不同魚類肌肉小清蛋白的分析

魚類是最易引起過敏的食物之一。流行病學調查顯示,在美國,約有0.4%的人因食用魚類產生過敏反應。我國楊華等對370例慢性蕁麻疹患者的檢測發現,食物性變應原陽性率最高的是淡水魚(61.35%),其次為海蟹(55.68%)、海魚(37.84%)。自1971年Elsayed等從鱈魚(Gaduscallarias)中發現了過敏原M,后經鑒定為小清蛋白(Parvalbumin,PV)以來,國外在魚類過敏方面做了較為深入的研究工作。隨后的免疫學及分子生物學研究發現,PV廣泛存在于各種魚類中。PV的分子量為10～14kD,等電點為3.9～5.5,主要存在于魚肉的肌漿蛋白部分,是魚類的主要過敏原。根據蛋白質一級結構的序列分析,小清蛋白可進一步分為α型和β型。α-小清蛋白的pI大于或等于5.0,而β-小清蛋白由于含有更多的酸性氨基酸,其pI在4.5以下,不同魚類的PV之間存在著免疫交叉反應性,表明PV具有很高的氨基酸同源性。相對而言,國內在水產品過敏原的研究起步較晚,目前的研究主要集中在蝦、蟹等甲殼類動物,對于魚類過敏的研究仍然很少。我國是魚類特別是淡水魚生產和消費大國,因此在我國開展魚類過敏的研究具有重要的理論價值和實際意義。本研究以國內常見的7種淡水魚和5種海水魚為研究對象,提取其主要過敏原,并通過Tricine-SDS、Westernblot以及ELISA等方法分析小清蛋白的存在情況,初步建立魚類過敏原的檢測方法。1蛋白、免疫和免疫藥物的制備鮮活鰻魚(Anguillaanguilla)、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)、鯽魚(Carassiusauratus)、羅非魚(Oreochromismossambicus)、鯉魚(Cyprinuscarpio)、鱖魚(Sinipercachuatsi)7種淡水魚,鮮活鲆魚(Paralichthysolivaceus)、鯛魚(Sparuslatus)、鱸魚(Lateolabraxjaponicus)及新鮮鯖魚(Decapterusmaruadsi)、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)5種海水魚均購自廈門集美農貿市場。即殺后,分別取白色肉和紅色肉立即實驗或保存于-70℃。DEAE-Sepharose、SephacrylS-200和硝酸纖維素膜從Amersham公司購得;蛋白分子量標準為Fermentas公司產品;抗蛙小清蛋白單克隆抗體(PARV-19)購自Sigma公司;HRP標記的兔抗小鼠IgG抗體從DAKO公司購得;二氨基聯苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)和3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine,TMB)購自Pierce公司;其他試劑均為國產分析純。小清蛋白熱提取物的制備參照Kobayashi等的方案并略做修改,即分別取每一種魚2克的白色肉和紅色肉,加入冰冷的3倍體積20mmol/LTris-HCl(pH7.5)。組織搗碎后,8000r/min,4℃,離心15分鐘。所得上清于沸水浴中加熱10分鐘,15000r/min離心20分鐘后取上清即得小清蛋白熱提取物。鰱魚小清蛋白的純化方案參照Wang等方法進行。即將20克鰱魚白色肉于4倍體積20mmol/LTris-HCl(pH7.5)緩沖液中組織搗碎后,離心,得到的上清經60%～100%硫酸銨鹽析,離心后,將沉淀溶于緩沖液中,透析,經DEAE-Sepharose離子交換柱、SephacrylS-200凝膠過濾等柱層析純化得到鰱魚小清蛋白。以牛血清白蛋白為標準蛋白,利用Bio-Rad蛋白檢測試劑盒測定蛋白的濃度。Tricine-SDS參照文獻進行,其中濃縮膠聚丙烯酰胺濃度為4%,夾層膠濃度為10%,致密膠濃度為16.5%。電泳結束后,以考馬斯亮藍染色。