乳酸桿菌發酵產乳酸的研究

0乳酸桿菌發酵糖溶酶系統蘑菇（硫酸細菌的縮寫，下一種）是可以使用可轉化的糖產生大量谷氨酸的細菌的總稱。乳酸菌具有復雜的營養要求,它的生長需要碳水化合物、氨基酸、肽類、脂肪酸酯類、鹽類、核酸衍生物和維生素類;乳酸菌包括球狀菌和桿狀菌。絕大部分乳酸球菌在pH值低于4.5就停止生長,而正常黃酒發酵醪pH值是在4.2以下發酵的。下面著重討論乳酸桿菌:乳酸桿菌發酵糖產生乳酸,或除乳酸以外,還有乙酸、甲酸、丙酸等其他有機酸,發酵主要產物為乳酸。乳酸桿菌在pH值3.3～3.5能生長、發酵,最低可達pH值2.0能存活;而且能耐酒精20%(V/V)以上,最高可達27%(V/V)以上。乳酸桿菌對氧的需求分為微需氧、兼性厭氧、極端厭氧三類。有些乳酸桿菌能分解淀粉、糊精,有些能利用月示、胨、多肽,或兩者都有之。黃酒發酵過程是邊糖化邊發酵,發酵者都有之。黃酒發酵過程是邊糖化過發酵,發酵醪營養豐富,整個發酵期間氨基酸含量在0.4mg/L以上,維生素及其他各種微量成分相當充足(如各種微生物的自溶物),非常適宜于乳酸桿菌生長、繁殖、發酵的需求。對黃酒發酵醪中各種微生物的檢測和分離發現:黃酒發酵過程是曲中各種酶系對原料的緩慢液化、糖化,酵母發酵糖產酒精和少量有機酸,同時,乳酸桿菌發酵糖產大量乳酸、少量乙酸和其他有機酸。乳酸桿菌大量存在于黃酒發酵醪中。而且,在后發酵后期,當醪液中各種酶系(曲帶入的),因長時間(數十天)作用,各種酶活力大大降低,極其微弱,而有的乳酸桿菌分解淀粉、糊精為糖,分解月示、胨、多肽為氨基酸,供給酵母發酵產酒精,繼續推動發酵作用的進行。乳酸桿菌發酵糖產乳酸,提高黃酒酸度,降低pH值;乳酸桿菌自溶分解為多肽、少量氨基酸和其他成分,促進黃酒的呈香呈味,增強黃酒口味的豐滿性和濃厚感。但是,黃酒發酵過程酸敗也是由于個別乳酸桿菌的大量繁殖,累積特殊乳桿菌素(Lactocin),又不同的酵母對不同的乳酸桿菌的凝集性反應不同,抑制酵母的生長、繁殖、發酵,促使酵母大量快速自溶,使醪液pH值迅速提高,又提供給其他細菌繁殖的大量營養和條件,加快其他細菌的繁殖速度,產生大量有機酸,從而使黃酒酸敗。即老技工常說:“在黃酒醪即將要酸敗前,其口味最鮮”,是酵母、細菌快速自溶分解產生大量氨基酸所致。本文以加飯酒為例(下同),闡述乳酸桿菌在黃酒發酵過程中的功與過,與大家共同探討。1乳酸桿菌發酵糖酯黃酒發酵過程是酵母與乳酸桿菌共同發酵的結果。酵母發酵糖產酒精和少量有機酸,并同化氨基酸、有機酸產高級醇和酯等風味物質;乳酸桿菌發酵糖產大量乳酸和少量其他有機酸,部分提供給酵母產酯。黃酒中大部分有機酸(乳酸)是在發酵過程主要由乳酸桿菌產生。分述如下:1.1機械化生產過程中酵母產酸量的變化黃酒的釀造按生產方式不同可分為傳統工藝生產黃酒和機械化生產黃酒,以下簡稱傳統工藝和機械化生產。在傳統工藝中,黃酒發酵起始酸度為1.80g/L(以乳酸計,下同)左右,發酵結束酸度為6.56g/L左右;發酵過程產酸量為4.76g/L。對發酵醪的酵母進行分離測定可知:筆者共分離出80余株酵母,并在米曲、飯糖化制得的糖液中進行測定,所有酵母的產酸量在0.90～2.00g/L之間,糖液中產酒精:7.0%(V/V)左右。而產酸(產乳酸)酵母如耐熱克魯維酵母(Klugvromycesthermotolerans)沒有檢測到。在機械化生產中,發酵起始酸度為1.80g/L左右,發酵結束酸度為6.56g/L左右。