Span60和Span80）與膽固醇作為成膜材料，改變非離子表面活性劑與膽固醇的比例（1：1、1：2、1：3、1：4、2：1、3：1、4：1）制備類脂囊泡。首先，稱取適量非離子表面活性劑（Span40、Span60和Span80）和膽固醇于圓底燒瓶中。再向其中加入2mL有機溶劑混合物（三氯甲烷：乙醇=4:1，v/v）溶解，于50℃減壓蒸發至均勻成膜（轉速為65r/min），用鋁箔紙封住瓶口真空干燥4h以上。真空干燥結束后，向燒瓶中加入PBS10mL，控溫于50℃并置水浴超聲儀中超聲30min形成混懸液，再在冰水浴條件下，650W、20-25KHz探頭超聲10min（工作9.9s，間歇9.9s）使之分散均勻，即得類脂囊泡。置4℃冰箱保存備用。將制備好的類脂囊泡與CpGODN以類脂囊泡與CpGODN為7.5:1的比例混合，并在37℃下放置30min形成CpGODN/類脂囊泡復合體。與CpGODN/脂質體復合體的表征方式相同，過濾，測粒徑及Zeta電位，再在TEM下觀察CpGODN/類脂囊泡復合體的形態。2.3.3CpGODN/碳納米管的制備已有文獻報道，CpGODN之間是通過π-π共價鍵結合的螺旋狀雙鏈DNA。截短純化過的單壁碳納米管可以通過在CpGDNA的存在下，超聲處理后有效地分散在水中。CpGDNA可通過π堆疊結合碳納米管，產生螺旋形纏繞到表面。CpGDNA和碳納米管結合自由，可以使兩個碳納米管相分離。將CpGODN與碳納米管混合后，碳納米管可以通過共價鍵與CpGODN結合，CpGODN纏繞在碳納米管上，從而使碳納米管能均勻地分散在溶液中。本文嘗試把CNT分別溶解在5%葡萄糖溶液、1%十二烷基硫酸鈉溶液與CpGODN（碳納米管：CpGODN=1.0：0.1、碳納米管：CpGODN=1.0：0.5、碳納米管：CpGODN=1.0：1.0）中，觀察了碳納米管在其中的分散性。2.3.4電鏡表征方法采用負染法對制備好的脂質體、類脂囊泡與碳納米管的形態進行表征。方法如下：用鑷子夾住銅網邊緣，將待測樣品用滴管或者注射器滴在銅網上，靜置1min。用普通濾紙將多余的樣品從另一邊吸走，待上層膜干，用一次性滴管滴加1滴磷鎢酸（濃度1%-3%）至銅網上，靜置1min，濾紙吸走多余的樣品。如果顏色太深，需加1滴水將染料稀釋。等待幾秒，濾紙吸走，自然晾干，待測。2.3.5實驗結果2.3.5.1脂質體粒徑與形態的表征四種方法制備的脂質體粒徑結果如下：表2-3脂質體粒徑及Zeta電位Tab2-3ParticlesizeandZetapotentialofliposomes方法粒徑（nm）Zeta電位（mV）薄膜分散法118.5-38.2逆相蒸發法802-36冷凍干燥法1460-23.5乙醇注入法105.5-21.4如表2-3結果所示，使用薄膜分散法、逆相蒸發法、冷凍干燥法及乙醇注入法這四種方法制備的脂質體雖然可以制備出不同粒徑大小的脂質體，但是粒徑之間沒有規律性的梯度，制備的脂質體粒徑過大，沒有進一步討論的意義。而且，脂質體由于是不同方法制備的，方法之間存在差異性，沒有可比性，因此本文不采用這四種方法制備的脂質體。本實驗的目的是得到不同粒徑大小的脂質體，本文嘗試從制備脂質體的材料方面入手，改變卵磷脂/DOTAP與膽固醇兩種材料的比例來檢測所制備的脂質體的粒徑大小與Zeta電位。結果如下：表2-4脂質體粒徑及Zeta電位Tab2-4ParticlesizeandZetapotentialofliposomes卵磷脂:膽固醇粒徑（nm）Zeta電位（mV）1：1155.6-38.31：2215.4-31.91：3171.4-27.61：4156.9-32.51：5151.2-322：1142.1-34.83：1127.6-39.44：1123.4-43.1從表2-4的結果得出，通過不同比例的卵磷脂和膽固醇制備的脂質體雖然粒徑小，但都基本處于100-200nm，粒徑比較集中，粒徑之間沒有明顯的差異性，且沒有可比較的粒徑梯度，因此不能進行粒徑大小的比較。此外，由于卵磷脂帶負電，制備的脂質體也帶負電。表2-5脂質體粒徑及Zeta電位Tab2-5ParticlesizeandZetapotentialofliposomesDOTAP:膽固醇粒徑（nm）Zeta電位（mV）1：1105.852.11：2109.243.71：3134.055.41：4256.652.31：5600.553.22：1116.6453：1160.442.84：1144.242.7從表2-5的結果得出，與卵磷脂和膽固醇制備的脂質體相比，通過不同比例的DOTAP和膽固醇制備的脂質體粒徑均勻，且粒徑之間差異比較明顯，具有梯度性，因此可以進行粒徑大小的比較。此外，由于DOTAP帶正電，制備的脂質體也帶正電。而且與卵磷脂和膽固醇制備的脂質體相比，DOTAP和膽固醇制備的脂質體的Zeta電位比較大，表示其分散度較好。本文采用了圖2-1所示的三種粒徑差異比較明顯，且具有粒徑梯度的粒徑（105nm、256nm及600nm）來進行納米載體粒徑大小的比較。圖2-1脂質體粒徑及Zeta電位Fig2-1ParticlesizeandZetapotentialofliposomes(n=3)圖2-2脂質體透射電鏡圖Fig2-2TEMmicrographofliposomes如圖2-2電鏡圖所示，制備好的脂質體粒度大小均勻，表面光滑，多為圓形，無覆蓋和粘連現象。實驗結果表明：使用薄膜分散法、逆相蒸發法、冷凍干燥法、乙醇注入法這四種方法制備的脂質體與由卵磷脂和膽固醇制備的脂質體不符合實驗要求。從表2-5及圖2-1的結果看出，通過不同比例的DOTAP和膽固醇分別制備了三種不同粒徑梯度的脂質體。當DOTAP和膽固醇的比例為1:1,1:4和1:5時，脂質體平均粒徑分別為(105±3.4)nm,(256±4.1)nm和(600±5.7)nm。Zeta電位是粒子間的引力和斥力的度量，是分散度的指標。Zeta電位絕對值越大，分散越好。與粒度相似，了解Zeta電位有助于預測其在人體內的變化。