動物細胞工程概述動物細胞工程動物細胞培養

動物細胞融合單克隆抗體制備應用胚胎移植核移植2.2動物細胞工程單克隆抗體等

動物細胞工程常用的技術動物細胞培養動物細胞核移植動物細胞融合是其他動物細胞工程技術的基礎。為什么要進行動物細胞培養?1.動物細胞培養如何進行細胞培養?2.2.1動物細胞培養和核移植技術

從動物機體中取出相關組織，將它們分散成單個細胞，然后放在適宜的培養基中，讓這些細胞生長和增殖。1.1概念動物細胞培養和核移植技術動物細胞培養就是從動物機體內取出相關的組織，將它分散成單個細胞，然后，放在適宜的培養基中，讓這些細胞生長和增殖。1、選材：

動物胚胎或幼齡動物的組織、器官，它們細胞增殖能力強，分裂旺盛，分化程度低，容易培養。在進行動物細胞培養時，用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質主要是蛋白質。動物細胞培養適宜的PH為7.2—7.4，此環境下胃蛋白酶（2.0）沒有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。2.分散成單個細胞3.動物細胞生長特性：細胞貼壁：

懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。要求：

培養瓶或培養皿的內表面光滑、無毒、易于貼附。細胞的接觸抑制：

當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖，這種現象稱為細胞的接觸抑制。

1.2動物細胞培養過程胚胎或幼齡動物的組織器官細胞懸液10代細胞50細胞剪碎胰蛋白酶洗滌、稀釋、分離原代培養用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質主要是蛋白質。動物細胞培養適宜的PH為7.2—7.4，此環境下胃蛋白酶（2.0）沒有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。比老齡動物的組織細胞增殖能力強，有絲分裂旺盛。分化程度越低，繁殖能力越強，越容易培養。動物細胞培養不能最終培養成生物體細胞增殖緩慢，核型可能變化動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質，將細胞網絡起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。貼壁生長接觸抑制10代以內，保持正常二倍體核型傳代培養細胞懸浮液10代細胞50代細胞無限傳代原代培養傳代培養細胞株細胞系原代培養和傳代培養、細胞株和細胞系多數組織細胞固定在表面生長和分裂。隨細胞增多，細胞就會停止分裂增殖動物胚胎或幼齡動物的組織、器官胰蛋白酶剪碎單個細胞加培養液制成細胞懸浮液細胞株細胞系細胞增值無限傳代去掉組織間蛋白動物細胞培養不能最終培養成生物體

多細胞動物和人體的細胞都生活在內環境中，根據你所學的內環境的知識，思考以下問題：1.體外培養細胞時需要提供哪些物質？

2.體外培養的細胞需要什么樣的環境條件？

討論充足營養適宜溫度、PH和氣體環境；無菌無毒環境1.3動物細胞培養的條件（無菌處理和添加抗生素、更換培養液）與體內相同。合成培養基：糖、氨基酸、促生長因子（血清、血漿）、無機鹽、微量元素等（36~37℃、7.2~7.4）（O2、CO2--維持培養液PH）動物細胞培養條件：1、無菌、無毒的環境（添加一定量的抗生素，定期更換培養液）2、營養（葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、動物血清等。）3、溫度和PH