機械化生產中采用純種酵母進行發酵,因純種酵母繁殖能力和產酒精能力特別強;純種酵母的大量繁殖抑制其他酵母的生長繁殖。因此,機械化生產的發酵過程幾乎是由純凈的純種酵母和細菌(乳酸桿菌)發酵而成。筆者對公司所用的幾種純種酵母在米曲、飯糖化制得的糖液中進行測定,純種酵母的產酸量相當少,而且相當穩定,在1.00～1.90g/L之間,糖液中產酒精8.0%(V/V)以上。而且,在黃酒發酵過程,當酒精度大于7.0%(V/V)以后,酵母產酸極其微量。傳統工藝中,三耙后,醪液酒精度在7.0%(V/V)以上,此時,總酸度為4.57g/L以下。機械化生產中,經24h發酵后,醪液酒精度在7.5%(V/V)以上,甚至高達12.5%(V/V),此時,總酸度在3.81g/L以下。當醪液酒精度大于7%(V/V)以后升高的酸度,幾乎是由細菌(乳酸桿菌)產生的。醪液酒精度小于7%(V/V)以前生成的酸度,部分也是由細菌(乳酸桿菌)產生的。黃酒發酵過程是開放式、加曲發酵、曲、空氣中有許多霉菌主要是:根霉、毛霉、曲霉、犁頭霉,及少量青霉等霉菌加入發酵醪內。上述霉菌在pH值4.2以下和微氧狀態下,就受到嚴重抑制,生長相當緩慢;當酒精度達5.0%(V/V)時,上述霉菌就停止生長;當酒精度達10%(V/V)時,上述霉菌就死亡。霉菌在黃酒發酵醪內存活、生長時間很短,而且,霉菌的產酸量本身很小。因此,霉菌在黃酒發酵過程中產酸微量;上述霉菌中,只有根霉和毛霉能產一定數量的乳酸,在這么短時間內,根霉和毛霉產乳酸量很小。在起始酸度的抑制下,各種酵母所產總酸量大為減少。傳統工藝中,酵母總產酸量在2.00g/L以下,細菌(乳酸桿菌)產酸量在2.76g/L以上;機械化生產中,酵母總產酸量在1.90g/L以下,細菌(乳酸桿菌)產酸量在2.86g/L以上。1.2不同菌種對發酵過程的乳酸量黃酒中有機酸分析測定數據如表1、表2。從表1、2可知:黃酒中有機酸以乳酸為主,干型、半干型黃酒乳酸含量在4000mg/L以上,甜型黃酒的乳酸含量在3000mg/L以上,占總有機酸含量的57%以上。而且,黃酒中部分乳酸乙酯是由乳酸在酵母酯化作用下生成乳酸乙酯:CH3CHOHCOOH+C2H5OH→C2H3CHOHCOOC2H5+H2OCΗ3CΗΟΗCΟΟΗ+C2Η5ΟΗ→C2Η3CΗΟΗCΟΟC2Η5+Η2Ο即每100mg乳酸乙酯折合乳酸76.18mg。黃酒中乳酸乙酯含量為70～200mg/L,折合乳酸為53～152mg/L。因此,有一定數量的乳酸在酵母酯化作用下生成乳酸乙酯;并且,黃酒經陳釀后乳酸、乳酸乙酯的含量有所增加。總之,成品黃酒中總乳酸量在4400mg/L以上。而發酵起始酸度1.80g/L左右,由加入的漿水、酒母、曲、原料中有機酸組成,其中乳酸占60%左右,發酵起始乳酸量即為1080mg/L左右。在發酵全過程及成品黃酒制作過程沒有外加乳酸及其他酸類,因此,黃酒發酵過程產乳酸量在3300mg/L以上。而酵母在發酵過程中產乳酸的數量是很少的。各種酵母產乳酸的量如表3。(日本)原等對酵母菌在發酵過程中生產乳酸能力進行試驗:曲汁8Nx+葡萄糖10%(pH4.3),接入各種酵母菌量:106個/ml,25℃培養5天后,培養液中乳酸含量如表3;結果所有供試菌株都產乳酸,一般生成量在50～300mg/L。所有葡萄酒酵母發酵作用生成乳酸量較少,在130～400mg/L之間,釀酒酵母產乳酸量也相當少,在500mg/L以下,產酸量也相當少。在傳統工藝中對酵母菌的分離鑒定可知:60%左右為釀酒酵母,35%為葡萄酒、果酒酵母,5%左右為其他酵母如異常漢遜氏、假絲酵母等。