Zeta電位實驗結果表明，這3種粒徑大小的脂質體所對應的Zeta電位之間的差異不大，但數值不低，表明其分散性良好。卵磷脂為陰離子磷脂，其制備的脂質體帶負電，與DNA之間具有排斥作用。而DOTAP陽離子磷脂制備的脂質體帶正電，這使得其二者可以很好的結合。而且，陽離子脂質體比中性和陰離子脂質體有更高的免疫效應。2.3.5.2類脂囊泡粒徑與形態的表征三種非離子表面活性劑作為成膜材料的實驗結果如圖2-3所示：圖2-3非離子表面活性劑的包封率Fig2-3EffectofNonionicsurfactantsontheencapsulationefficiency(n=3)圖2-3測定CpGODN/類脂囊泡包封率的結果表明，Span40、Span60和Span80作為成膜材料與膽固醇制備的類脂囊泡測定的包封率分別為(61.8±5)%、(86.1±11)%和(49.5±9)%（n=3）。司盤-60作為囊泡材料制備的類脂囊泡包封率高，且外觀呈均一的混懸液。原因可能是包封率受囊材結構的影響。司盤-40和司盤-60的烷基鏈長度不同，其中司盤-60的烷基鏈長。而司盤-80結構中具有不飽和雙鍵，鄰近分子排列不緊密，藥物易泄露。而且司盤-60相變溫度最高，包封率最高。通過實驗優化，選擇非離子表面活性劑司盤-60作為類脂囊泡的囊泡材料。本研究采用Span60和膽固醇兩種囊材的不同比例制備類脂囊泡，對類脂囊泡的粒徑及Zeta電位進行調控。結果如下：表2-6類脂囊泡粒徑及Zeta電位Tab2-6ParticlesizeandZetapotentialofniosomesSpan60:膽固醇粒徑（nm）Zeta電位（mV）4:1301.4-29.43:1282.6-32.82:1116.4-37.51:1127.4-38.31:2298.8-30.21:3762.2-30.71:4800.2-31.8從表2-6的結果得出，通過不同比例的Span60和膽固醇制備的類脂囊泡粒徑均勻，且粒徑之間差異也比較明顯，也有明顯的粒徑梯度，因此可以進行粒徑大小的比較。而且制備的類脂囊泡的Zeta電位較大，表明其分散度較好。本文采用了圖2-4所示的三種粒徑差異比較明顯，且具有粒徑梯度的粒徑（127nm、298nm及800nm）來進行粒徑大小的比較。圖2-4類脂囊泡粒徑及Zeta電位Fig2-4ParticlesizeandZetapotentialofniosomes(n=3)圖2-5類脂囊泡透射電鏡圖Fig2-5TEMmicrographofniosomes如圖2-5電鏡圖所示，制備好的脂質體粒度大小均勻，表面光滑，多為圓形，且無覆蓋和粘連現象。實驗結果表明：由于Span40和Span80的包封率低，因此，本文采用Span60作為成膜材料。如表2-6及圖2-4所示，Span60和膽固醇以不同比例分別制備了三種不同粒徑梯度的類脂囊泡。當Span60和膽固醇的比例為1:1、1:2和1:4時，類脂囊泡的平均粒徑分別為（127±2.9）nm,（298±3.6）nm和（800±4.4）nm。這3種粒徑大小的類脂囊泡的Zeta電位的差異不大。制備類脂囊泡時，超聲雖然可以改變類脂囊泡的粒徑大小，也可使大多室類脂囊泡轉變為小單室類脂囊泡，但如果超聲時間過長會使類脂囊泡的穩定性變差，根據文獻本次實驗選定時間為10min。2.3.5.3碳納米管形態的表征將CNT分散在5%葡萄糖溶液、1%十二烷基硫酸鈉溶液與CpGODN（碳納米管：CpGODN=1.0：0.1、碳納米管：CpGODN=1.0：0.5、碳納米管：CpGODN=1.0：1.0）在離心時間為3min，超聲時間為5-10min的條件處理后，實驗結果如下圖（圖2-6至圖2-10）所示：圖2-6碳納米管與5%葡萄糖混合A：混合超聲效果圖；B：經過10000r/min離心3min的效果圖圖2-6實驗結果表明，圖A中碳納米管與5%葡萄糖溶液混合，在冰水浴超聲30min后，碳納米管在底部沉淀，沒有均勻地分散在5%葡萄糖溶液中；圖B中碳納米管與5%葡萄糖溶液10000r/min離心后，碳納米管幾乎全部沉在離心管底部。表明，碳納米管在5%葡萄糖溶液中的分散效果差。圖2-7碳納米管與1%十二烷基硫酸鈉溶液混合A：混合超聲效果圖；B：經過10000r/min離心3min的效果圖圖2-7實驗結果表明，圖A中碳納米管與1%十二烷基硫酸鈉溶液混合，在冰水浴超聲30min后，碳納米管可以均勻地分散在1%十二烷基硫酸鈉溶液中；圖B與5%葡萄糖溶液相似，碳納米管與1%十二烷基硫酸鈉溶液10000r/min離心后，碳納米管幾乎全部沉在離心管底部。表明，碳納米管在1%十二烷基硫酸鈉溶液中的分散效果差。而且，十二烷基硫酸鈉對人體有毒性，不適用于人體。圖2-8碳納米管：CpGODN=1.0：0.1效果圖A：碳納米管：CpGODN=1.0：0.1混合超聲效果圖B：碳納米管：CpGODN=1.0：0.1經過10000r/min離心3min的效果圖圖2-8實驗結果表明，圖A中碳納米管與CpGODN以1.0:0.1的比例混合，在冰水浴超聲30min后，碳納米管均勻地分散在CpGODN的5%葡萄糖溶液中；圖B中碳納米管與CpGODN的5%葡萄糖溶液10000r/min離心后，大部分碳納米管沉在離心管底部。表明，碳納米管與CpGODN以1.0:0.1的比例在CpGODN中的分散效果差。圖2-9碳納米管：CpGODN=1.0：0.5效果圖A：碳納米管：CpGODN=1.0：0.5混合超聲效果圖B：碳納米管：CpGODN=1.0：0.5經過10000r/min離心3min的效果圖圖2-9實驗結果表明，圖A中碳納米管與CpGODN以1.0:0.5的比例混合，在冰水浴超聲30min后，碳納米管沒有均勻地分散在CpGODN的5%葡萄糖溶液中，離心管中間有絮狀沉淀；圖B中碳納米管與CpGODN的5%葡萄糖溶液10000r/min離心后，大部分碳納米管沉在離心管底部。表明，碳納米管與CpGODN以1.0:0.5的比例在CpGODN中的分散效果差。