非水相生物催化工業(yè)研究進(jìn)展

生物催化工業(yè)生物催化劑具有高選擇性、反應(yīng)條件好、環(huán)境相同的特點(diǎn)。不僅排除了化學(xué)合作過程中長(zhǎng)期保護(hù)和鑒定的嚴(yán)格過程，而且可以提高產(chǎn)品和廢水的比例。它被認(rèn)為是一個(gè)重要的生物福利產(chǎn)品。生物催化劑的廣泛應(yīng)用可以被認(rèn)為是化學(xué)和生物學(xué)的第一學(xué)科。如圖1所示，根據(jù)化學(xué)多樣性和生物復(fù)雜性的不同，有許多不同類型的生物過程、生物過程和生物合成。一般來(lái)說(shuō)，生物催化劑行業(yè)可以包括酶分解、生物轉(zhuǎn)化、生物氧化，甚至前體發(fā)酵等。其共同特點(diǎn)是以有機(jī)物質(zhì)為基礎(chǔ)，通過生物催化劑（酶、微生物和動(dòng)植物細(xì)胞）合成或分解有機(jī)物。生物催化劑的應(yīng)用潛力進(jìn)一步擴(kuò)大，如手性合成和分離、藥物處置生產(chǎn)、食品添加劑、生物修復(fù)、石油開采等。然而，生物催化劑在溶液中的濃度較低，土壤侵蝕的利用率和反應(yīng)率較低。高脂質(zhì)底物和產(chǎn)物往往會(huì)導(dǎo)致生物催化劑的抑制和行為。多酶激發(fā)的反應(yīng)反應(yīng)往往會(huì)進(jìn)一步分解產(chǎn)物，降低產(chǎn)物的接收率和濃度，而非水相生物催化劑的應(yīng)用是可以進(jìn)一步發(fā)展的。從力學(xué)的角度來(lái)看，本文從一定角度探討了非水相生物催化劑深度和高度過程整合的特點(diǎn)。1非水相生物催化技術(shù)生物催化工業(yè)的一般流程如圖2所示,傳統(tǒng)地分為以發(fā)現(xiàn)和改造生物催化劑為主要目的的上游過程、生物催化的反應(yīng)過程和以分離和純化為主要目的的下游過程.隨著工程技術(shù)的高度集成,尤其是非水相生物催化過程,這種分類概念已變得越來(lái)越模糊.如非水相生物催化技術(shù)主要研究生物催化反應(yīng)而一些酶在非水溶劑中的催化性質(zhì)可能得到改善,原位產(chǎn)物去除技術(shù)是下游分離單元操作與生物催化反應(yīng)的有機(jī)結(jié)合,兩相分配生物反應(yīng)器是非水相生物催化技術(shù)和原位產(chǎn)物去除技術(shù)的高度集成.1.1生物催化劑工程生物催化劑包括酶和細(xì)胞.生物催化具有反應(yīng)條件溫和的優(yōu)點(diǎn),但同時(shí)也是生物催化的缺點(diǎn)之一.一些重要的有機(jī)化合物是水不穩(wěn)定/不溶解的,只有在有機(jī)溶劑中,反應(yīng)才能增加其溶解度而加快反應(yīng)速度或降低其水解.一般認(rèn)為酶只有在水溶液中才有活性,通常的酶催化反應(yīng)都在水溶液中進(jìn)行.19世紀(jì)末出現(xiàn)了非水相酶催化反應(yīng)技術(shù),這一技術(shù)需要解決的關(guān)鍵問題是生物催化劑在非水溶劑中的活性和穩(wěn)定性.當(dāng)酶分子與非水溶劑接觸時(shí),將可能導(dǎo)致其構(gòu)型改變而失活.微生物細(xì)胞的生理狀態(tài)更是細(xì)胞中功能基因和外部環(huán)境相互作用的結(jié)果.生物催化劑與環(huán)境的關(guān)系如圖3所示,常用的提高生物催化劑在非水溶劑中穩(wěn)定性和活性的方法有以生物學(xué)為基礎(chǔ)的生物催化劑工程和以工程學(xué)為基礎(chǔ)的介質(zhì)工程.生物催化劑工程主要通過生物和物理的手段,發(fā)現(xiàn)新的生物催化劑和改造已有的生物催化劑以提高其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性.如理性設(shè)計(jì)、定向優(yōu)化等蛋白質(zhì)工程手段提高生物催化劑在非水溶劑中的活性和穩(wěn)定性;采用固定化細(xì)胞或酶的生物催化劑固定化技術(shù);有些微生物能以油等有機(jī)化合物為惟一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖,表明微生物分泌的有機(jī)物降解酶在非水環(huán)境中具有穩(wěn)定性.