第七章微生物的遺傳變異和育種

遺傳

(heredity)：是親子間的關系，指生物的上一代將自己的一整套遺傳基因傳遞給下一代的行為或功能，具穩(wěn)定的特性。遺傳型(genotype)又稱基因型，指某一生物個體所含有的全部基因的總和是一種內在可能性或潛力。表型(phenotype)指生物體所具有的一切外表特征和內在特性的總和;是具一定遺傳型的生物在一定條件下所表現(xiàn)出的具體性狀。遺傳型+環(huán)境條件——表型變異(variation):生物體在外因或內因的作用下，遺傳物質的結構或數(shù)量發(fā)生改變而導致表型改變。變異的特點：a。群體一般為10-6～10-10；b.形狀變化的幅度大；c.變化后形成的新性狀是穩(wěn)定遺傳的。變異(variation):

生物體在外因或內因的作用下，遺傳物質的結構或數(shù)量發(fā)生改變而導致表型改變。變異的特點：a.群體變異率一般為10-6～10-10；b.性狀變化的幅度大；c.變化后形成的新性狀是穩(wěn)定遺傳的。

飾變（modification）：指不涉及遺傳物質結構改變而只發(fā)生在轉錄、轉譯水平上的表型變化。特點：a.幾乎整個群體中的每一個個體都發(fā)生同樣的變化；b.性狀變化的幅度小；c.因遺傳物質不變，故飾變是不遺傳的。引起飾變的因素消失后，表型即可恢復。粘質殺雷氏菌：<25度，靈桿菌素

微生物成為遺傳模式生物原因物種和代謝類型多樣性；個體簡單；營養(yǎng)體多為單倍體；易于大量生長繁殖；繁殖速度快；易于積累不同的中間代謝物或終產物；菌落形態(tài)多樣性、可見性；易于形成營養(yǎng)缺陷型；各種微生物一般都有其相應的病毒；第一節(jié)遺傳變異的物質基礎一、3個經典轉化實驗（一）經典轉化實驗F.Griffith

轉化(transformation)

Streptococcuspneumoniae動物實驗細菌培養(yǎng)實驗S型菌的無細胞抽提液試驗動物的轉化試驗1928年F.Griffith肺炎鏈球菌使小鼠患敗血癥死亡S型菌株---菌株形成莢膜、菌落表面光滑、莢膜多糖有毒致病R型菌株---菌株不形成莢膜、菌落表面粗糙、不致病體外培養(yǎng)實驗

熱死S菌——不生長

活R菌—長出R菌

熱死S菌+活R菌—長出大量R菌和少量S菌

活R菌+S菌無細胞抽提液

——長出大量R菌和少量S菌

1944年

O.T.Avery活R菌+①加S菌DNA②加S菌DNA及DNA酶以外的酶③加S菌的DNA和DNA酶④加S菌的RNA⑤加S菌的蛋白質⑥加S菌的莢膜多糖長出S菌只長R菌只有S型細菌的DNA才能將S.pneumoniae的R型轉化為S型。且DNA純度越高，轉化效率也越高。說明S型菌株轉移給R型菌株的，是遺傳因子。轉化概念：（二）噬菌體感染試驗1952年A.D.Hershey,M.Chase證實了DNA是噬菌體的遺傳物質基礎。32P,

35S10分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細胞進一步培養(yǎng)后，可產生大量完整的子代噬菌體（二）噬菌體感染實驗含32P-DNA的一組：放射性85%在沉淀中（三）植物病毒的重建實驗H.Fraenkel-Conrat(1956)煙草花葉病毒（tobaccomosaicvirus,TMV)充分證明了，在RNA病毒中，遺傳的物質基礎是RNA。植物病毒的重建實驗二、遺傳物質在微生物細胞內存在的部位和方式（一）核酸存在的七個水平1.細胞水平：存在于細胞核或核質體，單核或多核2.細胞核水平：原核與真核生物的細胞核結構不同，核外DNA

核染色體組、核外染色體包括：細胞質基因、卡巴顆粒、質粒3.染色體水平：倍性(真核)和染色體數(shù)

染色體數(shù)、染色體倍數(shù)4.核酸水平核酸種類:DNA或RNA核酸結構:單鏈或雙鏈；環(huán)形或線形或超螺旋狀DNA長度：bp,kb在原核中在染色體水平、存在部分二倍體DNA或RNA，復合或裸露，雙鏈或單鏈