圖2-10碳納米管：CpGODN=1.0：1.0效果圖A：碳納米管：CpGODN=1.0：1.0混合超聲效果圖B：碳納米管：CpGODN=1.0：1.0經過10000r/min離心3min的效果圖圖2-10實驗結果表明，圖A中碳納米管與CpGODN以1.0:1.0的比例混合，在冰水浴超聲30min后，碳納米管均勻地分散在CpGODN的5%葡萄糖溶液中；圖B中碳納米管與CpGODN的5%葡萄糖溶液10000r/min離心后，碳納米管仍分散的很均勻。表明，碳納米管與CpGODN以1.0:1.0的比例在CpGODN中的分散效果好。上述實驗結果表明，碳納米管和CpGODN的比值為1.0：1.0時，碳納米管分散性較好。從離心效果圖來看，經過10000r/min離心3min后，離心管底部基本沒有碳納米管聚集，分散效果好。這可能是因為CpGODN的結構是π-π共價鍵結合的螺旋狀雙鏈DNA，碳納米管具有獨特的管狀結構，CpGODN通過共價鍵與碳納米管結合，纏繞在碳納米管的表面。CpGODN與碳納米管混合后，碳納米管可以通過共價鍵與CpGODN結合，CpGODN纏繞在碳納米管上，從而使碳納米管能分散在溶液中。本文使用這個比例來考察CpGODN/碳納米管復合體對細胞的作用。將1mgCNT與5mgCpGODN混合后，加入5mL5％葡萄糖溶液，冰水浴超聲處理20min，形成CpGODN/碳納米管復合物，TEM觀察CpGODN/碳納米管復合物的形態，并置于4℃冰箱保存備用。圖2-11碳納米管的透射電鏡圖Fig2-11TEMmicrographofCNT圖2-11實驗結果表明：透射電鏡下觀察CNT呈單根分布，很少有CNT重疊在一起。從電鏡圖中本文看到，CNT并不是全都筆直，而是都有一定程度或是弧度的彎曲。這可能是因為CNT在編織的時候不但有六邊形，而且還出現了五邊形與七邊形，而正是這幾種多邊形之間相連的張力讓CNT彎曲。西安交通大學網絡教育學院畢業論文3不同粒徑大小與不同形狀的藥物載體對細胞的影響3.1實驗細胞系細胞名稱：RAW264.7來源：小鼠腹腔巨噬細胞細胞系細胞種類：巨噬細胞細胞類型：貼壁細胞培養基種類：RPMIMedium1640＋10%胎牛血清＋雙抗培養的天數：2天;細胞倍增時間1-2天左右；細胞增殖至80%左右即可傳代細胞狀態與特征簡述：細胞比較小，傳代后，在第一天是圓形的，長了一段時間后，由于密度比較大會變成梭型，有觸角；生長速度較快。圖3-1RAW264.7細胞系Fig3-1RAW264.7cells細胞名稱：U251來源：人神經膠質細胞瘤細胞細胞種類：腫瘤細胞細胞類型：貼壁細胞培養基種類：DMEM＋10%胎牛血清＋雙抗培養的天數：1-4天；細胞倍增時間3-4天左右；細胞增殖至80%左右即可傳代細胞狀態與特征簡述：剛解凍的細胞活力較弱，培養過一段時間后，繁殖增快。培養初始階段，細胞呈圓形，之后在分裂期可能就會變為多角狀。圖3-2U251細胞系Fig3-2U251cells3.2實驗儀器實驗操作時用到的儀器見下表3-1。表3-1實驗儀器一覽表Tab3-1TheListofexperimentalinstruments儀器型號生產廠家超凈工作臺SJ-CJ-2D蘇州蘇潔凈化設備公司CO2培養箱311ThermoFisherScientific倒置相差顯微鏡TS100-FNikon冰箱BCD-630WDA合肥榮事達三洋電器股份有限公司離心機ST8ThermoFisherScientific酶聯反應檢測儀ELX800UVBioTek高壓蒸汽滅菌鍋MLS-3750SANYO細胞培養瓶25m2Corning細胞培養板96孔板Corning離心管15mL,50mLCorning手動多道移液器10μL,,300μL,1000μLGenexBeta超純水儀H20pro-UV-TSartoriousstedim鼓風干燥箱DHG-9035A上海鰲珍儀器制造有限公司3.3實驗試劑實驗試劑見下表3-2。表3-2實驗試劑一覽表Tab3-2TheListofexperimentalreagents試劑規格生產廠家RPMIMedium1640500mL上海立菲生物技術有限公司DMEM培養基500mL同上IronFortifiedBovineSerum500mLSclenCell 氯化鉀（KCl）分析純國藥集團化學試劑有限公司氯化鈉（NaCl）分析純同上無水乙醇分析純同上PBS磷酸鹽緩沖液0.01MpH7.2-7.4NobleRyder青霉素-鏈霉素溶液100mL普諾賽TrypanBlue5gBiosharp胰蛋白酶5gGibcoDMSO100mLSigmaLifeScience小鼠TNF-α定量分析酶聯免疫檢測試劑盒(ELISA)小鼠TNF-α安徽巧伊生物科技有限公司CellCountingKit-8試劑盒CK04DojindoLaboratories3.4主要溶液的配制（1）青霉素-鏈霉素溶液的配制分別稱取青霉素0.01g，鏈霉素0.01g，再分別溶于100mL超純水（DDW）中，使濃度為100μg/mL。混合二者之后，攪拌使之均勻。濾膜過濾后，放在-20℃冰箱儲存備用。（2）磷酸鹽緩沖溶液（PBS）的配制分別稱取氯化鈉（NaCl）80g，十二水磷酸氫二鈉（NaHPO4·12H2O）36.3g，氯化鉀（KCl）2.0g與磷酸二氫鉀（KH2PO4）2.4g，加入800mL超純水溶解，將pH調至7.4，再用DDW定容至1000mL。實驗用的PBS需將濃度稀釋至1×PBS，121℃高溫滅菌1h，4℃保存，待用。（3）0.25%胰蛋白酶溶液的配制用400mLPBS溶解1g胰蛋白酶與0.08gEDTA，放冰箱4℃保存過夜。調節胰蛋白酶溶液的pH為7.4。濾膜過濾，放入-20℃冰箱儲存備用。（4）凍存液的配制RPMIMedium1640/DMEM培養基:胎牛血清:DMSO=8:1:1，現配現用。（5）75%乙醇溶液的配制將750mL的無水乙醇與250mL的超純水混合均勻，即得。（6）4%臺盼藍溶液的配制在研缽中加入4g臺盼藍，再加入適量蒸餾水，研磨至無顆粒方止。再加100mL雙蒸水，過濾，4℃冰箱保存。使用時，用PBS稀釋至0.4%。機理：因為正常活細胞的細胞膜是完好無損的，外來物質臺盼藍進入細胞后，使得細胞失活或是細胞膜變得不完整，通透性增加，臺盼藍將細胞染成藍色。