36.5+（-）0.5度,7.2-7.44、氣體環境：

O2和CO2（95%空氣和5%CO2

）保證細胞順利的生長增殖動物細胞培養液的主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。與植物培養基相比其特點是：（1）液體培養基（2）含有動物血清（一）動物細胞培養動物體細胞大都生活在液體的環境細胞的全能性細胞株、細胞系植物體培養結果獲得細胞或細胞產物快速繁殖、培育無病毒植株等培養目的葡萄糖、動物血清蔗糖、植物激素培養基特有成分液體培養基固體培養基培養基性質細胞增殖原理動物細胞培養植物組織培養比較項目植物細胞和動物細胞培養的比較動物細胞培養應用大規模培養生產生物制品（病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體）作為基因工程中的受體細胞培養的動物細胞可以用于檢測有毒物質，判斷某種物質的毒性為治療和預防癌癥及其他疾病提供理論依據二、動物體細胞核移植技術:將動物的一個細胞的細胞核，移入一個已經去掉細胞核的卵母細胞中，使其重組并發育成一個新的胚胎，這個新的胚胎最終發育成動物個體。用核移植的方法得到的動物稱為克隆動物核移植胚胎細胞核移植體細胞核移植（難度高）受體細胞：MⅡ期的卵母細胞電激處理使供體核進入受體卵母細胞構建重組胚胎卵母細胞采集、培養MⅡ期卵母細胞供體牛供體細胞注入去核卵母細胞代孕母?？寺∨ｓw細胞培養去核卵母細胞去核胚胎移植卵細胞Ａ母綿羊Ｂ母綿羊乳腺細胞細胞質細胞核細胞核移植早期胚胎卵裂C母綿羊子宮胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育過程融合后的卵細胞2.2體細胞核移植的過程：思考：1.核移植的受體細胞是什么？處在什么時期？2.通過什么手段激活受體細胞，構建重組胚胎？MⅡ中期卵母細胞誘導方法：物理或化學方法激活受體細胞，完成細胞分裂和發育進程。討論：1.在體細胞的細胞核移植到受體卵母細胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細胞的核？

為使核移植的胚胎或動物的遺傳物質全部來自有重要利用價值的動物提供的體細胞，在供體細胞的細胞核移至受體細胞之前，必須將受體細胞的遺傳物質去掉或將其破壞。

培養的動物細胞一般當傳代至10～50代左右時，部分細胞核型可能會發生變化，其細胞遺傳物質可能會發生突變，而10代以內的細胞一般能保持正常的二倍體核型。因此，在體細胞核移植中，為了保證供體細胞正常的遺傳基礎，通常采用傳代10代以內的細胞。2.用于核移植的供體細胞一般都選用傳代10代以內的細胞，想一想，這是為什么？3.你認為用上述體細胞核移植方法生產的克隆動物，是對體細胞供體動物進行了100%的復制嗎？為什么？絕大部分DNA來自于供體細胞核，但其核外還有少量的DNA，即線粒體中的DNA是來自于受體卵母細胞。此外，即便動物的遺傳基礎完全相同，但動物的一些行為、習性的形成與所處環境有很大關系，核供體動物生活的環境與克隆動物所生活的環境不會完全相同，其形成的行為、習性也不可能和核供體動物完全相同，從這一角度看，克隆動物不會是核供體動物100%的復制。2.3體細胞核移植技術的應用前景：1、在畜牧業中可以加速家畜遺傳改良的進程2、保護瀕危物種3、醫藥衛生領域生產醫用蛋白質及組織器官的移植4、了解胚胎發育和衰老過程；追蹤研究疾病的發展過程和治療疾病克隆動物的研究意義1.克隆動物作為生物反應器，生產醫用蛋白2.改良動物品種3.治療人類疾病，作為供體4.保護瀕危動物體細胞核移植技術存在的問題：許多克隆動物表現出遺傳和生理缺陷，如體型過大，異常肥胖，發育困難，臟器缺陷，免疫失調等。思考與探究2.動物細胞培養要經過脫分化的過程嗎？為什么？動物細胞培養不需經過脫分化過程。因高度分化的動物細胞發育潛能變窄，失去了發育成完整個體的能力，所以，動物細胞也就沒有類似植物組織或細胞培養時的脫分化過程了。要想使培養的動物細胞定向分化，通常采用定向誘導動物干細胞，使其分化成所需要的組織或器官。3.1997年，美國威斯康星州的一個奶牛場有一頭名叫盧辛達（Lucinda）的奶牛，年產奶量為30.8t，創造了世界奶牛產奶量最高新紀錄。目前世界各國高產奶牛場奶牛，年平均產奶量一般為十幾噸，而我國奶牛產奶量年平均水平僅為3～4t。（1）能利用體細胞核移植技術克隆高產奶牛盧辛達嗎？請說明理由?？梢?。盧辛達的產奶量很高，有高產奶的遺傳基礎，利用盧辛達的體細胞克隆的奶牛其遺傳物質基本上全部來自該奶牛，其克隆牛具有高產的遺傳基礎，如果精心培育和飼養，有可能在世界范圍內推廣，克隆牛再與高產的公牛自然繁殖，可得到很多高產的后代，從而加快奶牛改良進程。該克隆牛不能無限制地推廣，其數量不宜過多，尤其是在小范圍內不能無限的繁殖，以避免奶牛群出現近親繁殖而引起種質衰退。（2）如果將克隆高產奶牛盧辛達的任務交給你，你將如何對它進行克??？從盧辛達耳朵（也可用別的組織、器官，耳朵在活體上容易?。┥霞羧∫恍K組織，在體外培養獲得該組織（如軟骨組織）的細胞。從屠宰場取廢棄的牛卵巢，抽取卵母細胞體外培養成熟。用顯微針去除卵母細胞的核，再將耳細胞注入卵母細胞，用電刺激方法使卵母細胞與體細胞融合，這時供體核就進入了受體卵母細胞，再用電刺激或化學物質激活注入了體細胞核的卵母細胞，使其完成減數分裂和發育過程。核移植胚胎在體外短時間培養后，挑選正常卵裂的胚胎植入經同期發情處理的受體母牛體內。4.體細胞核移植技術在研究和應用上還存在什么問題？請你查閱資料，了解這方面的前沿動態。研究方面：克隆動物基因組重新編程的機制尚不清楚，克隆技術效率低，克隆動物畸形率高、死亡率高、易出現早衰等問題。這些問題尚在研究中。應用上：生產克隆動物費用昂貴，距大規模應用還有一定距離。1、在動物細胞培養過程中遺傳物質發生改變的細胞是--------------------（）

