10/18/20231GEHBGULAM第四章

基因工程載體vectors10/18/20232GEHBGULAM10/18/20233GEHBGULAM在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進入受體細胞的DNA分子叫載體。1.載體

（Vectors）10/18/20234GEHBGULAM

（1）在宿主細胞內能獨立復制。

（2）有選擇性標記。（3）有一段多克隆位點。2.基因工程對載體

的要求外源DNA插入其中不影響載體的復制。（4）分子量小，拷貝數多。（5）容易從宿主細胞中分離純化。10/18/20235GEHBGULAM

基因工程中常用的載體(來源)有5類：

3.載體的種類質粒（plasmid）單鏈DNA噬菌體M13

噬菌體的衍生物柯斯質粒（cosmid）

動物病毒（virus）

10/18/20236GEHBGULAM功能克隆載體:

克隆一個基因或DNA片斷表達載體:

用于一個基因的蛋白表達整合載體:

把一個基因插入到染色體組中10/18/20237GEHBGULAM質粒*受體細胞結構插入片斷舉例E.coli環狀〈8*pUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，Λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環狀≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環狀100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細胞線性染色體〉1000kb病毒載體動物細胞環狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細胞和細菌環狀pSVK3質粒，PBV,Ti質粒載體的種類和特征10/18/20238GEHBGULAM第一節

質粒載體

一、質粒（plasmid）

是獨立于染色體以外的能自主復制的雙鏈閉合環狀DNA分子。存在于細菌、霉菌、藍藻、酵母等細胞中。10/18/20239GEHBGULAM大腸桿菌的質粒10/18/202310GEHBGULAM克隆的質粒載體允許外源的DNA插入，儲存。主要是DNA水平上的操作?；虮磉_的質粒載體允許外源DNA的插入、儲存和表達。10/18/202311GEHBGULAM（1）分子小1.質粒的一般生物學特性1—200kb（2）編碼基因少2—3個中等大小的蛋白質。（3）環形狀雙鏈環狀DNA。（酵母的“殺傷質粒”是RNA）。如抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細菌一些額外的特性（非必須）。10/18/202312GEHBGULAM（4）質粒的空間構型①共價閉合環狀DNA（cccDNA)呈超螺旋（SC）（supercoil）CovalentclosecircularDNA10/18/202313GEHBGULAM③線形DNA（

linear，lDNA）一條鏈上有一至數個缺口。②開環DNA（

opencircular，ocDNA）10/18/202314GEHBGULAM（5）質?？臻g構型與電泳速率同一質粒盡管分子量相同，不同的構型電泳遷移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。SCOCL10/18/202315GEHBGULAMLOCSC10/18/202316GEHBGULAM二、質粒的類型在大腸桿菌中的質粒，可以分為：接合型質粒:非接合型質粒能自我轉移不能自我轉移10/18/202317GEHBGULAM除了帶有自我復制所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細菌配對和質粒接合轉移的基因。如：F質粒（性質粒、或F因子）：甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉移到原先不存在該質粒的受體菌中。又叫自我轉移型質粒。1.接合型質粒：不符合基因工程的安全要求。10/18/202318GEHBGULAM大腸桿菌接合（conjunction）10/18/202319GEHBGULAM2.非接合型質粒雖然帶有自我復制所必需的遺傳信息，但失去了控制細菌配對和質粒接合轉移的基因，因此不能從一個細胞轉移到另一個細胞。（1）R質粒（抗性質粒）帶有一種或數種抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀（resistance）。符合基因工程的安全要求。10/18/202320GEHBGULAM10/18/202321GEHBGULAM帶有控制大腸桿菌素（colicin）合成的基因。（2）Col質粒大腸桿菌素對不帶Col質粒的大腸桿菌有毒。Col質?；騌質粒如果帶有轉移基因，也可以成為接合型質粒。10/18/202322GEHBGULAM三、質粒的復制類型1.嚴緊型質粒（stringentplasmid）拷貝數少，只有1—3份拷貝。2.松弛型質粒（relaxedplasmid）拷貝數多，有10—60份拷貝。（接合型質粒分子量大，一般屬嚴緊型）。（非接合型質粒分子量小，一般屬松弛型）。10/18/202323GEHBGULAM（1）分子量大，拷貝數低四、質粒載體的構建1.天然質粒的局限性第一個用于基因克隆的天然質粒pSC101，分子長