基于這一思路,在極端環(huán)境下篩選到了在非水溶劑中具有天然穩(wěn)定性和活性的特殊生物催化劑.介質(zhì)工程就是在水溶液中加入具有生物相容性而本身不降解的溶劑組分以創(chuàng)造出生物催化劑具有活性和穩(wěn)定性的人工環(huán)境,達(dá)到增加底物溶解度、提高生物催化劑的催化效率的目的.起初人們?yōu)榱嗽黾佑袡C(jī)底物的溶解度,在水溶液中加入少量的水溶性有機(jī)溶劑.其他常用的方法還有賦形劑,添加鹽、酸、堿等非緩沖液,添加冠醚、環(huán)糊精、表面活性劑等.水不溶性有機(jī)溶劑中的非水相催化,因生物相容性得到改善,開創(chuàng)了非水相催化的新紀(jì)元.非水相生物催化不但增加了有機(jī)底物的溶解度,排除產(chǎn)物/底物的水解,而且水活度是非水相催化的重要參數(shù),通過調(diào)節(jié)水活度能改變生物催化劑的選擇性、提高酶在高溫下的活性和穩(wěn)定性等.隨著有機(jī)溶劑非水相生物催化的出現(xiàn),其他非水相生物催化方法也得到發(fā)展,如雙水相系統(tǒng)、反膠束系統(tǒng)、膠束系統(tǒng)、超臨界系統(tǒng)、離子液體等方法也相繼出現(xiàn).非水相酶催化發(fā)展的同時(shí),非水相細(xì)胞生物催化也快速發(fā)展.1.2萃取生物催化的原理原位產(chǎn)物去除是反應(yīng)過程和分離單元適當(dāng)組合使產(chǎn)物和生物催化劑快速分離,達(dá)到解除產(chǎn)物抑制生物催化劑活性和排除產(chǎn)物被生物催化劑進(jìn)一步降解的目的.如表1所示,根據(jù)產(chǎn)物性質(zhì)的不同,原位產(chǎn)物去除技術(shù)組合的下游單元各異.原位產(chǎn)物去除可分為外部去除和內(nèi)部去除兩種方式.其中內(nèi)部原位產(chǎn)物去除方式的萃取生物催化(常稱兩相分配生物反應(yīng)器),因?qū)崿F(xiàn)了非水相生物催化和原位產(chǎn)物去除技術(shù)高度集成而吸引了人們巨大興趣.大多數(shù)情況下,兩相分配生物反應(yīng)器是指有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng),生物催化反應(yīng)在水溶液相或兩相界面進(jìn)行,而有機(jī)溶劑作為輔助相.輔助相的作用在于充當(dāng)?shù)孜锏膬?chǔ)存庫(kù),增加了底物的溶解度,通過緩控釋作用排除了底物對(duì)生物催化劑的抑制作用;同時(shí)輔助相充當(dāng)產(chǎn)物的萃取劑,解除了產(chǎn)物對(duì)生物催化劑的抑制,排除了產(chǎn)物被生物催化劑進(jìn)一步降解.除有機(jī)溶劑外,輔助相也可以是非有機(jī)溶劑,如多聚物形成的雙水相系統(tǒng)、表面活性劑在有機(jī)溶劑中形成的反膠束系統(tǒng)、超臨界系統(tǒng)以及最近開發(fā)的非離子表面活性劑溶液形成的濁點(diǎn)系統(tǒng)等.利用兩相分配生物反應(yīng)器技術(shù)研究甾體的微生物轉(zhuǎn)化、β-內(nèi)酰胺類抗生素的酶法水解和合成等經(jīng)典生物催化反應(yīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn).但如圖4所示,兩相分配生物反應(yīng)器的工業(yè)應(yīng)用還受到生物技術(shù)、過程技術(shù)、法律和法規(guī)、經(jīng)濟(jì)等因素的制約.1.3濁點(diǎn)系統(tǒng)的建立甾體的微生物轉(zhuǎn)化是生物轉(zhuǎn)化的重要里程碑之一,甾醇的邊鏈切除不但解決了甾體醫(yī)藥工業(yè)的原料來(lái)源問題,而且是一條有效的綠色化工路線.利用Mycobacteriumsp.進(jìn)行膽固醇的邊鏈切除生產(chǎn)雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(androsta-1,4-diene-3,17-dione,ADD)和雄甾-4-烯-3,17-二酮(androst-4-ene-3,17-dione,4-AD)的途徑如圖5所示.非離子表面活性劑溶液在溫度高于其濁點(diǎn)或有一定添加物存在的條件下,會(huì)自動(dòng)形成表面活性劑濃度很小的稀相和富含表面活性劑的凝聚層相.這一溶液系統(tǒng)常稱為濁點(diǎn)系統(tǒng).