A．細胞系B．細胞株

C．原代細胞D．傳代細胞2、動物細胞工程技術的基礎是------（）

A.動物細胞融合B.單克隆抗體

C.胚胎移植D.動物細胞培養

AD3、用于動物細胞培養的組織和細胞大都取自胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織，其主要原因是這樣的組織細胞（）

A.容易產生各種變異

B．具有更強的全能性

C.取材十分方便

D．分裂增殖的能力強D4.動物細胞培養與植物細胞培養的重要區別在于------------------------------（）

A.培養基不同；

B.動物細胞培養不需要在無菌條件下進行；

C.動物細胞可以傳代培養，而植物細胞不能；

D.動物細胞能夠大量培養，而植物細胞只能培養成植株。A動物細胞融合仙臺病毒喪失感染活性（不感染細胞）保留融合活性（誘導細胞融合）紫外線物理法化學法生物法融合過程示意圖單克隆抗體的概念單:單個細胞克隆:無性繁殖抗體:化學性質單一、特異性強實驗目的:制備單克隆抗體.實驗原理：B淋巴細胞能產生抗體，骨髓瘤細胞能無限增殖，雜交瘤細胞既能產生抗體又能無限增殖。實驗材料：小白鼠實驗器材：培養皿、針筒等等。實驗過程：如下頁根據阿根廷科學家米爾斯坦和德國科學家柯勒設計的實驗方案:單克隆抗體制備過程單克隆抗體的應用主要用于疾病的診斷、治療和預防。與常規抗體相比，具有特異性強、靈敏度高的優點。如；各種癌癥、肝炎病毒、SARS病毒、細菌及血吸蟲等數百種疾病的診斷；在疾病治療方面，單克隆抗體猶如人體衛士，能識別“自己”與“異己”，一旦發現致病因素便與之結合將其殺死。若在單抗上帶上抗癌藥物制成“生物導彈”，將藥物定向帶到癌細胞所在部位，既消滅了癌細胞又不會傷害健康細胞。植物細胞工程與動物細胞工程的比較植物細胞工程的技術手段主要有植物組織培養和植物體細胞雜交，其中植物組織培養是植物細胞工程的基礎；動物細胞工程的技術手段主要有動物細胞培養、動物細胞融合、單克隆抗體的制備、胚胎移植和核移植，其中動物細胞培養是動物細胞工程的基礎。動、植物細胞工程的原理和技術手段有相似之點，但也存在不同之處，現對兩者的主要技術手段加以分析比較：一、植物細胞的組織培養與動物細胞培養