9.1kb。但只有一個EcoRI切點充當克隆位點，Tetr作為篩選標志。10/18/202324GEHBGULAM10/18/202325GEHBGULAMColE1質粒的篩選標志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。（2）篩選標志不理想可以通過插入失活篩選。但細菌群體容易自發突變出抗colicinE1的細胞…….colicinE1能殺死不含ColE1質粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位點EcoRI正好位于這個基因的內部。10/18/202326GEHBGULAMColE110/18/202327GEHBGULAM（1）

具有復制起點（ORI）2.質粒載體必須具備的基本條件（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性內切酶的單一位點是篩選的標志。理想的載體應該有兩種抗菌素抗性基因。用來插入外源DNA片斷。且插入后不影響復制功能。10/18/202328GEHBGULAM（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數。10/18/202329GEHBGULAMAtypicalplasmidvector.

Itcontainsapolylinkerwhichcanrecognizeseveraldifferentrestrictionenzymes,anampicillin-resistancegene(ampr)forselectiveamplification,andareplicationorigin(ORI)forproliferationinthehostcell.

10/18/202330GEHBGULAM氨芐青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性

（Kanr）四環素抗性

（Tetr）鏈霉素抗性

（Strr）氯霉素抗性

（Cmlr）3.質粒的選擇標記及其工作原理（1）選擇標記①抗菌素抗性絕大多數質粒載體都是用抗菌素抗性標記：10/18/202331GEHBGULAM

常用抗菌素的抗性工作原理i）氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）青霉素的衍生物。通過干擾細菌細胞壁合成的末端反應，殺死生長的細菌。a）抑菌原理b）細菌抗性原理Ampr基因編碼

-內酰胺酶，特異地切割氨芐青霉素的

-內酰胺環。10/18/202332GEHBGULAMii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）通過與50S核糖體亞基結合，干擾細胞蛋白質的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長的細菌。b）細菌抗性原理Cmlr

編碼乙酰轉移酶，特異地使氯霉素乙?；Щ?。a）抑菌原理10/18/202333GEHBGULAMa）殺菌原理iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）通過與70S核糖體結合，導致mRNA發生錯讀。殺死細菌。b）細菌抗性原理Kanr

編碼的氨基糖苷磷酸轉移酶，對卡那霉素進行修飾，阻斷其與核糖體結合作用。10/18/202334GEHBGULAMiv）鏈霉素（Streptomycin，Str）a）殺菌原理通過與30S核糖體亞基結合，導致mRNA錯譯。殺死細菌。b）細菌抗性原理Strr

編碼一種氨基糖苷磷酸轉移酶對鏈霉素進行修飾，阻斷其與核糖體30S亞基結合作用。10/18/202335GEHBGULAMv）四環素（Tetracycline，Tet）b）細菌抗性原理a）抑菌原理通過與30S核糖體亞基結合，干擾細胞蛋白質的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長的細菌。Tetr編碼特異性蛋白質，對細菌的膜結構進行修飾，組止四環素通過細胞膜進入細菌細胞內。10/18/202336GEHBGULAM10/18/202337GEHBGULAM10/18/202338GEHBGULAM②

遺傳標記使受體菌發生遺傳性狀的改變的基因。10/18/202339GEHBGULAM10/18/202340GEHBGULAM當帶有抗菌素抗性基因的載體進入受體菌后，受體菌才能生長。不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含有抗菌素的培養基（選擇培養基）中生長。（2）抗菌素選擇原理活死抗性基因抗菌素10/18/202341GEHBGULAM4.人工構建的質粒載體的類型（1）高拷貝數的質粒載體ColE1、pMB1派生質粒具有高拷貝數的特點。而且在沒有菌體蛋白質合成的條件下（蛋白質合成抑制劑，氯霉素等存在下）仍能復制，達到每個細胞的拷貝數1000—3000個！適合大量增殖克隆基因、或需要表達大量的基因產物。10/18/202342GEHBGULAM（2）低拷貝數的質粒載體

但有特殊用途:由pSC101派生來的載體特點是分子量小，拷貝數低。當有些被克隆的基因的表達產物過多時會嚴重地影響寄主菌的正常代謝活動，導致寄主菌死亡時，就需要低拷貝的載體。pLG338、pLG339、pHSG415等不適合大量擴增DNA用。10/18/202343GEHBGULAM（3）失控的質粒載體這是一類溫度敏感型復制控制質粒。溫度低（低于37oC），拷貝數很少；溫度增加（>40oC）時，拷貝數會很快增加到1000個以上。如pBEU1、pBEU2。runawayplasmidvectors1979年B.E.Uhlin等構建。10/18/202344GEHBGULAM（4）