Westernblot參照Towbin法進行,即電泳后,轉膜,以5%脫脂奶封閉后,采用抗蛙小清蛋白單克隆抗體為一抗,HRP標記的兔抗小鼠IgG為二抗進行免疫印跡實驗,以二氨基聯苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)顯色。ELISA的操作參照Kobayashi等的方法略作修改。將各種魚類肌肉熱粗提物的蛋白濃度調整至0.2～1.0μg/ml,于96孔板4℃包被過夜;依次經5%脫脂奶封閉,一抗(抗蛙小清蛋白單克隆抗體,1∶5000稀釋)以及二抗(HRP標記的兔抗小鼠IgG1∶2000稀釋)反應后,以TMB顯色,然后用2mol/LH2SO4終止,最后通過酶標儀測定A450nm值。將分別稀釋至濃度為0.01、0.03、0.1、0.3、1、3μg/ml的純化鰱魚小清蛋白于96孔板4℃包被過夜,其它操作同上,制備標準曲線,根據標準曲線計算不同魚類白色肉和紅色肉中小清蛋白的含量。2結果2.1不同淡水中小清蛋白的檢測結果由于小清蛋白具有較高的熱穩定性,而大部分蛋白經過加熱后會發生變性沉淀,因此,本研究將魚類肌漿蛋白抽提后進行短暫的加熱處理,從而獲得含有較高純度小清蛋白的提取物,有效去除肌漿抽提物中其它蛋白、脂肪等物質對后續檢測的干擾。本研究采用Tricine-SDS和Westernblot分析不同魚類白色肉和紅色肉的熱提取物。圖1A顯示7種淡水魚肌漿蛋白熱提取物的Tricine-SDS電泳結果。如圖所示,經過100℃,15分鐘加熱后,除了鯽魚和鯉魚外,在其他5種淡水魚的白色肉肌漿蛋白中都可以觀察到至少2條蛋白條帶,分子量為10～14kD,根據其分子量初步推斷為小清蛋白。在紅色肉肌漿蛋白中,相應的條帶濃度明顯較低。除了分子量為10～14kD的蛋白條帶外,在鰻魚、鰱魚、草魚和鱖魚的紅色肉中還可以觀察到32kD左右的蛋白條帶,這與Gajewski等的報道一致。在羅非魚和鱖魚紅色肉中,還存在分子量約16kD的條帶,表明在不同的魚類中,肌漿蛋白的電泳圖譜具有一定的差異性。圖1B的Westernblot結果表明,抗蛙小清蛋白單克隆抗體與7種淡水魚的小清蛋白均能產生免疫交叉反應,在7種淡水魚的白色肉和紅色肉中均存在小清蛋白。由于在每種魚中至少觀察到2條分子量不同的反應條帶,推測在每種淡水魚中至少存在2種小清蛋白異構體。Westernblot結果顯示,除了羅非魚,其他6種淡水魚小清蛋白的相對含量與Tricine-SDS結果基本一致,表明該抗體可用于檢測這6種淡水魚中小清蛋白的存在情況。而Tricine-SDS顯示在羅非魚的白色肉中可能存在2種小清蛋白,但其中一種形式未能與抗蛙小清蛋白抗體反應,因此,需進一步研究確認該蛋白是否為小清蛋白或是其在抗體識別的表位區域具有特殊性。從Westernblot結果還可以看出,不同魚類中小清蛋白的種類及含量存在一定差異。2.2種海水魚小清蛋白的檢測圖2為5種海水魚肌肉熱提取物的Tricine-SDS和Westernblot分析結果。其中,底棲魚類鲆魚由于幾乎不含紅色肉,因此,只對其白色肉進行分析。在這5種海水魚中,鲆魚白色肉、鯖魚白色肉和紅色肉分別只檢測出一種小清蛋白。鯛魚、鱸魚的白色肉和紅色肉以及大黃魚的白色肉分別檢測到2種小清蛋白,大黃魚紅色肉可能由于小清蛋白的含量太低,Tricine-SDS和Westernblot都未能檢測到。這5種海水魚小清蛋白相對含量的Westernblot分析結果與Tricine-SDS結果基本一致,表明該抗體也適用于這5種海水魚中小清蛋白的檢測。在分析的7種淡水魚和5種海水魚中,白色肉中小清蛋白的含量均高于紅色肉,這與文獻報道的結果一致。2.3小清蛋白的純化本研究采用商品化的抗蛙小清蛋白單克隆抗體以ELISA法分別對7種淡水魚和5種海水魚白色肉和紅色肉熱提取物中的小清蛋白進行定量比較。采用純化的鰱魚小清蛋白為標準蛋白制定標準曲線,因此首先對鰱魚白色肉的小清蛋白進行分離純化。