一旦細胞膜失去其完整性，細胞就是死亡狀態。所以與別的方法相比，臺盼藍溶液作為區分細胞存活情況的方法具有簡單、方便以及快速等優點。（7）培養基的配制RAW264.7細胞培養基的配制：RPMIMedium1640培養基一瓶500mL，加入50mL胎牛血清，及5mL雙抗；U251細胞培養基的配制：DMEM培養基一瓶500mL，加入胎牛血清50mL，雙抗5mL。3.5實驗方法3.5.1免疫細胞及癌細胞的傳代、凍存與復蘇3.5.1.1免疫細胞RAW264.7傳代將一個燒杯放入潔凈操作臺作為廢液收集器，紫外滅菌30min，冰箱中取出滅菌過的PBS、含FBS的RPMIMedium1640培養基和胰蛋白酶，放入37℃水浴加熱。細胞培養一段時間后，從細胞培養箱中取出，倒去培養液，加入磷酸鹽緩沖溶液（PBS）10mL，上下左右輕輕晃動洗去死細胞，倒掉PBS。加入1mL胰蛋白酶，輕拍瓶壁底部，待胰蛋白酶消化下細胞，加入10mLRPMIMedium1640培養基，反復吹打幾次細胞，待細胞完全脫落為止。將細胞混懸液倒入15mL離心管，設置為1000r/min離心3min，倒掉上層培養基。再加入適量RPMIMedium1640培養基，用移液槍反復吹打混勻細胞。將20μLRAW264.7細胞懸液與60μL臺盼藍溶液混合，用移液槍轉移到細胞計數板上，計細胞數目。要使稀釋后的細胞懸液的最終濃度為1×106個/mL，用移液槍吸取1mL移至新的培養瓶中。用RPMIMedium1640培養基稀釋10倍，使細胞濃度為1×105個/mL。不能以畫圓的方式，應以上下左右的方式混勻細胞。最后，放入培養箱中培養。3.5.1.2癌細胞U251傳代首先，在37℃恒溫水浴鍋中預熱胰酶、DMEM培養基和經過高溫滅菌的PBS。從培養箱中取出U251細胞培養瓶，倒掉其上層培養基。用10mL移液管吸取PBS至細胞培養瓶中，上下左右晃動，洗掉死細胞，棄去PBS。移取胰蛋白酶1mL至細胞培養瓶中消化2min。再吸取DMEM培養基10mL至細胞培養瓶中，洗吹幾次使細胞從瓶壁上脫落下來，將洗下來的細胞懸液倒入15mL離心管。放入離心機，設置為1000r/min離心3min。離心結束后，倒掉離心管內上層的培養基。在離心管中加入適量DMEM培養基，混合均勻。用移液槍吸取1mL移至新的培養瓶中。使新的培養瓶中最終傳代的濃度為1×105個/mL。放入培養箱培養。3.5.1.3細胞凍存第一步，先觀察細胞是否處于可以被凍存的狀態；接著，倒掉培養瓶中的培養基，用10mL滅菌過的PBS洗去死細胞及殘留的培養基。加入胰蛋白酶，輕輕拍培養瓶底部，使得胰酶更易讓細胞脫落。加入適量含有胎牛血清的培養基（RPMIMedium1640或者DMEM），吸吹幾次，讓細胞盡可能多的脫落。用移液管將細胞懸液移到離心管中，設置為1000r/min離心3min。倒掉上清液，加入適量培養基使其細胞濃度為1×105-1×106個/mL；最后，制備凍存液(要求現配現用)：將20%的

DMSO

1

mL（凍干保護劑）和RPMIMedium1640培養基（DMEM培養基）以8:2的比例混勻待用。將細胞濃度控制在1×105-1×106個/mL中，在無菌凍存瓶中加入一半細胞懸液及一半凍存液（總共1mL），用移液槍來回吸吹幾次混勻，讓細胞出于懸浮的狀態，封口。瓶口朝上，寫下細胞的種類及日期，-80℃冰箱或是液氮中凍存。3.5.1.4細胞復蘇復蘇細胞使用的方法是快速溶解法：在37℃恒溫水浴鍋中不停地晃動凍存細胞，最好在1min內快速融化。使用1000μL移液槍吸出細胞凍存液至離心管，吸取適量培養基至凍存管中，將殘留在凍存管中的細胞洗凈加入到離心管中，設置為1000r/min離心3min。倒掉上清液，加入適量培養基，混勻。用移液管將細胞懸液移至新的無菌細胞培養瓶中，加入培養基至10mL。將細胞培養瓶上下左右輕輕搖晃，放入培養箱培養。3.5.1.5細胞計數在洗凈的細胞計數板上放上干凈的蓋玻片，吸取少量經臺盼藍染色的細胞混懸液。將細胞懸液注入細胞計數板上，要注意的是，這個注入的過程不能產生氣泡，如果已有氣泡產生，必須重新再做一次。整個細胞計數板有四大格，而其中每一大格又有四小格，共有十六小格，數完細胞后，使用公式計算細胞個數。細胞密度公式如下：細胞個數/mL=（數的細胞數×4×104）/4（1）圖3-3細胞計數板示意圖Fig3-3Schematicdiagramofcellcountingplate注：圖3-3中表示可以計數；表示不可計數；左圖為細胞計數板的結構，右圖為左圖中圓圈內的部分。3.5.2檢測不同粒徑大小及不同形狀的藥物載體對細胞分泌TNF-α的影響酶聯免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）能夠檢測單核細胞上清液中的TNF-α水平。腫瘤壞死因子（TNF-α）是至今被發現的具有殺傷腫瘤細胞作用和很強的生物活性的物質。早在八十年代，歐美就曾經展開臨床研究，但是它本身的毒副作用較為嚴重，因此被迫中止。之所以能讓研究者們繼續深入的研究，是因為它具有特別明確的抗腫瘤作用。經過科學家們的不斷努力，對TNF-α不斷的研究，終于研制出了低毒并且高效的TNF-α變構體。終于在九十年代末歐美研究者再一次確定了TNF-α在治療腫瘤方面的重要地位。因此，本文采用了ELISA法檢測不同粒徑大小及不同形狀的藥物載體對免疫細胞及癌細胞的影響。使用方法嚴格按照說明書操作。3.5.2.1ELISA檢測不同粒徑大小的CpGODN/脂質體復合體及CpGODN/類脂囊泡復合體對RAW264.7免疫細胞分泌TNF-α的影響在96孔板中，每一個孔中加入100μL（1×104-1×105個/mL）RAW264.7細胞懸液，而且每個實驗組設3個平行實驗，以防出現誤差。再在每個孔中加入100μL沒有胎牛血清的培養基。