DNA的三種存在形式

5.基因水平：具自主復制能力的遺傳功能單位，長度與信息量，轉錄——翻譯

操縱子、調節(jié)基因、結構基因、阻遏物、啟動基因、內含子（intron)、外顯子(exon)6.密碼子水平：信息單位，起始和終止，三聯(lián)體密碼子7.核苷酸水平：突變或交換單位，四種堿基

（二）原核生物的質粒1、定義和特點游離于原核生物核基因組以外，具有獨立復制能力的小型共價閉合環(huán)狀的dsDNA分子，即cccDNA(circularcovalentlyclosedDNA)。超螺旋、1.5-300kb、分子量106－108，1％核基因組大小。賦予細菌特殊功能：接合、產毒、抗藥、固氮、產特殊酶、降解環(huán)境毒物。是獨立的復制子(replicon)嚴密型復制控制(stringentreplicationcontrol)：復制與核染色體的復制同步，1－2個。松弛型復制控制(relaxedreplicationcontrol)：復制與核染色體的復制不同步，10－15個。質粒消除(curing)：含質粒細胞在正常培養(yǎng)基上受外界因素刺激（UV、高溫、藥物等），其復制受抑，核復制繼續(xù)進行，子代細胞質粒消失。整合(integration):質粒（或溫和噬菌體、病毒、轉化因子）等小型非染色體DNA插入核基因組等大型DNA分子中的現(xiàn)象。附加體(episome):某些質粒具有與核染色體發(fā)生整合與脫離的功能，如F質粒。2、質粒在基因工程中的應用優(yōu)點:體積小，便于DNA的分離和操作。呈環(huán)狀，化學分離過程中能保持性能穩(wěn)定。有不受核基因組控制的獨立復制起始點。拷貝數(shù)多，使外源DNA可很快擴增。存在抗藥性基因。克隆載體(cloningvector)，能完成外源DNA片斷復制的DNA分子，如：pBR322質粒3、E.coli的pBR322質粒優(yōu)點:1.體積小，4361bp2.在E.coli中穩(wěn)定維持高拷貝數(shù)（20~30個/細胞）3.用氯霉素抑制其宿主蛋白質合成，每細胞可增加到1000－3000個質粒4.分離極容易5.可插入較多的外源DNA（<10KB)6.結構完全清楚，可任意選擇酶切位點7.有兩個選擇性抗藥標記8.可方便的通過轉化作用導入宿主細胞4、質粒的分離與鑒定過程:細胞裂解、去除pro和RNA、使染色體DNA與質粒DNA分離電鏡、瓊脂糖電泳、聚丙烯酰胺電泳鑒定；凝膠電泳譜限制性酶切圖譜密度梯度離心法5、質粒的種類（1）F質粒(Fplasmid)F因子、致育因子、性因子（sexfactor)轉座因子（transposableelements)

E.coli等細菌的決定性別并有轉移能力的質粒；100kb，cccDNA，含有與質粒復制和轉移有關的許多基因；(2)R質粒(Rplasmid,resistranceplasmid)R質粒由兩個相連的DNA片段組成：抗性轉移因子(resistancetransferfactor,RTF)：含調節(jié)DNA復制和拷貝數(shù)的基因及轉移基因，具轉移功能；抗性決定因子(r-determinant)：大小不定，無轉移功能，含各種抗性基因。R質粒Copy:1-2，或幾十個，嚴謹或松弛型復制控制：經氯霉素處理后，拷貝數(shù)達2000－3000個，傳染病大敵，(3)Col質粒(colicinplasmid,colplasmid)又稱大腸桿菌素質粒細菌素(bacteriocin):許多細菌能產生抑制或殺死近緣細菌或同種不同株的代謝產物，并是由質粒編碼的蛋白，沒有抗生素的殺菌譜廣。大腸桿菌素：由Ecoli某些菌株產生的細菌素，具有通過抑制復制、轉錄、轉譯或能量代謝而專一殺死它種腸道菌或同種其它菌株的能力，由大腸桿菌素質粒編碼。大腸桿菌素分類:以ColE1為代表，分子量小，無接合作用，松弛型控制，多拷貝;以ColIb為代表，分子量大，接合轉移功能，嚴緊型控制，1~2拷貝。(4)Ti質粒(tumorinducingplasmid)誘癌質粒或冠癭質粒：是一種200kb的環(huán)狀質粒，可從一些雙子葉植物的受傷根部侵入根部細胞，在其中溶解，釋放Ti質粒；質粒包括毒性區(qū)、接合專一區(qū)、復制起始區(qū)和T-DNA區(qū)。其上的T－DNA與植物細胞的核基因組整合，合成正常植株所沒有的冠癭堿類，破壞激素調控系統(tǒng)，使其轉為癌細胞。廣泛用于植物基因工程，承擔80％的植物轉基因任務。(5)Ri質粒(rootinducingplasmid)

