甜茶素提取物對(duì)糖尿病大鼠降血糖作用的研究

甜茶是薔薇科的一種落葉和刺狀灌木。這是中國(guó)廣西特有的植物。廣西民間以甜茶葉代茶飲用,謂有清熱止渴、補(bǔ)腎、降血壓和治療糖尿病等功效,特別是糖尿病患者長(zhǎng)期飲用會(huì)收到良好效果。甜茶甜味的主要成分為甜茶素,又名懸鉤子甙(rubusoside)是斯替維醇和葡萄糖結(jié)合而成的二萜甙。有關(guān)甜茶素對(duì)糖代謝影響的前期研究表明:甜茶素能降低正常小鼠血糖水平,降糖率為18.47%;其對(duì)小鼠糖異生具有明顯的抑制作用,并具一定的降血脂和抗氧化作用。本研究在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究甜茶素提取物對(duì)STZ致高血糖大鼠血糖、血脂代謝的影響,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。1材料方法1.1材料表面1.1.1藥物甜茶(RubusSuavissimusS.Lee)浸膏,由廣西金秀縣香料有限公司惠贈(zèng)。1.1.2細(xì)雄性昆明種小鼠,體重為(35.40±2.79)g;雄性SD大鼠,體重(214.38±26.02)g(購(gòu)于上海醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)室,合格證號(hào):醫(yī)動(dòng)字第02-22-1)。1.1.3血清糖代謝酶法測(cè)定鏈脲佐菌素,(streptozotocin,STZ,Sigma公司產(chǎn)品),降糖靈片(鹽酸苯乙雙胍片,南通制藥總廠產(chǎn)品);血清葡萄糖、甘油三酯、膽固醇的酶法測(cè)定試劑盒和果糖胺測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海科欣生物技術(shù)研究所;SOD、NO合酶(NOS)、NO、乳酸(LD)、乳酸脫氫酶和MDA的酶法測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所;胰島素免疫放射試劑盒購(gòu)自上海生物制品研究所。1.1.4儀器721光柵分光光度計(jì)、WH-85型旋渦混合機(jī)、高速臺(tái)式離心機(jī)、RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、恒溫水浴鍋和臺(tái)式冰凍離心機(jī)。1.2方法1.2.1分離蛋白除蛋白(本實(shí)驗(yàn)室制備)取甜茶浸膏,加95%乙醇,靜止后離心,棄沉淀。上清液濃縮后,用servage液(氯仿∶正丁醇=4∶1)除蛋白。最后濃縮后置70℃恒溫箱烘干,即得甜茶素提取物。1.2.2小鼠的成型和測(cè)定血糖正常雄性昆明種小鼠禁食10h后,按190mg/kg劑量腹腔注射pH4.5的檸檬酸緩沖液配制的STZ溶液。96h后,尾靜脈采血,測(cè)定禁食6h后的空腹血糖值,取血糖值大于15.00mmol/L的小鼠為成型糖尿病小鼠。成型糖尿病小鼠隨機(jī)分為4組,每組8只,設(shè)為高、中、低劑量組和糖尿病對(duì)照組,組間血糖差異小于1.5mmol/L,同時(shí)設(shè)一組正常對(duì)照組。高、中和低劑量組分別按300、200、100mg/(kg·d)的劑量灌胃甜茶素提取物,連續(xù)灌胃2w,每周測(cè)一次血糖。根據(jù)降血糖效果及體重變化,選擇最有效劑量。1.2.3大鼠的成型和灌胃正常雄性SD大鼠禁食10h后,按60mg/kg劑量腹腔注射pH4.5的檸檬酸緩沖液配制的STZ溶液。96h后,尾靜脈采血,測(cè)定禁食6h后的空腹血糖值,取血糖值大于15.00mmol/L的大鼠為成型糖尿病大鼠。