放入37℃，5%CO2培養箱，過夜；將96孔板從培養箱中拿出，倒掉上清液，每孔使用200μLPBS沖洗3次，加入不同的待測物：NT(未處理)：200μL無FBS培養基；5%葡萄糖：5%葡萄糖溶液100μL＋100μL無FBS培養基；脂質體：脂質體(105nm、256nm與600nm)30.3μL＋269.7μL5%葡萄糖溶液＋100μL無FBS培養基；類脂囊泡：類脂囊泡(127nm、298nm與800nm)30.3μL＋269.7μL5%葡萄糖溶液＋100μL無FBS培養基；CpGODN的5%葡萄糖溶液：濃度為500μg/mL；CpGODN/脂質體：40μLCpGODN＋40.4μL脂質體(105nm、256nm與600nm)＋100μL無FBS培養基；CpGODN/類脂囊泡：40μLCpGODN＋40.4μL類脂囊泡(127nm、298nm與800nm)＋100μL無FBS培養基；放入37℃，5%CO2培養箱培養6h；6h后制樣，取上清液，離心（若試驗無法連續完成，放置4℃冰箱）。使用儀器檢測，在450nm處讀取O.D值，計算出TNF-α濃度。3.5.2.2ELISA檢測不同形狀的CpGODN/脂質體及CpGODN/碳納米管對RAW264.7免疫細胞分泌TNF-α的影響在96孔板中，每一個孔中加入100μLRAW264.7細胞懸液，每個實驗組設3個平行實驗，以防出現誤差。再在每個孔中加入100μL沒有胎牛血清的培養基，混勻。放入37℃，5%CO2培養箱，過夜；拿出培養箱中的96孔板，棄去上清液，PBS清洗3次，加入不同的待檢測物：NT：200μL無FBS培養基；5%葡萄糖：5%葡萄糖溶液100μL＋100μL無FBS培養基；脂質體：脂質體30.3μL＋269.7μL5%葡萄糖溶液＋100μL無FBS培養基；碳納米管：脂質體30.3μL＋269.7μL5%葡萄糖溶液＋100μL無FBS培養基；CpGODN的5%葡萄糖溶液：濃度為500μg/mL；CpGODN/脂質體：40μLCpGODN＋40.4μL脂質體＋100μL無FBS培養基；CpGODN/碳納米管：40μLCpGODN＋40.4μL碳納米管＋100μL無FBS培養基；放入37℃，5%CO2培養箱培養6h；6h后制樣，取上清液，離心（若試驗無法連續完成，放置4℃冰箱）。使用儀器檢測，在450nm處讀取O.D值，計算出TNF-α濃度。3.5.3CCK-8檢測藥物載體對細胞的毒性實驗CellCountingKit簡稱CCK試劑盒，是一種基于WST-8的檢測試劑盒。它被應用在很多方面，比如：細胞增殖實驗和細胞毒性試驗。它具有迅速、準確和靈敏度高的優點。如果存在電子耦合試劑，WST-8與線粒體內的脫氫酶發生氧化還原反應，生成甲臜產物（formazan）。甲臜產物的顏色很明顯，為橙黃色，它是水溶性產物。顏色深表明細胞增殖快，毒性小；反之，顏色淺的話，細胞增殖速度慢，毒性大。在波長為450mm檢測吸光度，如果吸光度大，證明活細胞數量多，細胞毒性小；反之，死細胞多，細胞毒性大。3.5.3.1CCK-8檢測CpGODN/脂質體復合體、CpGODN/類脂囊泡復合體與CpGODN/碳納米管復合體對RAW264.7免疫細胞的毒性實驗每孔加入RAW264.7細胞混懸液100μL(1×104-1×105個/mL)至96孔板，每組設置3個減少誤差，每孔加入100μL培養基，混勻。放入培養箱過夜培養，使細胞能夠貼壁生長；取96孔板，棄去上清液，使用200μLPBS洗3次，加入10μL不同的待測物質：CpGODN/脂質體；CpGODN/類脂囊泡；CpGODN/CNT；CpGODN的5%葡萄糖溶液：濃度為500μg/mL；5%葡萄糖溶液；NT：200μL無FBS培養基;空白對照：不加藥物，不接種細胞；在培養箱中培養6h，使得待測藥物可以與細胞充分結合，發揮藥效；6h后，取出96孔板，向待測的孔中加入CCK-8溶液10μL，盡量避免氣泡的產生，否則會影響O.D值的測量。再將96孔板培養4h；4h后，使用儀器檢測，在450nm處測定吸光度，計算出細胞死亡率。3.5.3.2CCK-8檢測CpGODN/脂質體復合體、CpGODN/類脂囊泡復合體與CpGODN/碳納米管復合體對U251癌細胞的毒性實驗96孔板每孔加入100μL濃度為1×104-1×105個/mL的U251細胞混懸液，3組平行實驗，每個孔中加入100μL培養基。培養箱過夜培養，使細胞可以很好的貼壁生長；取96孔板，棄去上清液，使用200μLPBS洗3次，加入10μL不同的待測物質：CpGODN/脂質體；CpGODN/類脂囊泡；CpGODN/CNT；CpGODN的5%葡萄糖溶液：濃度為500μg/mL；5%葡萄糖溶液；NT：200μL無FBS培養基;空白對照：不加藥物，不接種細胞；培養箱中培養6h，使得待測藥物可以與細胞充分結合，發揮藥效；6h后，取出96孔板，向待測的孔中加入CCK-8溶液10μL，盡量避免氣泡的產生，否則會影響O.D值的測量。再將96孔板培養4h，讓CCK-8和待測物質結合的比較充分；4h后，在450nm處檢測吸光度，并計算出細胞死亡率。3.6研究結果：不同粒徑及形狀的藥物載體對RAW264.7細胞分泌TNF-α的影響3.6.1不同粒徑大小的脂質體對RAW264.7細胞分泌TNF-α的影響表3-3脂質體的不同粒徑對RAW264.7細胞的影響Tab3-3EffectsofliposomeswithdifferentparticlesizesonRAW264.7cells脂質體實驗組TNF-α(pg/mL)NT645%葡萄糖溶液76CpGODN102CpG/Lip(105nm)148CpG/Lip(256nm)129CpG/Lip(600nm)119圖3-4脂質體的不同粒徑對RAW264.7細胞的影響Fig3-4EffectsofliposomeswithdifferentparticlesizesonRAW264.7cells圖3-4實驗結果表明，NT組、5%葡萄糖組及單獨CpGODN組分泌的TNF-α濃度均小于100pg/mL，而粒徑為105nm、256nm和600nm的CpGODN/脂質體復合體組分泌的TNF-α濃度均則處于100-150pg/mL。以脂質體為載體的CpGODN/脂質體復合體使得RAW264.7分泌TNF-α的量遠遠高于對照組及CpGODN單獨細胞給藥組。