其侵入植物根部細胞后，將Ri質粒（250kb）中的一段T-DNA整合到宿主根部細胞的核基因組中，使之發(fā)生轉化，從而這段T-DNA就在宿主細胞中穩(wěn)定遺傳。Ri轉化的根部不形成瘤，僅生成可再生新植株的毛狀根。如毛狀根離體培養(yǎng)，能合成次生代謝物。可作為外源基因的良好載體。

（6）Mega質粒(megaplasmid)

巨大質粒，存在于根瘤菌上，含有一系列與共生固氮相關的基因，分子量比一般質粒大幾十倍。（7）降解性質粒存在于假單胞菌屬，可編碼降解一系列復雜有機物的酶，在污水處理、環(huán)境保護方面發(fā)揮作用；CAM（樟腦）質粒、OCT（辛烷）質粒、XYL（二甲苯）質粒等；人工構建具有多種降解質粒的菌株——超級菌。第二節(jié)基因突變和誘變育種一、基因突變突變：指生物體細胞內遺傳物質的分子結構或數(shù)量突然發(fā)生可遺傳的變化，可自發(fā)或誘導產生，導致表型發(fā)生可遺傳的變化。

狹義突變：基因突變—點突變廣義突變：基因突變和染色體畸變突變的幾率：10-6---10-9

野生菌株

------突變-------突變株（一）基因突變類型（表型分類）

選擇性突變

非選擇型突變營養(yǎng)缺陷型（株）抗性突變型（株）條件致死突變（株）形態(tài)突變型（株）抗原突變型（株）產量突變型（株）營養(yǎng)缺陷型（auxotroph)抗性突變型（resistantmutant)條件致死突變型（conditionallethalmutant)Ts突變株即溫度敏感突變株（temperraturesensitivemutant,Tsmutant)形態(tài)突變性（morphologicalmutant)抗原突變株（antigenicmutant)產量突變株（metabolitequantitativemutant)正變株（plus-mutant)、副變株（minus-mutant)1、營養(yǎng)缺陷型——因突變而喪失合成某種物質的能力，因此必須在培養(yǎng)基中添加某種生長因子、堿基或氨基酸才能生長的突變類型。2、抗性突變型——因突變而產生了對某種化學藥物或致死物理因子的抗性的突變株。篩選

3、條件致死突變型——突變后在某種條件下可正常生長繁殖，而在另一條件下卻無法生長繁殖的突變型Ts菌株，原因：突變使某些蛋白的結構和功能發(fā)生改變，以致會在某特定溫度下具有功能，在另一溫度下無功能。4、形態(tài)突變型——由突變引起的個體或菌落形態(tài)變異，一般屬非選擇突變，如：鞭毛、莢膜、孢子、顏色、菌落、噬菌斑5、抗原突變型——因突變而引起的抗原結構發(fā)生改變，cell壁缺陷變異、莢膜、鞭毛成分變異；6、產量突變型——突變引起代謝產物產量上高于原始菌株者，稱正突變，反之為負變株。（二）突變率（mutationrate)每一細胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。突變率為10–8是指該細胞在一億次細胞分裂中，會發(fā)生一次突變。突變率也可以用每一單位群體在每一世代中產生突變株（mutant，即突變型）的數(shù)目來表示。突變率=突變細胞數(shù)/分裂前群體細胞數(shù)

（三）基因突變的特點

以細菌的抗藥性為例。1、自發(fā)性：突變可以在沒有人為誘變因素處理下自發(fā)地產生。2、不對應性：突變的性狀與突變原因之間無直接的對應關系。3、稀有性：突變率低且穩(wěn)定，10－6－10－9

（三）基因突變的特點

4、獨立性：各種突變獨立發(fā)生，不會互相影響。某一基因發(fā)生突變不會影響其它基因的突變率。5、可誘發(fā)性：誘變劑可提高突變率。6、穩(wěn)定性：變異性狀穩(wěn)定可遺傳。7、可逆性：從原始的野生型基因到變異株的突變稱為正向突變，從突變株回到野生型的過程則稱為回復突變，（四）基因突變自發(fā)性和不對應性的實驗證明兩種觀點：1、突變是通過生物對某特定環(huán)境的適應產生的，環(huán)境是突變的誘因。抗性性狀與環(huán)境因素相對應——馴養(yǎng)論2、抗性突變是自發(fā)產生的，即使誘變，其產生的性狀與誘變因素間是不對應的，僅是一種用于篩選的條件。