插入失活型質粒載體載體的克隆位點位于其某一個選擇性標記基因內部。如pDF41、pDF42、pBR329?？咕乜剐酝庠碊NA無抗菌素抗性10/18/202345GEHBGULAM（5）正選擇的質粒載體如pUR2、pTR262等。只有帶有選擇標記基因的轉化菌細胞才能在選擇培養基上生長。直接選擇轉化后的細胞。目前通用的絕大部分質粒載體都是正選擇載體。Directselectionvectors10/18/202346GEHBGULAM（6）

表達型質粒載體主要用來使外源基因表達出蛋白質產物。如果在大腸桿菌里表達，必須把所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉錄—翻譯信號控制之下。注意啟動子的性質，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。10/18/202347GEHBGULAM復制起始點ORI、選擇標記、多克隆位點MCS2）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因I操縱基因O啟動基因P核糖體結合位點序列（SD）轉錄終止信號區。1）普通載體元件①表達載體的結構10/18/202348GEHBGULAM10/18/202349GEHBGULAM五、經典的大腸桿菌質粒載體1.pSC101第一個成功地用于克隆實驗的大腸桿菌質粒載體。（1）類型天然質粒，屬低拷貝型。（2）長度9.09kb。（3）選擇標記四環素抗性Tetr10/18/202350GEHBGULAM6個克隆位點：EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI主要使用EcoRI。（其中HindIII、BamHI、SalI3個位于選擇標記Tetr的內部）（4）克隆位點10/18/202351GEHBGULAM10/18/202352GEHBGULAM2.ColE1（1）類型天然質粒，屬高拷貝型。（2）長度6.3kb。（3）選擇標記大腸桿菌素（colicin）E1和對E1免疫的基因（immE1）特點是在培養基中加入氯霉素抑制細菌蛋白質合成后，質粒仍然能復制達到每個細胞1000-3000拷貝之多！10/18/202353GEHBGULAM①colicinE1基因的結構ceaimmkil結構基因免疫基因溶菌基因②殺死不含有ColE1細菌的原因cea+kil基因產物③

不被其他細菌的colicinE1所殺死的原因imm基因10/18/202354GEHBGULAMEcoRI位于E1內部，插入外源DNA會導致E1失活，使受體菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表現出對E1免疫型（ImmE1+）。EcoRI（4）克隆位點ColicinE1外源DNA無Colicin10/18/202355GEHBGULAM用對外源colicinE1的免疫性和自身不能合成colicinE1作選擇，操作非常繁雜。對colicinE1敏感的細菌群體中自發突變產生抗colicinE1的頻率很高?。?）ColE1的選擇缺陷ColE1抗colicinE1殺ColE1-仍抗colicinE1不殺ColE1-插入片斷ColE110/18/202356GEHBGULAM10/18/202357GEHBGULAMpSP2124質粒的Ampr基因3.pBR322：（1）元件來源F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工構建載體。①復制起點

oripMB1系列（來源于ColE1）的高拷貝型復制起點②

Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。10/18/202358GEHBGULAM（2）長度4363bp（3）選擇標記氨芐青霉素和四環素抗性。（4）克隆位點其中9個會導致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3個會導致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24個克隆位點。10/18/202359GEHBGULAM10/18/202360GEHBGULAM（5）pBR322的優點①雙抗菌素抗性選擇標記

插入失活，分兩次先后選擇：沒有獲得載體的寄主細胞

在Amp或Tet中都死亡。獲得載體的寄主細胞

在Amp或Tet其中之一中死亡。10/18/202361GEHBGULAM外源基因

BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因

PstITet中存活但在Amp中死亡10/18/202362GEHBGULAM氯霉素擴增之后，每個細胞可達1000~3000copy④安全失去了轉移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過接合轉移。③

高拷貝數②分子小，克隆能力大載體越小越好。>10kb的DNA在純化過程中容易斷裂。10/18/202363GEHBGULAM保留了轉移蛋白（mob）的作用位點。（6）pBR322的缺點能夠被ColK質粒編碼的mob蛋白識別，如果再有F質粒的參與，就有可能轉移！10/18/202364GEHBGULAM①刪除mob識別位點（如質粒pBR327、pAT153等）。pAT153：從pBR322上切去HaeII片斷，既除去了mob識別位點，又增加質粒的拷貝數。（7）PBR322的改進10/18/202365GEHBGULAMpBR325：在pBR322位點上接入一段來自噬菌體PICm的HaeII酶切片斷（帶有氯霉素抗性基因cmlr）。cmlr上也帶一個EcoRI位點。使EcoRI也成為插入失活型位點。②