1．過程⑴植物組織培養再分化激素、光

離體的植物器官、組織或細胞脫分化營養物、激素愈傷組織根、芽植物體胚狀體人工種子人造胚乳和種皮發育動物胚胎或幼齡動物器官、組織⑵動物細胞培養剪碎、胰蛋白酶單個細胞動物血清、葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素細胞懸浮液

細胞懸浮液10代細胞50代細胞……原代培養傳代培養

細胞株細胞系植物組織培養和動物細胞培養的比較比較項目植物組織培養動物細胞培養原理植物細胞的全能性

細胞增殖培養基性質固體或半固體培養基，包括礦質元素、蔗糖、維生素、有機添加物、植物激素等

液體培養基，包括無機鹽、葡萄糖、維生素、氨基酸、動物血清等

培養基特有成分蔗糖植物激素葡萄糖動物血清培養結果植物體細胞株、細胞系培養目的①快速繁殖名貴花卉和果樹②培養無病毒植株、轉基因植物③大規模生產細胞產品如藥物、食品添加劑、香料、色素等

①生產蛋白質制品如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等②檢測有毒物質③研究藥理病理④移植治療

相同點

①都需要人工條件下的無菌操作，無菌培養②都需要適宜的溫度、pH等條件

二、植物體細胞雜交與動物細胞融合（單克隆抗體制備）1．過程⑴植物體細胞雜交：⑵動物細胞融合（單克隆抗體制備）：2．植物體細胞雜交與動物細胞融合（單克隆抗體制備）比較比較項目植物體細胞雜交動物細胞融合（單克隆抗體制備）原理細胞膜的流動性、細胞的全能性細胞膜的流動性、細胞增殖融合前處理酶解法除細胞壁（纖維素酶和果膠酶）注射特定抗原免疫處理正常小鼠促融方法物理法：離心、振動、電刺激等化學法：聚乙二醇（PEG）物理法、化學法與植物原生質體融合促融方法相同生物法：滅活的病毒過程第一步：用酶解法制備原生質體第二步：用物理法或化學法促使原生質體融合第三步：雜種細胞的篩選與培養第四步：雜種植株誘導和鑒定第一步：正常小鼠免疫處理第二步：用物理法、化學法或生物法促使動物細胞融合第三步：雜交瘤細胞篩選與培養第四步：單克隆抗體的提純意義和用途①克服遠源雜交不親合的障礙，大大擴展雜交的親本組合范圍②克服有性雜交的母系遺傳，可獲得細胞質基因的雜合子，研究細胞質遺傳①制備單克隆抗體②診斷、治療、預防疾病。例如：a.腫瘤定位診斷，放射性抗體→腫瘤b.生物導彈治療，抗體—抗癌藥物→腫瘤三、胚胎移植與核移植

1．哺乳動物的胚胎移植：指在體外完成受精作用和早期的胚胎發育，然后將早期的胚胎轉移到母體的子宮發育。試管動物是指的體外受精和早期胚胎發育生物。試管牛的培育過程如下圖所示：

2．核移植：核移植是動物克隆技術的基礎。鯉鯽移核魚的培育過程如下圖所示：（兼有鯉魚、鯽魚特點，具有正常生殖能力）

鯉魚：囊胚細胞核鯽魚：去核未受精卵值得注意的是：克隆多莉羊是把來自高度分化的體細胞的核移植到去核的卵細胞中形成的重組細胞培育而來的；

動物排卵體外受精胚胎母牛子宮試管牛（激素處理）（激素處理）重組細胞→鯉鯽移核魚【例釋1】某同學在學習“細胞工程”時，列表比較了動植物細胞工