Luria等的變量試驗（fluctuationtest)

變量試驗又稱波動試驗、彷徨試驗。1943年，S.E.Luria和M.Delbrück根據(jù)統(tǒng)計學原理，設計的實驗。材料：大腸桿菌、大腸桿菌的T1噬菌體（烈性噬菌體）觀察統(tǒng)計抗噬菌體的抗性菌株數(shù)量

試驗說明：Ecoli抗噬菌體性狀的產生并非由所抗的環(huán)境因素（T1phage)誘導出來的，而是在它接觸T1前，在某次cell分裂過程中自發(fā)產生，自發(fā)突變越早抗性菌落出現(xiàn)越多，T1只起辨別作用。2、Newcombe的涂布試驗1949年，Newcombe，Nature發(fā)表原理與變量試驗相同，方法更為簡便，且可計算突變率。初始接種量：5×104個/皿培養(yǎng)5小時，繁殖了12.3代，每個微菌落約含5100個細菌這時，每個平皿上的細胞數(shù)為：5100×5×104≈2.6×108個/皿在6個平板上，比接種時增加的細胞數(shù)為：

6×（2.6×108

5×104）=15.6×108在未涂布的平板上共發(fā)現(xiàn)28個突變，故突變率=28/15.6×108=1.8×10

8

結果：在涂布一組共長出抗T1菌落353個，未涂布一組為28個菌落，證明，抗性突變發(fā)生在接觸T1之前。3、Lederberg影印平板培養(yǎng)法1952年，J.Lederberg夫婦的論文《平板影印培養(yǎng)法和細菌突變株的間接選擇》，更好地證明了微生物的抗藥性是在未接觸藥物前自發(fā)地產生的，這一突變與相應藥物環(huán)境毫不相干。E.coliK12,鏈霉素敏感菌株

在根本未接觸過任何一點鏈霉素的情況下，就可以篩選到大量抗鏈霉素的突變株，充分說明了突變是自發(fā)產生的，鏈霉素只是起到了一種檢出作用。平板影印培養(yǎng)不僅在微生物遺傳理論的研究中有重要應用，而且在育種實踐和其它研究中均有應用。（五）基因突變劑的機制自發(fā)突變：生物體在無人工干預下自然發(fā)生的低頻率突變。誘發(fā)突變:通過人為方法，利用物理、化學或生物因素顯著提高基因自發(fā)突變頻率的手段。1、

染色體數(shù)目的變化

n----2n-----3n-----4n整倍變化

n----n+1、n-1，2n---2n+1、2n-1、2n-2非整倍變化

原核生物只有一條染色體，但可成為部分二倍體。

2、

染色體結構的變化

染色體結構的變化也稱為染色體畸變，包括：缺失、重復、倒位、易位、轉座。一般認為這是由于染色體單體發(fā)生斷裂后，錯誤性愈合而造成的。

可造成隱性基因的表達、顯性基因的拷貝數(shù)增多、某一性狀的缺失、基因間連鎖程度的變化、不同染色體基因的連鎖等變化。重復、缺失、倒位、易位3、基因突變（點突變）的誘變機制誘變劑（mutagen）：凡能提高突變率的任何理化因子，均稱為誘變劑誘變劑的種類很多（1）堿基置換（substitution）一對堿基被另一對堿基所置換。轉換（transition），即DNA鏈中的一個嘌呤被另一個嘌呤或是一個嘧啶被另一個嘧啶所置換；顛換（transversion），即一個嘌呤被一個嘧啶,或是一個嘧啶被一個嘌呤所置換。

堿基置換后會出現(xiàn)下列幾種情況(1)錯義突變

一種氨基酸變成另一種氨基酸；(2)

無義突變

氨基酸的堿基置換后變成終止密碼UAG（琥珀突變）UAA（赫石突變）UGA（乳石突變）等終止密碼子；堿基置換后會出現(xiàn)下列幾種情況(3)

同義突變，堿基發(fā)生了置換，但由于遺傳密碼子的簡并性，氨基酸不變。如密碼子GCU置換成GCC后，它們都是丙氨酸的密碼子；(4)