通過提取鰱魚肌肉的肌漿蛋白進行硫酸銨鹽析、DEAE-Sepharose、Sephacryl-S-200柱層析后,結合280nm、220nm紫外檢測和Tricine-SDS分析,得到單一條帶,分子量約為12kD,結果如圖3A所示。純化的蛋白通過Westernblot分析,可與抗蛙小清蛋白抗體呈陽性反應,表明純化的蛋白為小清蛋白(圖3B)。2.4不同魚類小清蛋白的含量用純化的鰱魚小清蛋白制備的ELISA標準曲線如圖4所示。圖5為采用抗蛙小清蛋白單克隆抗體通過ELISA方法測定,根據標準曲線推算的12種魚類白色肉和紅色肉粗提物中小清蛋白的含量。由圖可知,鯽魚白色肉中小清蛋白的含量最高,為2.26mg/g,將其設為100%,其它魚類的小清蛋白含量與之相比即得相對含量。從圖5可以看出,小清蛋白主要存在于魚類的白色肉中。但在不同的魚類中,小清蛋白的含量有較大差異,其中,鯽魚小清蛋白的含量約為鲆魚的5倍。在不同的魚類中,白色肉小清蛋白的含量約為紅色肉的4～33倍。由于本研究采用淡水鰱魚小清蛋白作標準曲線,因此,其他魚類的真實小清蛋白含量可能與測量值有一定差異,但本實驗的結果與Tricine-SDS的結果基本一致,表明該方法可用于這12種經濟魚類小清蛋白的相對定量檢測。3elisa檢測食物小清蛋白的存在情況魚類是人類重要的蛋白來源,世界魚類消費量逐年上升,我國2008年的水產品總產量已達4900萬噸。隨著運輸業及水產加工技術的發展,魚類的消費也打破了地域的限制。食品可能在運輸、儲存以及加工過程中由于公共容器的使用而受到魚類致敏成分的污染。而對過敏人群來說,少量食入甚至接觸魚類蛋白就可能導致過敏的發生,因此,可靠的食物過敏原檢測和定量方法將有助于規范水產食品標簽,保證消費者的安全。目前,以蛋白質或核酸為檢測對象包括雙抗夾心ELISA、PCR、SDS等方法廣泛應用于多種食物過敏原的檢測,如甲殼類動物、軟體動物、花生、雞蛋、大豆、牛奶等。但對魚類過敏原的分析方法仍較為缺乏,僅Heffron等以已知濃度的鯉魚小清蛋白為標準,采用SDS對大西洋魟(Dasyatissabina)的小清蛋白進行了定量。Faste等采用抗鱈魚小清蛋白多克隆抗體建立了雙抗夾心ELISA檢測食物中小清蛋白的存在情況。由于國內對于過敏原的研究起步比較晚,在檢測方面主要是利用人或動物血清中特異性IgE進行檢測,受抗體來源限制較大;李振興等通過制備南美白對蝦過敏原TM的多克隆抗體,利用斑點免疫金滲濾法對蝦類的過敏原進行快速檢測,靈敏度為250ng/ml。對于魚類過敏蛋白檢測的研究,Sun等采用RT-PCR對小清蛋白進行了檢測。但由于在食品加工過程中,蛋白質和核酸受到的影響程度有很大的不同,因此,以核酸為靶標的PCR法雖然簡單、穩定,但并不能完全如實反映食品中過敏原的存在情況。本研究以主要過敏原小清蛋白為靶標,建立魚類過敏原檢測方法。商品化的抗蛙小清蛋白單克隆抗體(PARV-19)可以與多種魚類小清蛋白產生免疫交叉反應,由于白色肉和紅色肉的致敏性與其小清蛋白的含量密切相關,因此,我們采用該抗體對白色肉和紅色肉中的小清蛋白進行分析定量。Westernblot分析結果顯示,與Tricine-SDS結果相比,所采用的PARV-19單克隆抗體與7種淡水魚和5種海水魚中不同類型小清蛋白均能產生特異的交叉反應,表明該抗體適用于這12種魚中小清蛋白的檢測。本實驗的結果顯示,在研究的7種淡水魚和5種海水魚中,紅色肉中小清蛋白的含量較白色肉低,表明魚類不同部位肌肉中小清蛋白的含量存在一定的差異,這與文獻報道的結果一致。在本研究中,除了鯖魚、鲆魚外,其它10種魚類中均分別檢測到至少2種小清蛋白的異構體。文獻報道,在不同的魚類中存在著多種小清蛋白異構體。如Swoboda等人通過分子生物學手段從鯉魚(Cyprinuscarpio)中克隆了2種小清蛋白基因的全序列(Cypc1.01和Cypc1.02);VanDo等通過蛋白質純化、分子克隆等方法從狹鱈中分離到2種不同形式的小清蛋白;Chen等采用雙向電泳及Westernblot方法從鯉魚、鯰魚、鱈魚和非洲鯽魚中檢測到了5、3、1、2等不同數量的小清蛋白異構體