CpGODN/脂質體(105nm)復合體與對照組(NT,5%dex)相比，顯著誘導了RAW264.7細胞分泌TNF-α(***P＜0.001)；與單獨CpGODN組相比，分泌的TNF-α差異大(**P＜0.01)；而與粒徑為256nm和600nm的CpGODN/脂質體復合體相比，粒徑為105nm的CpGODN/脂質體復合體誘導RAW264.7細胞分泌的TNF-α差異顯著(*P＜0.05)；而粒徑為256nm和600nm的CpGODN/脂質體復合體對免疫細胞分泌TNF-α無顯著差異。3.6.2不同粒徑大小的類脂囊泡對RAW264.7細胞分泌TNF-α的影響表3-4類脂囊泡的不同粒徑對RAW264.7細胞的影響Tab3-4EffectsofniosomeswithdifferentparticlesizesonRAW264.7cells類脂囊泡實驗組TNF-α(pg/mL)NT765%葡萄糖溶液82CpGODN118CpG/Nio(127nm)202CpG/Nio(298nm)179CpG/Nio(800nm)156圖3-5類脂囊泡的不同粒徑對RAW264.7細胞的影響Fig3-4EffectsofniosomeswithdifferentparticlesizesonRAW264.7cells圖3-5實驗結果表明，NT組和5%葡萄糖組分泌的TNF-α濃度小于100pg/mL，單獨CpGODN組分泌的TNF-α濃度為100-150pg/mL，而粒徑為127nm、298nm和800nm的CpGODN/類脂囊泡復合體組分泌的TNF-α濃度均則處于150-200pg/mL。以類脂囊泡為載體的CpGODN/類脂囊泡復合體使得RAW264.7分泌TNF-α的量遠遠高于對照組及CpGODN單獨細胞給藥組。CpGODN/類脂囊泡(127nm)復合體與對照組(NT,5%dex)及CpGODN單獨細胞給藥組相比，顯著誘導了RAW264.7細胞分泌TNF-α(***P＜0.001)；與粒徑為298nm的CpGODN/類脂囊泡復合體相比，粒徑為127nm的CpGODN/類脂囊泡復合體誘導RAW264.7細胞分泌的TNF-α差異顯著(*P＜0.05)；和粒徑為800nm的CpGODN/類脂囊泡復合體相比，對RAW264.7細胞分泌TNF-α有顯著差異(**P＜0.01)。3.6.3不同形狀的藥物載體對RAW264.7細胞分泌TNF-α的影響表3-5不同形狀的藥物載體對RAW264.7細胞的影響Tab3-5EffectsofdifferentshapesofdrugcarriersonRAW264.7cells不同形狀實驗組TNF-α(pg/mL)NT595%葡萄糖溶液67CpGODN102CpG/Lip156CpG/CNT186圖3-6不同形狀的藥物載體對RAW264.7細胞的影響Fig3-6EffectsofdifferentshapesofdrugcarriersonRAW264.7cells圖3-6實驗結果表明，NT組、5%葡萄糖組與單獨CpGODN組分泌的TNF-α濃度處于50-100pg/mL，CpGODN/脂質體復合體組分泌的TNF-α濃度為100-150pg/mL，而CpGODN/CNT復合體分泌的TNF-α濃度均則處于150-200pg/mL。CpGODN單獨細胞給藥分泌的TNF-α比對照組(NT,5%dex)高，但差異不大；與CpGODN單獨組和對照組(NT,5%dex)相比，針狀的CpGODN/CNT復合體和球形的CpGODN/脂質體復合體更多，免疫作用更強。但與球形的CpGODN/脂質體復合體相比，細胞攝取針狀的CpGODN/CNT復合體更容易，針狀的CpGODN/CNT復合體使得RAW264.7分泌的TNF-α更多。3.6.4統計學分析本文使用Graphpadprism軟件來處理相同制劑和不同制劑之間的數據，而差異統計學處理是通過單因素方差分析(onewayANAVO)和t檢驗進行的，*P＜0.05被認為有統計學差異。所有數據都是采用平均數±SD表示。3.6.5討論RAW264.7分泌的細胞因子TNF-α在免疫激活方面起著很重要的作用。TNF-α具有殺傷腫瘤細胞的作用，并且具有很強的生物活性。納米載體載CpGODN進入細胞，可以促進RAW264.7細胞分泌出TNF-α細胞因子，進而促進免疫應答。實驗結果表明，與CpGODN單獨組及對照組相比，CpGODN/脂質體復合體與CpGODN/類脂囊泡復合體都可以很大程度的增大與免疫激活相關的細胞因子TNF-α的水平。尤其是與較大粒徑的脂質體和類脂囊泡相比，105nm的CpGODN/脂質體復合體與127nm的CpGODN/類脂囊泡復合體均有利于刺激RAW264.7分泌的細胞因子TNF-α，產生免疫應答作用。因此，本文可以得出結論，粒徑較小的納米顆粒載體在免疫佐劑治療方面的表現更加出色。與顆粒粒徑相似，納米載體的形狀對細胞及其在機體內的運動情況的影響也很重要。針狀的CpGODN/CNT復合體比球形的CpGODN/脂質體復合體使得細胞分泌出更多的細胞因子TNF-α。這可能是由于針狀的CpGODN/CNT復合體比球形的CpGODN/脂質體復合體更能有效地穿過細胞障礙到達細胞核內。RAW264.7對納米載體有內吞作用外，針狀的CpGODN/CNT復合體因為其針狀的結構可能會直接穿過細胞膜進入細胞，使得RAW264.7對CpGODN/CNT復合體的攝取量增加，從而產生更強的免疫效應。因此，納米載體顆粒和細胞之間相互作用在很大程度上受到顆粒粒徑和形狀的影響，不容小覷。