機械化生產中所用的純種酵母為釀酒酵母。而在起始乳酸的抑制下,各種酵母所產的乳酸數量大為減少。傳統工藝中,酵母發酵產乳酸總量在500mg/L以下,因此,發酵過程產乳酸量3300mg/L以上的絕大部分乳酸2800mg/L以上,是由乳酸菌(乳酸桿菌)所產生的。機械化生產中,尤其明顯,因酵母種類少,發酵時間短,酒精上升快,酵母產乳酸量更加少。1.3不同酒精度對酵母菌生長的影響對傳統工藝的發酵過程,微生物的分離檢測,并根據菌落特征、性能進行檢定,黃酒發酵醪中乳酸桿菌數量不少,直接參與黃酒的發酵作用。在傳統工藝的發酵過程中,酵母與乳酸桿菌的數量列于表4。從表4可知:黃酒發酵醪中乳酸桿菌數量相當巨大,種類也相當多,筆者已檢測到十余種。在檢測過程中也發現有酒明串珠菌(Leuconostocoenos)存在,耐酸,在pH3.5以下能生長,耐酒精度高,高達26%(V/V)以上。而正常的加飯酒發酵過程,酵母與乳酸桿菌在pH值3.8以下(甚至更低pH3.3～3.5)進行發酵為佳,隨著酵母產酒精,使醪液酒精度不斷提高,酵母、細菌自溶增加,氨基酸、多肽等堿性物質大量增加,使得pH值逐步提高到4.0左右。而且,發酵期pH值越低,則醪液內乳酸桿菌數越少,發酵結束酸度越低。但由于乳酸桿菌在黃酒醪低pH值(pH3.8以下)能生長,并產生乳桿菌素(Lactocin),如植物乳桿菌(Lactobacillasplantarum)等,對酒明串珠菌有很大的抑制作用,使其不能生長,因此,酒明串珠菌在醪液中數量極少,對黃酒發酵幾乎無作用,但不能造成其死亡;對醋酸桿菌,芽孢桿菌和其他細菌也有很大的抑制作用。而且,醋酸桿菌的生長受到酒精度的抑制非常明顯,一般的醋酸桿菌在酒精度達到6%(V/V)時,基本不能生長;當酒精度在15%(V/V)以上,可致其死亡;而且,醋酸桿菌為好氧菌,在黃酒醪微氧狀態下,生長也受到嚴重抑制。芽孢桿菌等其他細菌在pH4.5以下,不能生長。因此,在黃酒發酵醪中,醋酸桿菌、芽孢桿菌等其他細菌沒有檢測到。但黃酒醪內酒明串珠菌、芽孢桿菌(如巨大芽孢桿菌)的芽孢始終存在,只是數量極其稀少,芽孢不能萌發,不起作用。機械化生產中,因發酵罐罐體高大,無法攪勻,而沒有檢測。1.4不同品種酒中酵母粉產酸量的比較日本清酒中有機酸含量如表5。日本清酒醪發酵結束酸度為2.745g/L以下,其中17%是從曲及酒母中帶來的,從酒母來的有機酸以乳酸為主,其余總酸量2.278g/L的大部分是酵母在發酵過程中產生的。與筆者在米曲、飯糖化制得的糖液中所測定的酵母產總酸量相吻合,酵母產酸量非常少,乳酸的生成量更少,在500mg/L以下。而黃酒發酵過程產酸量為4.76g/L左右,是日本清酒發酵過程產酸量的2.09倍。把表1、表2與表5比較可知,黃酒中乳酸含量是日本清酒的7.0倍以上;黃酒發酵過程產乳酸的量是日本清酒的5.0倍以上,相差非常之巨大。因此,黃酒的開放式發酵與日本清酒發酵的根本區別在于:黃酒是以酵母、乳酸桿菌共同參與發酵,而日本清酒是以單一酵母發酵的。1.5其他細菌投料時加入乳酸桿菌1.5.1漿水在浸米過程中,隨著浸米時間增加,漿水中乳酸球菌逐漸減少,乳酸桿菌不斷增加,到浸米末期,漿水中以乳酸桿菌為主,而乳酸球菌等其他細菌數量很少。投料時加入漿水,同時接入了大量的乳酸桿菌。1.5.2曲曲中存在不少乳酸桿菌,投料加入曲,同時接入乳酸桿菌。