沉默突變

，

堿基置換造成多肽鏈中一個氨基酸的改變，但該氨基酸對蛋白質的結構和功能沒有多大的影響，并沒引起細胞表型變化。

A直接引起置換的誘變劑一類可直接與核酸的堿基發(fā)生化學反應的誘變劑，不論在機體內或是在離體條件下均有作用例如

：亞硝酸、羥胺和各種烷化劑作用：它們可與一個或幾個核苷酸發(fā)生化學反應，從而引起DNA復制時堿基配對的轉換，并進一步使微生物發(fā)生變異。能引起顛換的誘變劑很少，只是部分烷化劑才有。*亞硝酸

HNO2

胞嘧啶（C）

尿嘧啶（U）

HNO2

腺嘌呤（A）

次黃嘌呤（H）

HNO2

鳥嘌呤（G）

黃嘌呤（X）①腺嘌呤氧化脫氨后形成烯醇式次黃嘌呤（He）

②

He通過互變異構效應形成酮式次黃嘌呤（HK）

③DNA復制時，HK與胞嘧啶（C）配對④

DNA第二次復制時，C與G正常配對，實現(xiàn)了轉換A：TG：C。

烷化劑(alkylatingagent)帶有一個或多個活性烷基，誘變作用是其與DNA中的堿基或磷酸作用。常見的烷化劑有硫酸二乙酯（EDS）甲基磺酸乙酯（EMS）、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（NTG）、亞硝基甲基脲(NMU)、氮芥、乙烯亞胺和環(huán)氧乙酸等。

羥胺（HA）

能專一地與胞嘧啶作用。修飾后的N-4-羥基胞嘧啶只能與腺嘌呤配對，引起C：G

T：A堿基轉換，羥胺引起的轉換是單向的，即無法引起T：A

C：G的堿基轉換。B間接引起置換的誘變劑這類誘變劑主要是一些堿基類似物

這些化合物有5-溴尿嘧啶（5-BU），5-氟尿嘧啶(5-FU)、8-氮鳥嘌呤(8-NG)和2-氨基嘌呤（2-AP）等。它們與正常堿基的結構類似，在DNA復制時，它們可以被錯誤地摻入DNA，引起誘變效應，所以說它們引起堿基置換的作用是間接的。

5-溴尿嘧啶（5-BU）為例酮式的5-BU結構與胸腺嘧啶相似，烯醇式5-BU結構與胞嘧啶相似

當把某一微生物在含5-BU的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，DNA復制時，它可取代T。5-BU以酮式狀態(tài)存在于DNA中，因而與A配對。5-BU很容易進行酮式與烯醇式結構的互變異構，當DNA復制時，烯醇式5-BU不與A而與G配對，從而造成A：T

G：C的轉換，

（2）移碼突變（frame-shiftmutation)移碼突變是指由一種誘變劑引起DNA分子中的一個或少數(shù)幾個核苷酸的插入或缺失，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉錄和翻譯錯誤的一類突變。移碼突變誘變劑

吖啶類染料（原黃素、吖啶黃、吖啶橙等）一系列稱為ICR類的化合物（因美國的腫瘤研究所合成而得名），都是移碼突變的有效誘變劑

吖啶類化合物的誘變機制與嘌呤-嘧啶堿基對的結構十分相似，故能嵌入兩個相鄰的DNA堿基對之間，造成雙螺旋的部分解開（0.34nm--變成0.68nm），從而在DNA復制過程中，會使鏈中增添或缺失一個堿基，結果引起移碼突變。

轉座因子（transposableelement）

轉座（transposition)

轉座因子：插入序列、轉座子、又稱可移動基因或跳躍基因插入序列

IS轉座子

Tn轉座頻率：10-5—10-7

轉座子特點復制新拷貝非同源重組轉移兩端有末端重復序列，正向重復、反向重復轉座酶基因轉座酶轉座的過程轉座酶識別受體DNA分子把序列，切割成兩單鏈；連接缺口由DNA多聚酶1補齊，DNA連接酶連接；4、自發(fā)突變的機理大多數(shù)自發(fā)突變本質上是誘發(fā)的，它不是人為的，而是自然環(huán)境或細胞內環(huán)境誘發(fā)的。誘因包括：細胞外因素細胞內因素DNA分子內部因素

（1）細胞外的誘發(fā)因素

自然環(huán)境或人工條件下的物理和化學因素宇宙間的短波輻射、宇宙射線和紫外線等，多因素低劑量長期輻射的綜合效應。自然環(huán)境中存在低劑量的金屬離子、高分子化合物、生物堿藥物、染料等都能成為引起生物突變的化學因素。