作者在以膠體科學(xué)理論為基礎(chǔ)研究了濁點(diǎn)系統(tǒng)兩相分配技術(shù)后,建立了濁點(diǎn)兩相分配生物反應(yīng)器技術(shù).微生物轉(zhuǎn)化甾醇邊鏈切除的結(jié)果如表2所示,濁點(diǎn)兩相分配生物反應(yīng)器中生物轉(zhuǎn)化效果明顯優(yōu)于其他兩相分配生物反應(yīng)器.濁點(diǎn)系統(tǒng)的顯微結(jié)構(gòu)如圖6所示,濁點(diǎn)系統(tǒng)中凝聚層相形成油包水型微觀乳濁液,其中的水泡相當(dāng)于一個(gè)微反應(yīng)器,保護(hù)了細(xì)胞免受表面活性劑的毒害作用,使細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中具有穩(wěn)定性.底物和產(chǎn)物分配于濁點(diǎn)系統(tǒng)的凝聚層相,凝聚層相相當(dāng)于底物的儲(chǔ)存庫(kù)和產(chǎn)物的萃取劑,實(shí)現(xiàn)了底物的控制釋放和產(chǎn)物的萃取轉(zhuǎn)化,解除了底物、產(chǎn)物對(duì)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的抑制.在濁點(diǎn)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了萃取生物轉(zhuǎn)化,調(diào)節(jié)表面活性劑濃度可保護(hù)產(chǎn)物的進(jìn)一步降解.高度乳化還加快了物質(zhì)傳遞,以界面科學(xué)理論為基礎(chǔ)發(fā)展新型分離技術(shù)將對(duì)生物催化的過程集成產(chǎn)生重要影響.2深度生物氧化的非水相處理2.1生物大分子溶液的分配規(guī)律生物催化劑主要有酶和細(xì)胞.非水相生物催化主要限制因素為酶在非水溶劑中的穩(wěn)定性和活性以及非水溶劑對(duì)細(xì)胞的毒性.第一個(gè)問題首先涉及到生物催化劑在非水溶劑中的分配.生物催化劑中酶不但是生物大分子,而且生物物質(zhì)的電性受溶液的pH值影響,在生物催化條件下常帶電荷.細(xì)胞的大小常在膠體粒徑范圍,且其作為生物膠體的性質(zhì)常受細(xì)胞生理性質(zhì)的影響.有關(guān)溶質(zhì)的分配理論大多建立在不帶電的小分子基礎(chǔ)上,生物大分子溶液的分配理論還很不完善.雙水相系統(tǒng)因主要用于生物大分子物質(zhì)的分離,其分配規(guī)律研究得最多;濁點(diǎn)系統(tǒng)中的分配規(guī)律也有人開始研究,但還無(wú)法準(zhǔn)確預(yù)測(cè).這一問題的解決必須依賴于復(fù)雜溶液熱力學(xué)理論的突破.非水溶劑中酶分子的結(jié)構(gòu)將直接影響酶的活性和穩(wěn)定性.關(guān)鍵問題是蛋白質(zhì)分子能否在非水溶劑中正確地折疊和有機(jī)溶劑如何影響蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)并進(jìn)一步影響其功能.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系一直是蛋白質(zhì)工程研究的重點(diǎn),但主要集中在生理?xiàng)l件下結(jié)構(gòu)和功能的研究.X射線晶體結(jié)構(gòu)表明,有的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與溶劑無(wú)關(guān),而Fourier-transformationinfrared得到的結(jié)果完全不同.有關(guān)非水溶劑中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)及結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系目前知道的信息還很少.這一問題的解決有賴于蛋白質(zhì)工程研究的進(jìn)展以及基因工程手段設(shè)計(jì)出結(jié)構(gòu)更加合理的功能蛋白.非水溶劑中溶劑對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性的機(jī)制雖還不很清楚,但普遍接受的觀點(diǎn)是:非水溶劑進(jìn)入細(xì)胞膜而干擾膜的正常功能,如導(dǎo)致膜結(jié)合酶的失活/變性,破壞傳遞機(jī)制甚至溶解細(xì)胞膜.