1.5.3酒母淋飯酒母中乳酸桿菌的數量為(1.0～1.5)×106個/mL,酵母數:5.0～10.0億個/mL,投料時加入酒母,同時接入乳酸桿菌。1.5.4發酵器具和空氣中,存在一定數量的乳酸桿菌,在操作中也帶入一定數量的乳酸桿菌。1.6最佳發酵原料是乳酸桿菌乳酸桿菌的種在自然界中分布廣泛,很少有致病菌,在其發酵食品及產物中不形成任何毒素或毒性產物,而且乳酸桿菌是人、動物胃和小腸中主要的正常菌和優勢菌群。是世界公認的安全菌。總之,乳酸桿菌不只是引起黃酒酸敗的有害菌,而是直接參與黃酒發酵的全過程,產生大量乳酸,即黃酒中的大部分有機酸(乳酸)是在發酵過程主要由乳酸桿菌產生。而且,黃酒必須有一定量的有機酸(乳酸),即“無酸不成味”;若黃酒達不到一定量的有機酸(乳酸),陳釀三年或五年后,則酯香不足,口味欠缺;也就是黃酒發酵過程必須有乳酸桿菌參與。2影響酒精發酵的因素乳酸桿菌共同參與黃酒發酵,它的作用非常大。2.1乳酸桿菌能耐低pH值(pH3.3～3.5)生長、繁殖,發酵糖產大量乳酸,在黃酒發酵過程中,降低和維持低pH值,使黃酒發酵順利進行,并形成黃酒的有效成份—乳酸。2.2黃酒為開放式發酵,而乳酸桿菌的大量生長,產生并累積乳桿菌素,以及低pH值,抑制其他細菌的生長、繁殖,而對酵母無抑制作用。同時,促使酵母的耐酒精力和耐酸能力的提高;或者是酵母為了適應發酵醪液的環境,酵母菌自身進行一定的特定的染色體適度重排,有利于酵母菌適應環境;或者是酵母菌種本身能夠適應在低pH值或有乳桿菌素等黃酒發酵醪液的環境。確保黃酒發酵過程在粗放條件下也不酸敗。2.3有些乳酸桿菌(如:Lactobacillus)自溶產生活性成分:酸性多糖磷壁(酸)質(Teichoicacid),能促進飯的溶解、液化,提高原料利用率。2.4乳酸桿菌發酵糖主要產乳酸以外,還產少量的乙酸、甲酸、丙酸、二氧化碳及其他微量醇、醛、酸等,乳酸桿菌自溶分解出多肽、氨基酸及其他大分子物質,促進黃酒的呈香、呈味,大大提高黃酒口味的豐滿性和濃厚感,豐富黃酒成分的多樣性,促進黃酒香氣物質的增加,也是形成黃酒風味的豐富性與復雜性原因之一。2.5不同的乳酸桿菌在不同條件下,產生乳酸與乙酸的比例不同,而且產生D-乳酸、L-乳酸、DL-乳酸的數量也不同,豐富黃酒中的乳酸品種。2.6有的乳酸桿菌能分解淀粉、糊精為糖,或能分解月示、胨、多肽為氨基酸,或兩者皆有之,在一定程度上推動著黃酒發酵進程。2.7黃酒主發酵期,主要是高溫乳酸桿菌生長、繁殖、發酵,而后發酵期,主要是低溫乳酸桿菌的生長、繁殖、發酵。發酵溫度的降低過程,部分高溫乳酸桿菌死亡、自溶,給酵母和低溫乳酸桿菌發酵提供極豐富的營養。即乳酸桿菌與酵母協同作用,互相促進,互相制約,共同推動黃酒發酵,是產生很高酒精度的原因之一。3飲料發酵期各時間生長規律黃酒的酸敗主要也是由乳酸桿菌引起的,乳酸桿菌引起黃酒酸敗,主要有以下兩個方面。3.1由漿水、曲、酒母帶入的乳酸桿菌數量太多,或發酵工藝條件沒有符合要求,使得個別對酵母有拮抗作用的乳酸菌大量繁殖,產生并累積特殊乳桿菌素,抑制酵母生長、繁殖,促使酵母快速自溶,使醪液pH值升高,又提供其他細菌繁殖、生長條件,致使乳酸桿菌與其他細菌大量繁殖產酸,而酸敗。3.2后發酵末期,醪液酒精度已很高,18%(V/V)以上,酵母的活動能力受到嚴重抑制,而乳酸桿菌耐酒精度比酵母要高得多。此時,若不及時榨酒,則醪液酒精度上升緩慢,而酸度上升較快。同樣道理,后發酵后期,若品溫升高,則醪液酸度上升也較快。4中國白酒中乳酸桿菌的接種目前,我們要正確認識乳酸桿菌