（2）細胞內的誘發(fā)因素

細胞的代謝活動產生一些誘變物質，如過氧化氫、咖啡堿和重氮絲氨酸等，它們是引起自發(fā)突變的內源誘變劑。許多微生物的陳舊培養(yǎng)物中易出現(xiàn)自發(fā)突變株，可能就是這類原因。

（3）

DNA分子內部因素

DNA分子中的堿基存在著互變異構效應。

A、T、G、C四種堿基，存在酮基結構（T，G）或氨基結構（A，C），酮式與烯醇式存在互變異構；氨基式與亞氨基式存在互變異構狀態(tài)；環(huán)出效應在DNA的復制過程中，如果其中某一單鏈上偶然產生一個小環(huán)，則會因其上的基因越過復制而發(fā)生遺傳缺失。（六）紫外線對DNA的損傷及其修復嘧啶對紫外線更敏感性。嘧啶的光化產物主要是二聚體和水合物。1、光復活作用（photoreactivation）經紫外線照射后的微生物立即暴露于可見光下時，可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，稱為光復活作用。

對照：8×106個/mlE.coliU.V.100個/ml試驗：8×106個/mlE.coliU.V.360~490nm2×106個/mlE.coli

可見光，30分

光復活作用過程經紫外線照射后形成的帶有胸腺嘧啶二聚體的DNA分子，在黑暗下會被一種光激活酶即光裂合酶（photolyase）結合，當形成的復合物暴露在可見光（300~500nm）下時，此酶會因獲得光能而發(fā)生解離，從而使二聚體重新分解成單體。光激活酶從復合物中釋放出來。每一E.coli細胞中約含有25個光激活酶分子。光復活作用禁忌

由于一般的微生物中都存在著光復活作用，所以進行紫外線誘變育種時，只能在紅光下照射及處理照射后的菌液。2、暗修復作用（darkrepair）又稱切除修復（excisionrepair）。是活細胞內一種用于修復被紫外線等誘變劑（包括烷化劑、X射線和γ射線等）損傷后的DNA的機制。這種修復作用與光無關。有四種酶參與①內切核酸酶：切開

②外切核酸酶：擴大③DNA聚合酶：復制④通過連接酶：連接

完成了修復作用。

3、紫外誘變方法:設備：紫外燈、磁力攪拌器、暗室等，紫外燈：波長為253.7nm,功率是15W處理時的照射距離：20cm—30cm樣品：要直接暴露在紫外燈下，厚度不能超過3mm照射時，要用磁力攪拌器攪拌。處理劑量：常用照射時間或死亡率作為相對劑量生產上經常采用的劑量：死亡率為70%——80%左右二、突變與育種（一）自發(fā)突變與育種1、生產中育種10-6突變率

-----尋找正向突變菌株2、定向培育優(yōu)良菌種牛型結核桿菌------13年----230代----卡介苗（減毒活菌疫苗）（二）誘變育種

誘變

+篩選誘變是隨機的；篩選是定向的目前發(fā)酵工業(yè)生產菌株都是經過突變改造過的。1、誘變育種的基本規(guī)律2、誘變育種中的幾個原則

誘變劑的選擇

1)誘變劑作用的普遍性：選擇那些在其它菌種選育中誘變效果好的誘變劑。如：UV、亞硝基胍（NTG）、快中子等。

2)誘變劑的特異性：憑經驗。

如，四環(huán)素族抗生素用亞硝酸、羥胺，

青霉素用氮芥、乙烯亞胺、亞硝基胍．3)菌株的差異：（即使是同一菌）

A：遺傳性不穩(wěn)定的菌株------用緩和誘變劑

B：遺傳性穩(wěn)定的菌株---------首用強，后用緩。

4)考慮誘變機制：UV——嘧啶，

亞硝酸

——嘌呤，因此復合使用為好。

3、出發(fā)菌株的選擇

出發(fā)菌株—用來育種處理的起始菌株

◆出發(fā)菌株應具備

①對誘變劑的敏感性高；

②具有特定生產性狀的能力或潛力；

◆出發(fā)菌株的來源

①自然界直接分離到的野生型菌株：

②歷經生產考驗的菌株：

③已經歷多次育種處理的菌株：4、誘變劑劑量的選擇用50—85%的殺菌劑量，此時正突變率高，特別是出發(fā)菌株已是高產菌株。

5、三類突變株的篩選產量突變株篩選

抗藥性突變株的篩選（梯度平板法）

營養(yǎng)缺陷型(auxotroph)的篩選

1）產量突變株篩選瓊脂塊培養(yǎng)法（春日霉素）

孢子懸液------誘變----適當培養(yǎng)（表型遲延）——涂布平板----打孔取菌落-----瓊脂塊培養(yǎng)----4-5天,測定瓊脂塊所含的抗生素的抑菌圈----獲效價高菌