3.7研究結果：細胞毒性測定3.7.1CpGODN/脂質體復合體、CpGODN/類脂囊泡復合體與CpGODN/碳納米管復合體對細胞的毒性實驗3.7.1.1CpGODN/脂質體復合體、CpGODN/類脂囊泡復合體與CpGODN/類碳納米管復合體對RAW264.7免疫細胞的毒性實驗表3-6CpGODN/Lip、CpGODN/Nio與CpGODN/CNT對RAW264.7細胞的毒性實驗Tab3-6ToxicityofCpGODN/Lip,CpGODN/NioandCpGODN/CNTonRAW264.7cellsRAW264.7實驗組TNF-α(pg/mL)NT965%葡萄糖溶液98CpG/Lip107CpG/Nio112CpG/CNT104圖3-7CpGODN/Lip、CpGODN/Nio與CpGODN/CNT對RAW264.7細胞的毒性實驗Fig3-7ToxicityofCpGODN/Lip,CpGODN/NioandCpGODN/CNTonRAW264.7cells圖3-7實驗結果表明，對照組NT(細胞懸液組)和5%dex組RAW264.7細胞的存活率接近100%，CpG/Lip、CpG/Nio與CpG/CNT的細胞存活率顯著高于對照組的細胞存活率。由此可以推斷出CpG/Lip、CpG/Nio與CpG/CNT細胞給藥對免疫細胞RAW264.7細胞幾乎無殺傷作用。CpG/Lip和CpG/Nio的細胞存活率稍微高于CpG/CNT，但是沒有顯著差異。3.7.1.2CpGODN/脂質體復合體、CpGODN/類脂囊泡復合體與CpGODN/碳納米管復合體對U251癌細胞的毒性實驗表3-7CpGODN/Lip、CpGODN/Nio與CpGODN/CNT對U251癌細胞的毒性實驗Tab3-7ToxicityofCpGODN/Lip、CpGODN/NioandCpGODN/CNTonU251cancercellsU251實驗組TNF-α(pg/mL)NT985%葡萄糖溶液97CpG/Lip83CpG/Nio82CpG/CNT78圖3-8CpGODN/Lip、CpGODN/Nio與CpGODN/CNT對U251癌細胞的毒性實驗Fig3-8ToxicityofCpGODN/Lip、CpGODN/NioandCpGODN/CNTonU251cancercells圖3-8實驗結果表明，對照組NT（細胞懸液組）和5%dex組U251癌細胞的存活率接近100%，但與其相比，CpG/Lip、CpG/Nio和CpG/CNT的細胞存活率就很低。針狀的CpG/CNT的細胞存活率低于球形的CpG/Lip和CpG/Nio的細胞存活率，差異比較顯著(*P＜0.05)。由此可以推斷出CpG/Lip、CpG/Nio與CpG/CNT對U251癌細胞有殺傷作用，而CpG/CNT對U251癌細胞的殺傷作用更大。3.7.2統計學分析同“3.6.4統計學分析”方法分析。3.7.3討論因為不同藥物載體對細胞具有一定程度的細胞毒性作用，由CCK-8的原理發現：活細胞數量與其檢測到的吸光度成正比。試驗結果表明，CpGODN/Lip、CpGODN/Nio與CpGODN/CNT對RAW264.7細胞基本無毒，但對U251癌細胞均顯示出具有一定的誘導癌細胞的壞死和凋亡的能力。而且與CpGODN/Lip和CpGODN/Nio相比，CpGODN/CNT對癌細胞的殺傷作用更大。這可能是與載體形狀有關，載體形狀對癌細胞的活性起著直接或著間接的作用，針狀的CpGODN/CNT復合體比表面積較大，更易快速被癌細胞攝取，可能會直接進入細胞，表現出良好的殺傷作用。西安交通大學網絡教育學院畢業論文4二甲基姜黃素脂質體和二甲基姜黃素類脂囊泡的制備與質量評價4.1二甲基姜黃素最大吸收波長測定精確稱取適量二甲基姜黃素，置50mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，采用紫外分光光度法在200–600nm波長間進行紫外最佳吸收波長掃描，結果見圖4-1。圖4-1二甲基姜黃素最佳吸收波長測定Fig4-1Absorptionfordimethylcurcumin實驗結果表明，二甲基姜黃素最大吸收波長為419nm，而空白囊泡與溶劑在419nm處均無吸收，說明此波長對于二甲基姜黃素的含量測定沒有干擾。4.2繪制二甲基姜黃素標準曲線采用紫外（UV）法測定二甲基姜黃素的含量。在50mL容量瓶中精確稱取二甲基姜黃素，用甲醇溶解并定容，得到濃度為0.15mg/mL的二甲基姜黃素貯備液。精密量取上述二甲基姜黃素貯備液適量，分別加甲醇稀釋成濃度為3.0、6.0、9.0、12.0和15.0μg/mL二甲基姜黃素工作液。以甲醇為空白對照，在波長為419nm處測定各濃度二甲基姜黃素工作液的吸光度A，并以A值對質量濃度C進行線性回歸測定，得回歸方程A=0.0142C+0.001，r=0.9994。結果表明二甲基姜黃素在3.0-15.0μg/mL范圍內與A線性關系良好，可用于二甲基姜黃素的測定。4.3包封率的測定方法精密量取二甲基姜黃素脂質體和二甲基姜黃素類脂囊泡2mL于透析袋，用無水乙醇破乳。置PBS溶液中透析24h（20r/min、37℃）。取經透析的二甲基姜黃素脂質體和二甲基姜黃素類脂囊泡溶液1mL，用PBS定容至10mL，搖勻，于419nm測定吸光度，通過公式計算包封率。包封率=（1-游離藥物的量/類脂囊泡懸液中藥物的總量）×1004.4二甲基姜黃素脂質體和二甲基姜黃素類脂囊泡的制備工藝4.4.1二甲基姜黃素脂質體的制備工藝用電子天平稱取適量大豆卵磷脂、膽固醇和二甲基姜黃素（摩爾比4:4:1），分別加入適量氯仿，攪拌使溶解。將溶液混合倒入梨形瓶中，旋轉蒸發儀旋干溶劑。真空干燥器中過夜，加入10mL5%葡萄糖溶液。超聲波細胞清洗機超聲5min，將溶液倒入15mL離心管。用超聲波細胞破碎儀超聲10min,即得二甲基姜黃素脂質體。4.4.2二甲基姜黃素類脂囊泡的制備工藝采用薄膜分散-超聲法制備。在磨口圓底燒瓶中加入適量二甲基姜黃素、非離子表面活性劑和膽固醇溶于三氯甲烷-無水乙醇（4:1），攪拌均勻后，用旋轉蒸發儀慢慢蒸去有機溶劑，至瓶底部形成均勻薄膜。加入PBS作為水合介質，在室溫水浴超聲儀中超聲形成混懸液，再在冰浴條件下超聲使之分散均勻，即得二甲基姜黃素類脂囊泡。4.5制備工藝優化4.5.1囊泡材料比例對包封率的影響4.5.1.1二甲基姜黃素脂質體本實驗改變0.1mol/LDOTAP與0.1mol/L膽固醇的比例（1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、2：1、3：1、4：1）（w/w,n=3），固定二者用量為0.4mL，以藥脂比為0.25:1制備二甲基姜黃素脂質體。