主要包括溶劑產(chǎn)生的分子毒性和分相后產(chǎn)生的相毒性.微生物細(xì)胞對(duì)溶劑可產(chǎn)生適應(yīng)性,適應(yīng)性是微生物為應(yīng)付外界環(huán)境條件而產(chǎn)生的組成和功能的改變,如細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)改變、產(chǎn)生新的酶體系而改變底物的代謝途經(jīng)等.2.2乳化粒子粒徑分布的影響非水相生物催化和原位產(chǎn)物去除過程涉及到復(fù)雜溶液中多組分物質(zhì)傳遞和生物反應(yīng).其中一個(gè)關(guān)鍵問題是確定在什么條件下,過程是生物反應(yīng)控制而不是傳遞控制.非水相生物催化常因細(xì)胞生長(zhǎng)的需要而采用復(fù)雜的介質(zhì)、細(xì)胞生長(zhǎng)而產(chǎn)生表面活性物質(zhì)、供氧而產(chǎn)生大量氣泡等而導(dǎo)致高度乳化.乳化產(chǎn)生的大量相界面有利于生物催化反應(yīng)的物質(zhì)傳遞,高度乳化產(chǎn)生的微乳環(huán)境為穩(wěn)定生物催化劑提供了有利條件.但有關(guān)高度乳化生物反應(yīng)器中流體動(dòng)力學(xué)和相行為的信息還不多.乳化粒子的粒徑分布是關(guān)系到傳質(zhì)速率中比表面積的重要參數(shù).在化工流體中,這一重要參數(shù)可由攪拌功率確定,但在生物反應(yīng)器中,表面活性物質(zhì)的數(shù)量是重要的影響因素.表面活性物質(zhì)隨生物反應(yīng)的進(jìn)行而產(chǎn)生,存在時(shí)間尺度的差異;高度乳化使流體內(nèi)部存在空間尺度上的差異.當(dāng)今非水相生物催化過程的動(dòng)態(tài)模擬普遍套用以宏觀牛頓流體傳遞理論為基礎(chǔ)的化工動(dòng)態(tài)模擬方法,其理論上存在的先天性不足必然在實(shí)際過程中產(chǎn)生一定的誤導(dǎo)作用,動(dòng)態(tài)模擬必須根據(jù)生物反應(yīng)的特征建立在多空間、多時(shí)間的微尺度水平.如圖7所示,生物催化中尤其是生物轉(zhuǎn)化、生物氧化、前體發(fā)酵等過程涉及到活細(xì)胞的維持、生長(zhǎng)等能量耗散,是一個(gè)非平衡熱力學(xué)過程.生物催化反應(yīng)不同于建立在平衡熱力學(xué)基礎(chǔ)之上的化學(xué)反應(yīng),只有在生物反應(yīng)過程不是控制因素時(shí),采用非結(jié)構(gòu)模型套用化工過程理論的數(shù)學(xué)模擬對(duì)生物反應(yīng)過程放大才有指導(dǎo)作用.張嗣良等提出了生物反應(yīng)三水平的工程學(xué)觀點(diǎn),即基因工程水平的遺傳特性、細(xì)胞水平的代謝特性和工程水平的傳遞特性,這與圖3所示的觀點(diǎn)基本一致.張嗣良強(qiáng)調(diào)以細(xì)胞代謝流分析和控制為核心,表明生物反應(yīng)的動(dòng)態(tài)模擬必須建立以細(xì)胞生理特性為基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)模型才能真實(shí)地反映過程的動(dòng)態(tài)特征.對(duì)于高度乳化的非水相生物催化過程,只有在微尺度水平才能研究細(xì)胞等生物催化劑的結(jié)構(gòu)、生理特性,其傳遞理論必須建立在微尺度水平才能反映過程的實(shí)際情況.非水相生物催化過程的動(dòng)態(tài)模擬必須建立在多空間、多時(shí)間的微尺度水平基礎(chǔ)上的結(jié)構(gòu)模型才能反映過程的動(dòng)態(tài)特性.3非水相生物催化工業(yè)的學(xué)科交叉和新技術(shù)生物催化工業(yè)的產(chǎn)生是化學(xué)和生物學(xué)科交叉的結(jié)果,以不溶性有機(jī)物為底物、產(chǎn)物進(jìn)一步降解的特點(diǎn)決定了過程高度集成和非水相生物催化是生物催化疏水性底物的必然發(fā)展趨勢(shì),其發(fā)展必將是更深層次的學(xué)科交叉和新技術(shù)的運(yùn)用.如圖