2）抗藥性突變株的篩選（梯度平板法）

3)營養(yǎng)缺陷型(auxotroph)的篩選三類遺傳型：營養(yǎng)缺陷型突變株：必須在培養(yǎng)基內加入相應有機養(yǎng)分野生型菌株：自然界分離到的任何微生物，在其發(fā)生營養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株，為該微生物的野生型。原養(yǎng)型菌株：指營養(yǎng)缺陷型突變菌株回復突變或重組后產生的菌株，與野生型的表型相同。

三類培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基（MM）[-]：凡是能滿足野生型菌株營養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基（CM）[+]：滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株生長的天然或半合成培養(yǎng)基。

補充培養(yǎng)基（SM）[x]：在MM中有針對性地加入一或幾種營養(yǎng)成分以滿足相應營養(yǎng)缺陷型菌株生長的合成培養(yǎng)基。檢出缺陷型方法逐個檢出法影印檢出法夾層培養(yǎng)法限量補給法a.逐個檢出法

b.影印檢出法

c.夾層培養(yǎng)法

d.限量補給法

在含少量的（0.01%）蛋白胨的MM上培養(yǎng),缺陷型饑餓，大菌落為野生型，小菌落的為缺陷型。

6、鑒定缺陷型生長譜法組合營養(yǎng)物法組合補充培養(yǎng)基法

1)生長譜法

斜面菌種-----生理鹽水洗下細胞------洗滌-----涂布（105個/皿）

紙片1:氨基酸混合液;紙片2:維生素混合液;紙片3:核酸水解液;紙片4:酵母水解液

2)Amestest：對化學誘變劑做檢測

原理：his-在基本培養(yǎng)基上不長；而發(fā)生回復突變則長。

菌種：鼠傷寒沙門氏菌his-

第三節(jié)基因重組原核生物的基因重組凡把兩個不同性狀個體內的遺傳基因轉移到一起，經過遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳型個體的方式，稱為基因重組（generecombination）或遺傳重組。作用：重組可使生物體在未發(fā)生突變的情況下，也能產生新遺傳型的個體。

一、原核微生物的基因重組特點：片段性：僅一小段DNA參與重組單向性：共體

受體，單方向轉移轉移機制多樣性:轉化、

轉導、

接合、

原生質體融合（一）轉化（transformation)概念：受體菌直接吸收來自供體菌的游離DNA片段，并把它整合到自己的基因組中，而獲得部分新的遺傳性狀的基因轉移過程，稱為轉化。轉化后的的受體菌稱為轉化子(transformant)來自供體菌的DNA片段稱為轉化因子1、轉化發(fā)生的條件（1）兩個菌株間的親緣關系密切（2）受體細胞要處于感受態(tài).（3）供體DNA片段（轉化因子）大小適宜，分子量一般為1×106

D

左右，15個基因（4）單鏈供體DNA進入受體菌，發(fā)生同源重組；（在受體菌表面，一條鏈被水解）（5）DNA復制，受體細胞分裂，帶有新性狀的個體為轉化子2、感受態(tài)感受態(tài)：受體細胞能從環(huán)境吸取外源DNA片段并實現(xiàn)其轉化的一種生理狀態(tài)用CaCl2處理大腸桿菌，可以增加大腸桿菌細胞壁的透性，當轉化因子結合在受體細胞的接合點上時，DNA中的一個鏈可被受體細胞膜上核酸酶分解，另一個鏈進入受體細胞，通過整合作用與受體細胞的DNA進行gene重組。在具有感受態(tài)的微生物中，感受態(tài)細胞所占比例和維持時間不同。3、轉化因子是離體的DNA片段，長15kb，可攜帶15個基因；有些菌種只吸收dsDNA形式的轉化因子，入胞后降解成ssDNA發(fā)生整合；有些菌種只吸收的ssDNA；能發(fā)生轉化的最低DNA濃度極低。4、轉化過程S.pneumoniae抗鏈霉素基因標記為例供體菌（strR）的dsDNA片段與感受態(tài)受體菌（strS）細胞表面的膜連DNA結合蛋白結合，其中一條鏈被核酸酶水解，另一條鏈進入細胞ssDNA片段與細胞內特異蛋白結合，使其與受體菌核染色體上的同源區(qū)段配對、重組染色體組復制、細胞分裂，遺傳性狀分離。

