HIV抗體檢測原理和方法石嘴山市疾控中心艾滋病初篩中心試驗室HIV感染的試驗室檢測常用HIV病原學檢測方法:病毒分別抗原檢測核酸檢測〔cDNA測定-PCR、RNA測定-病毒載量〕其他方法：逆轉錄酶測定、原位雜交常用HIV抗體檢測方法:ELISA快速HIV檢測免疫印記法〔WesternBlot〕其他方法：免疫熒光法〔IFA〕、放射免疫沉淀試驗抗原檢測的目的〔一〕檢測早期感染，縮短窗口期〔可提前1-2周〕HIV-P24抗原陽性僅作為HIV感染窗口期的幫助診斷依據，不能據此確診〔二〕新生兒的感染

嬰幼兒HIV抗體陽性不能用于診斷感染HIV嬰幼兒體內從母親得到的HIV抗體持續存在時間最長不超過18個月。在18月齡以前可以用多種不同的非抗體依靠性的檢驗方法對新生兒HIV感染進展幫助診斷，包括：HIVP24抗原檢測、病毒分別培育、RNA或DNA測定。18月齡以前嬰幼兒感染HIV診斷要結合臨床表現和試驗室綜合診斷。抗體檢測的目的輸血和移植安全〔為了承受者的安全〕監測(為了知曉人群流行狀況)臨床HIV疾病的診斷(為了知曉個體感染狀況〕為了到達以上的某個目的的HIV檢測可能不適合其他目的，比方輸血效勞的檢測不適合臨床診斷HIV感染HIV抗體檢測

HIV抗體檢測分為篩查試驗〔包括初篩和復檢〕和確認試驗〔WB)。〔一〕檢測試劑篩查試劑必需是經國家食品藥品監視治理局注冊批準、批檢合格、臨床評估質量優良、在有效期內的試劑。目前常用的篩查試劑有酶聯免疫、顆粒凝集和其它快速診斷試劑。采供血機構進展血液篩查應承受HIV-1/2混合型酶聯免疫試劑。自采自供血的單位必需進展HIV抗體檢測。〔二〕篩查方法1.常用的篩查方法是酶聯免疫試驗〔ELISA〕目前國內外主要使用第三代〔雙抗原夾心法〕試劑，少數使用其次代試劑。血源篩查仍以第三代ELISA為主，國際上有些國家和地區已將線性免疫酶測定〔第四代ELISA試劑〕用于血源篩查。第四代ELISA試劑是最近進展起來的HIV抗原抗體聯合測定試劑，可同時檢測P24抗原和抗HIV-1/2抗體。與第三代抗HIV-1/2試劑相比，檢出時間提前了4-9.1d。其優點在于能同時檢測抗原抗體，降低血源篩查的剩余危急度。酶聯免疫吸附試驗

EnzymelinkedimmunosorbentassayELISA的原理ELISA的根底是抗原或抗體的固相化及抗體或抗原的酶標記。結合在固相載體外表的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保存其免疫學活性，又保存酶的活性。在測定時，受檢標本〔測定其中的抗體或抗原〕與固相載體外表的抗原或抗體起反響。ELISA的原理用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再參與酶標記的抗原或抗體，也通過反響而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈確定的比例。ELISA的原理參與酶反響的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可依據呈色的深淺進展定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反響的結果，使測定方法到達很高的敏感度。ELISA的類型

雙抗原夾心法測抗體

雙抗體夾心法測抗原

間接法測抗體

競爭法、捕獲包被法等雙抗原夾心法測抗體將特異性抗原與固相載體聯結，形成固相抗原。加受檢標本，保溫反響。標本中的抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。加酶標抗原，保溫反響。固相免疫復合物上的抗體與酶標抗原結合，徹底洗滌未結合的酶標抗原。加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色，測知標本中抗體的量。包被了HIV抗原的檢測板患者的抗體酶顯色劑+ve-ve酶聯免疫吸附試驗HIV

檢測的介紹ELISAELISA板質控陽性陰性?結果IntroductiontoHIVTestingModule1SubModule3–PPT022、快速檢測〔RT〕及其它檢測隨著對HIV感染者和AIDS病人抗逆轉錄病毒治療的進展，及對無病癥HIV感染者供給自愿詢問檢測〔VCT〕的迫切需求，簡便、快速的HIV檢測方法被廣泛應用。常用的主要有以下幾種：〔1〕明膠顆粒凝集試驗〔PA〕：PA是HIV血清抗體檢測的一種簡便方法，是將HIV抗原致敏明膠顆粒作為載體，與待檢樣品作用，混勻后保溫〔一般為室溫〕。當待檢樣品含有HIV抗體時，經抗原致敏的明膠顆粒與抗體發生抗原-抗體反響，依據明膠顆粒在孔中的凝集狀況判讀結果。PA試劑有兩種，HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA試劑〔AFDHIV-1/2PA〕，已經我國食品藥品監視治理局〔SFDA〕注冊批準；HIV-1、HIV-2抗原分別致敏的PA試劑〔SERODIA-HIV-1/2〕可初步區分HIV-1型和HIV-2型，目前我國尚未引進。PA原理示意圖〔PA〕檢測結果的判定〔2〕斑點EIA或稱斑點ELISA〔dot-EIA〕：以硝酸纖維膜為載體，將HIV抗原滴在膜上成點狀，即為固相抗原。加血清樣品作用，以后步驟同ELISA。陽性結果在膜上抗原部位顯示出有色斑點。反響時間在10min以內，使用抗原量少。〔3〕斑點免疫膠體金〔或膠體硒〕快速試驗金標紙條承受雙抗原夾心法免疫測定原理，選擇經純化的基因工程制備的gp36、gp41、p24抗原作為包被抗原和gp41、gp36基因工程抗原和p24合成肽作為膠體金結合抗原。當待檢標本中含有HIV抗體時，先和金標記抗原結合，由于層析作用反響復合物沿硝酸纖維膜向前移動，當遇到包被抗原時，形成Ag-Ab-Ag-Au復合物而富集在包被線上，形成紅色沉淀線。同時在包被膜上還有一條質控線比照，故當有兩條紅線時判為陽性，只有一條紅線時，判為陰性。