成型糖尿病大鼠隨機(jī)分為陽(yáng)性對(duì)照組、降糖靈治療組和甜茶素提取物組,組間血糖差異小于0.6mmol/L;同時(shí)設(shè)一組正常對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照組和正常組灌胃生理鹽水,降糖靈治療組按100mg/(kg·d)灌胃,甜茶素提取物組按300mg/(kg·d)劑量灌胃。連續(xù)3w,每周測(cè)血糖一次,3w后處死測(cè)血清和肝臟各指標(biāo)。1.2.4脂質(zhì)中d、ld和和乳酸脫氫酶活性的測(cè)定血清葡萄糖、甘油三酯、膽固醇、果糖胺、NO、NOS、SOD、LD、和乳酸脫氫酶(LDH)按試劑盒測(cè)定。胰島素測(cè)定由上海第一人民醫(yī)院完成。蒽酮硫酸法測(cè)肝糖原含量。所有數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后用xˉ±sxˉ±s表示,組間差異經(jīng)t檢驗(yàn)。2結(jié)果與分析2.1甜茶素提取物對(duì)糖小鼠降血糖效果及對(duì)體重變化的影響甜茶素提取物高、中、低即300、200、100mg/(kg·d)三種劑量對(duì)STZ致高血糖小鼠的降血糖效果及對(duì)小鼠體重變化的影響見(jiàn)表1和圖1。表1顯示:低劑量甜茶素提取物不能顯著地降血糖。高劑量能顯著降血糖,中劑量降血糖效果不如高劑量顯著,而且,體重減輕幅度比高劑量組大(圖1)。因此確定甜茶素提取物高劑量即300mg/(kg·d)為有效降血糖劑量。2.2甜茶素提取物的降血糖作用根據(jù)STZ致高血糖小鼠實(shí)驗(yàn),我們確定了甜茶素提取物的有效劑量。按此劑量,我們另行實(shí)驗(yàn),對(duì)STZ致SD大鼠高血糖的影響進(jìn)行了灌胃試驗(yàn),結(jié)果顯示(表2):灌胃1w、2w和3w后,甜茶素提取物組大鼠的血糖值都極顯著地低于陽(yáng)性對(duì)照組,降糖幅度分別為23.02%、19.74%和27.06%。提示灌胃300mg/(kg·d)的甜茶素提取物具有有效的降血糖效果。而降糖靈為一種對(duì)Ⅱ型糖尿病具有輔助治療效果的藥物,因此對(duì)STZ致高血糖大鼠的降血糖效果并不顯著。2.3降血脂作用成分血清甘油三酯和膽固醇是反映脂肪代謝的常用綜合性生化指標(biāo)。表3結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,甜茶素提取物能明顯地降低血漿膽固醇含量,對(duì)血漿甘油三酯也有一定的降低作用,提示甜茶素提取物對(duì)STZ致高血糖大鼠具有降血脂作用。并與降糖靈調(diào)節(jié)血脂代謝的作用無(wú)顯著差異。2.4不同描述熔劑的糖化血漿蛋白含量蛋白在高糖環(huán)境中會(huì)發(fā)生非酶促糖基化反應(yīng),糖化血漿蛋白的含量可反映3w的血糖水平;果糖胺是血漿中葡萄糖與蛋白質(zhì)形成的酮胺物,其含量可反映血漿中糖化血漿蛋白的水平。進(jìn)一步分析了受試大鼠的果糖胺表明(圖2),甜茶素組血漿果糖胺低于陽(yáng)性對(duì)照組,雖然與陽(yáng)性對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但仍可見(jiàn)甜茶素組血漿果糖胺水平存在下降的趨勢(shì),提示甜茶素提取物控制高血糖的穩(wěn)定性的最佳濃度尚待進(jìn)一步探尋。2.5甜茶素提取物對(duì)肝糖原的影響表4結(jié)果顯示:甜茶素提取物對(duì)STZ致高血糖大鼠血清LD含量和LDH的活性沒(méi)有明顯的影響,同時(shí)對(duì)肝糖原也無(wú)明顯的影響。提示甜茶素提取物并未通過(guò)加強(qiáng)葡萄糖的無(wú)氧代謝和增加肝糖原含量來(lái)降低血糖。降糖靈組大鼠肝糖原含量極顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組,這與降糖靈通過(guò)增加肝糖原含量來(lái)降血糖的機(jī)制正好相符合。