考察不同囊材比例對二甲基姜黃素脂質體包封率的影響，結果如下表4-1及圖4-2所示。表4-1囊泡材料比例對二甲基姜黃素脂質體包封率的影響Tab4-1EffectofDOTAP/CholesterolontheEncapsulationEfficiencyofDimethylCurcuminLiposomesDOTAP:膽固醇EE%4:129.873:134.162:158.911:173.861:261.291:334.911:429.61圖4-2囊泡材料比例對二甲基姜黃素脂質體包封率的影響Fig4-2EffectofDOTAP/CholesterolontheEncapsulationEfficiencyofDimethylCurcuminLiposomes實驗結果表明：當膽固醇的量不變時，隨著DOTAP的增大，脂質體對二甲基姜黃素的包封能力下降。當DOTAP的量不變時，隨著膽固醇量的增大，脂質體對二甲基姜黃素的包封能力下降。當DOTAP與膽固醇比例為1:1時，包封率較高。說明DOTAP與膽固醇比例為1：1時，膽固醇剛好起到較好穩定雙層膜的作用。4.5.1.2二甲基姜黃素類脂囊泡固定0.1mol/L司盤-60與0.1mol/L膽固醇溶液總用量為0.4mL，改變類脂囊泡載體材料司盤-60與膽固醇比例4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3和1∶4（w/w,n=3），以藥脂比為0.25∶1制備二甲基姜黃素類脂囊泡，考察不同囊材比例對二甲基姜黃素類脂囊泡包封率的影響，結果如下表4-2及圖4-3所示。表4-2囊泡材料比例對二甲基姜黃素類脂囊泡包封率的影響Tab4-2EffectofSpan60/CholesterolontheEncapsulationEfficiencyofDimethylCurcuminNiosomesSpan60:膽固醇EE%4:125.573:132.862:160.371:167.131:255.241:326.491:420.62圖4-3囊泡材料比例對二甲基姜黃素類脂囊泡包封率的影響Fig4-3EffectofSpan60/CholesterolontheEncapsulationEfficiencyofDimethylCurcuminNiosomes實驗結果表明：當膽固醇的量不變時，隨著Span60量的增大，類脂囊泡對二甲基姜黃素的包封能力下降。當Span60的量不變時，隨著膽固醇量的增大，類脂囊泡對二甲基姜黃素的包封能力下降。當Span60與膽固醇比例為1:1時，包封率較高。說明Span60與膽固醇比例為1：1時，膽固醇剛好起到較好穩定雙層膜的作用。圖4-2和圖4-3的實驗結果表明：脂質體和類脂囊泡類似磷脂雙分子層，具有流動性，但是流動的膜穩定性不好且包封率較低。膽固醇是膜添加劑，可以調節類脂囊泡膜的流動性，從而可以增加膜的穩定性，同時還可以降低滲透性，提高包封率。當膽固醇的量不變時，隨著DOTAP和Span60量的增加，包封率越小。這可能是因為膽固醇減少，囊泡不穩定，導致包封率下降。4.5.2二甲基姜黃素用量對包封率的影響二甲基姜黃素用量直接影響脂質體和類脂囊泡的包封率。4.5.2.1對二甲基姜黃素脂質體包封率的影響當DOTAP與膽固醇質量比為1:1，探究二甲基姜黃素用量分別為0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg和0.5mg（n=3）時對二甲基姜黃素類脂囊泡的包封率的影響，結果見下表4-3及圖4-4所示。表4-3二甲基姜黃素用量對二甲基姜黃素脂質體包封率的影響Tab4-3EffectofDimethylCurcuminDosageontheEncapsulationEfficiencyofDimethylCurcuminLiposomesDimethylCurcuminDosage(mg)EE%0.152.370.264.250.3790.459.830.542.19圖4-4二甲基姜黃素用量對二甲基姜黃素脂質體包封率的影響Fig4-4EffectofDimethylCurcuminDosageontheEncapsulationEfficiencyofDimethylCurcuminLiposomes實驗結果表明：隨著二甲基姜黃素量的增多，藥物包封率不斷提高，當藥物增加到0.3mg時，包封率最高。4.5.2.2對二甲基姜黃素類脂囊泡包封率的影響當司盤-60與膽固醇質量比為1:1，探究二甲基姜黃素用量分別為0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg和0.5mg（n=3）時對二甲基姜黃素類脂囊泡的包封率的影響，結果見表4-4及圖4-5所示。表4-4二甲基姜黃素用量對二甲基姜黃素類脂囊泡包封率的影響Tab4-4EffectofDimethylCurcuminDosageontheEncapsulationEfficiencyofDimethylCurcuminLiposomesDimethylCurcuminDosage(mg)EE%0.161.440.281.110.367.130.461.360.549.23圖4-5二甲基姜黃素用量對二甲基姜黃素類脂囊泡包封率的影響Fig4-5EffectofDimethylCurcuminDosageontheEncapsulationEfficiencyofDimethylCurcuminNiosomes實驗結果表明：隨著二甲基姜黃素量的增多，藥物包封率不斷提高，當藥物增加到0.2mg時，包封率最高。圖4-4和圖4-5實驗結果表明：在脂質體和類脂囊泡沒有達到藥物飽和時，脂質體和類脂囊泡能夠包封藥物的量會隨著藥物總量的增多而增加。藥物飽和之后，隨著藥物量的增大，包封率下降。所以當脂質體包封藥物的量為0.3mg，類脂囊泡包封藥