5、轉染把噬菌體或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出來，讓它去感染感受態(tài)的宿主細胞，并進而產生正常的噬菌體或病毒的后代，這種現(xiàn)象稱為轉染（transfection）。

（二）轉導（Transduction）概念：借助缺陷噬菌體為媒介，把供體細胞中DNA片段攜帶到受體細胞中，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱轉導。獲得新遺傳性狀的受體細胞稱為轉導子（transductant）。轉導過程不需要細胞接觸，而是以噬菌體為載體。轉導主要分為：

完全普遍性轉導普遍轉導

流產普遍性轉導

低頻局限性轉導局限轉導

高頻局限性轉導1、

普遍轉導（Generalizedtransduction）

由完全缺陷型噬菌體對供體菌染色體上任何DNA片段進行“誤包”，當它去感染受體菌時，將其遺傳性狀傳遞給受體菌，使后者獲得這部分遺傳性狀的現(xiàn)象稱為普遍轉導。分類：完全普遍轉導、流產普遍轉導

（1）完全普遍轉導鼠傷寒沙門氏菌為例：供體菌：野生型受體菌：各種營養(yǎng)缺陷型完全缺陷型噬菌體：P22（只含有核染色體），感染復數(shù)（M.O.I.）<1，不會發(fā)生溶源化，外源DNA片段可與受體細胞染色體同源區(qū)段配對、雙交換、整合、獲得普遍轉導子。特點：供體的任何基因都有可能進入受體細胞完全普遍轉導外來DNA片段通過雙交換而形成轉導子

（2）流產普遍轉導(abortivetransduction)概念：經轉導噬菌體為媒介獲得的供體菌DNA片段的受體菌，如果這段外源DNA在其內不交換、整合和復制，也不迅速消失，而僅表現(xiàn)為穩(wěn)定的轉錄、轉譯和形狀表達，稱流產轉導。特點：受體菌只能將這段外源DNA分配到一個子細胞中，另一個細胞僅能獲得外源基因經轉錄、轉譯而形成的少量酶，有輕微表型變化。流產轉導的示意圖

流產普遍轉導特征：形成微型菌落轉導的兩種結局2、局限轉導

Restrictedtransduction概念：是指通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，在受體菌中整合、重組，并獲得表達的轉導現(xiàn)象。

（2）局限轉導

Restrictedtransduction條件：

供體菌----大腸桿菌K12（λ）溶源菌（野生型）

受體菌-----營養(yǎng)缺陷型（Bio-，gal-）

部分缺陷溫和性噬菌體----λd局限轉導特點：只傳遞供體菌的少數(shù)特定基因，一般為噬菌體整合位點兩側的基因；該特定基因由部分缺陷的溫和噬菌體攜帶；缺陷噬菌體脫離宿主核染色體時發(fā)生低頻率誤切;局限噬菌體的產生是由于UV等因素對溶源菌的誘導引起裂解而產生的。正常

噬菌體和轉導半乳糖（gal）的缺陷型噬菌體(

dg)的形成過程

低頻轉導發(fā)生誤切頻率10–4~10–6因此

形成轉導子的頻率低條件：感染復數(shù)m.o.i<1（1）低頻轉導通過一般溶源菌釋放的噬菌體所進行的轉導，因其只能形成極少數(shù)誤切——（10－4～10－6）轉導子，稱低頻轉導。Gal：發(fā)酵半乳糖基因；Bio：合成生物素基因；部分缺陷噬菌體感染宿主并整合在宿主核基因組上時，可形成一個獲得了供體菌的gal或bio基因的局限轉導子。（2）高頻轉導雙重溶源菌：當以gal－

E.coli作受體菌，溶源菌的裂解物以高感染復數(shù)(M.O.I.>1)進行感染時，凡感染部分缺陷噬菌體的細胞同時感染正常噬菌體，二者同時整合在一個受體菌的核染色體組上，這樣的受體菌稱為雙重溶源菌。高頻轉導：在局限轉導中，若對雙重溶源菌進行誘導，就會產生50％的局限轉導噬菌體的高頻轉導裂解物(HFTlysate)，用這種裂解物去轉導受體菌，就可獲得50％的轉導子，稱高頻轉導。高頻轉導條件：當感染復數(shù)m.o.I>1受體菌變?yōu)樾纬呻p溶源菌

E.coliK12(

/

dgal)，E.coliK12(

dgal)

表示帶有供體菌gal基因的

缺陷噬菌體。

①轉導噬菌體（

dgal）50%+②輔助噬菌體（

）50%再次侵