金標法試劑試劑穩定，可室溫長期保存。試驗時不需任何設備，快速、簡便、特異性較好，敏感性約相當于中度敏感的ELISA，適用于應急檢測、門診急診個體檢測。目前已有在國內被SFDA批準注冊的國外進口試劑和國內產品。一般可在1030min內判讀結果。無反響反響無意義無意義無意義無意義金標法〔膠體硒法〕結果判定〔4〕艾滋病唾液檢測卡：在硝酸纖維膜上包被人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，可同時檢測含在唾液中的HIV-1/HIV-2抗體，原理為酶免疫間接法。主要檢測唾液中的HIVIgA與IgG抗體，敏感性特異性與ELISA相近，可避開靜脈穿刺。但樣品預處理時間長且售價較高。以唾液為樣品測定HIV抗體的ELISA、免疫印跡法〔WB〕試劑已經美國FDA批準。〔5〕其它快速篩查試驗方法：家庭HIV檢測〔HomeAccessSystem〕等。快速HIV檢測與常規HIV檢測快速* 平均45分鐘 〔10分鐘－2.5小時〕常規 平均3.5小時 〔94分鐘－16小時〕*一般不要特殊設備，試劑可不用冰箱存放快速試劑的局限性一般不用于血液篩查〔除5年行動準備〕有確定的假陽性反響，如作為臨床診斷，要復檢和確認有確定的假陰性反響〔尤其暴露時間<3個月〕隨訪檢測〔解釋檢測前后詢問必要性〕〔三〕篩查試驗步驟依據檢測目的選用符合要求的篩查試劑對樣品進展初篩和重復檢測〔復檢〕初篩試驗：以第三代ELISA〔雙抗原夾心法〕梅里埃試劑為例。〔1〕試驗預備：試驗開頭前將試劑和樣品放置在室溫(1823℃),按試驗室SOP做好試劑預備。磷酸鹽緩沖液：假設液體內有結晶,應放置在37℃直至溶解，用蒸餾水1：25稀釋濃縮液，4℃保存2周。TMB底物液：使用前配制，TMB液和過氧化脲液等量混勻。1M硫酸終止液：85ml蒸餾水中參與5ml濃硫酸。備好試劑盒、待檢樣品和外部比照質控血清后，按試劑盒說明書以及質控和安全防護要求進展篩查檢測。〔2〕試驗操作①裝好所需使用數目的孔條,每孔均參與100μl樣品稀釋液。設3個陰性比照孔，1個HIV-1陽性比照孔，假設需要可再設1個HIV-2陽性比照孔。②每孔參與50μl待檢樣品及比照〔比照要后加〕，未用孔用樣品稀釋液加滿以溶解結合物球，以免堵塞洗板機孔。可震搖15S，37±2℃孵育60±5min。③置洗板機上洗滌6遍〔用洗液將反響孔完全加滿,靜置3060S,共洗滌6遍，洗完后孔上方及底部不應殘存液體.〕。④每孔參與100μl底物液，勿攪動，室溫避光孵育30±2min。⑤每孔參與100μl1M硫酸終止反響，充分混勻。⑥在2h內置于酶標儀讀數，單波長450nm，或雙波長450/630nm測OD值。〔3〕試驗結果①陰性比照〔NC〕，HIV-1陽性比照〔PC1〕，HIV-2陽性比照〔PC2〕NC必需＜0.25方可用，排解NC≥0.25的值，計算NC平均值。NC界限范圍：0.6倍NC均值＜NC＜1.4倍NC均值。②符合以下條件的試驗成立：兩個以上的NC可用。PC1-NC均值≥0.4，PC2-NC均值≥0.4③Cutoff值=陰性比照均值+0.100小于Cutoff為陰性，大于或等于Cutoff為陽性〔4〕報告：對呈陰性反響的樣品，可由實施檢測的試驗室出具HIV抗體陰性報告；對呈陽性反響的樣品，須進展復檢，不能出陽性報告。〔四〕檢測要點1、篩查試驗陽性不能出陽性報告2、嚴格依據試劑說明書操作，不得擅自更改。3、留意防止穿插污染。4、嚴格遵守試驗室標準操作規程〔SOP〕。〔五〕檢測程序及流程圖1、篩查試驗標本驗收合格后，用篩查試劑進展檢測，如呈陰性反響，報告HIV抗體陰性；對呈陽性反響的標本，須進展重復檢測。2、重復檢測

對篩查呈陽性反響的標本用原有試劑和另外一種不同原理或不同廠家的試劑重復檢測。如兩種試劑復測均呈陰性反響，則報告HIV抗體陰性；如均呈陽性反響，或一陰一陽，需送艾滋病確認試驗室進