2.6胰腺損傷性效應(yīng)近年研究證實(shí),細(xì)胞因子引起誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá),進(jìn)而過(guò)度生成NO,而NO在介導(dǎo)胰腺損壞性效應(yīng)中起重要作用。表5顯示,灌胃甜茶素3w后,血漿NO含量和NOS活性與陽(yáng)性對(duì)照組相比,均無(wú)顯著性差異,但有降低的趨勢(shì),因此,甜茶素提取物對(duì)NOS-NO體系是否具有改善作用還需進(jìn)一步研究。2.7甜茶素對(duì)肝臟sod活性的影響SOD對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著重要的作用,能清除超氧陰離子自由基,保護(hù)細(xì)胞免受損傷。表6顯示,與陽(yáng)性對(duì)照組相比,甜茶素組血漿SOD活性無(wú)顯著性差異,但有上升的趨勢(shì);肝臟SOD的活性與陽(yáng)性對(duì)照組相比顯著升高。提示甜茶素提取物灌胃3w后對(duì)STZ致高血糖大鼠清除自由基,降低糖尿病大鼠的氧化損傷具有一定的增強(qiáng)作用。2.8兩組甜茶素提取物含量比較如圖3所示,陽(yáng)性對(duì)照組胰島素含量為36.07±3.62(pmol/L),甜茶素提取物組含量為53.24±13.71(pmol/L),極顯著地高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.01)。該結(jié)果提示,甜茶素提取物降血糖機(jī)制之一可能是通過(guò)刺激胰島素的分泌來(lái)實(shí)現(xiàn)的。3甜茶素提取物對(duì)stz致高血壓大鼠血漿抗氧化能力的影響甜茶素提取物對(duì)糖代謝影響的前期研究表明:甜茶素能降低正常小鼠血糖水平,降糖率為18.47%;對(duì)小鼠糖異生具有明顯的抑制作用,并具一定的降血脂和抗氧化作用。在此基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步表明:甜茶素提取物對(duì)STZ致高血糖小鼠的有效降血糖劑量為300mg/(kg·d);在灌胃1w、2w和3w后甜茶素提取物對(duì)STZ致高血糖大鼠的降糖幅度分別為23.02%、19.74%和27.06%;3w后,雖然甜茶素提取物組血漿果糖胺水平與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但存在下降的趨勢(shì),提示甜茶素提取物控制高血糖的穩(wěn)定性需進(jìn)一步探討。此外,甜茶素提取物能明顯地降低血漿膽固醇含量,對(duì)血漿甘油三酯也有一定的降低作用,由此可見(jiàn),甜茶素提取物對(duì)STZ致高血糖大鼠血脂代謝具有一定的調(diào)節(jié)作用。與陽(yáng)性對(duì)照組相比,甜茶素組血漿SOD活性雖然不能明顯高于陽(yáng)性對(duì)照組,但有升高的趨勢(shì);肝臟SOD的活性與陽(yáng)性對(duì)照組相比顯著升高。甜茶素治療組血漿NO含量和NOS均無(wú)顯著性差異,但有降低的趨勢(shì),可能是因?yàn)樘鸩杷毓辔笗r(shí)間不夠。以上結(jié)果表明甜茶素對(duì)STZ致高血糖大鼠的抗氧化能力具有一定的增強(qiáng)作用,從而對(duì)糖尿病的進(jìn)一步發(fā)展起到防治的作用,甜茶素對(duì)NOS-NO體系是否具有改善作用還需進(jìn)一步研究。甜茶素提取物對(duì)STZ致高血糖大鼠LD含量和LDH的活性沒(méi)有明顯的影響,同時(shí)對(duì)肝糖原也無(wú)明顯的影響。說(shuō)明甜茶素并未通過(guò)加強(qiáng)葡萄糖的無(wú)氧代謝和增加肝糖原含量來(lái)降低血糖。而甜茶素提取物組胰島素的含量極顯著地高于陽(yáng)性對(duì)照組,說(shuō)明甜茶素提取物能夠刺激胰島素