改造EcoRI位點10/18/202366GEHBGULAM4.pUC系列UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基礎上改造而成。屬正選擇載體。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC1910/18/202367GEHBGULAM①

復制起點pBR322的

ori但其上失去了克隆位點。②

Ampr基因（1）元件來源③lacZ的啟動子大腸桿菌④lacZ’基因大腸桿菌lacZ的

-肽鏈序列，

是LacZ的氨基端片斷。pBR322的Ampr基因10/18/202368GEHBGULAM（2）長度約2.7kb（3）克隆位點10個連續的單一限制酶切位點，位于lacZ’基因的5’端。10/18/202369GEHBGULAMpUC18/1910/18/202370GEHBGULAM10/18/202371GEHBGULAMAmpicillin抗性和lacZ的

肽互補（藍白斑）相結合。（4）選擇標記藍白斑選擇原理：①Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-

-D-galactoside）10/18/202372GEHBGULAM

-半乳糖苷酶能把無色的化合物X－gal分解成半乳糖和一個深藍色的物質5-溴-4-氯靛藍。X－gal半乳糖5-溴-4-氯靛藍

-半乳糖苷酶②

-半乳糖苷酶X-gal顯色反應：10/18/202373GEHBGULAM③lacZ的

肽互補1）

-肽（

lacZ’

）：

-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片斷（11-41氨基酸）。lacZ只有在4聚體的狀態下才有功能.C端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aa4聚體10/18/202374GEHBGULAM2）受體菌lacZ突變（lacZ?M15）受體菌基因組的

-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失

肽），不能形成4聚體的活性酶，不能分解X－gal受體菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a10/18/202375GEHBGULAMpUC質粒載體上的lacZ’

編碼

肽與這個缺失突變的

-半乳糖苷酶“互補”，使它能形成4聚體。又能分解X－gal。產生藍色物質。C端大部分N端的11-41aapUClacZ’

受體菌lacZ?3）載體lacZ’與

互補10/18/202376GEHBGULAM4）

互補的插入失活pUC載體上LacZ’的5’端有一段多克隆位點(MCS)區，本身雖不干擾LacZ’的合成，但插入外源基因就會阻止LacZ’的合成。不能互補。lacZ’

5’

3’

肽移碼突變lacZ’

5’

3’

肽不互補互補MCS外源DNA10/18/202377GEHBGULAM④IPTG的誘導作用IPTG(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside)是乳糖的類似物。能誘導lac操縱子的啟動轉錄，使受體菌基因組中的lacZ的C端部分和載體的lacZ’

肽都表達。從而互補。但載體MCS上插入外源DNA后，仍然不能產生

肽！IPTG10/18/202378GEHBGULAM通過看培養皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。MCS無插入時，互補，藍菌斑。MCS有插入時，不互補，白菌斑。IPTG誘導的結果：10/18/202379GEHBGULAM無質粒的受體菌

-半乳糖苷酶部分缺失，不能分解Xgal；無抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養基上培養無菌斑生長質粒轉化的受體菌

-半乳糖苷酶的缺失被載體產物

互補，能分解Xgal。且有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養基上培養有藍色菌斑生長帶外源DNA插入的質粒轉化的受體菌載體產物失活，不能互補

-半乳糖苷酶的缺失。不能分解Xgal，但有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養基上培養有白色菌斑生長10/18/202380GEHBGULAM10/18/202381GEHBGULAM（5）pUC系列載體的優點①更小的分子量：如pUC18為2682bp，pUC8為2750bp。②選擇方便X-gal顯色、抗菌素雙重直接選擇。③克隆便利具有多克隆位點（MCS），使有兩個不同粘性末端的外源DNA方便地插入。④測序方便10/18/202382GEHBGULAMpUC的MCS與M13噬菌體載體的MCS完全相同，便于把外源DNA轉移到M13載體上測序。M13mp18的多克隆位點10/18/202383GEHBGULAM六、其它質粒載體1.pGEM-3Z由pUC派生而來。與pUC的主要區別是在MCS的兩側分別加了一個噬菌體啟動子T7和SP6。T7啟動子SP6啟動子MCSlacZ’

Amprori可被T7和SP6的RNA聚合酶識別轉錄。10/18/202384GEHBGULAM①

如果加入純化的T7或SP6RNA聚合酶，在試管里就可以轉錄mRNA②外源基因正接反接都可以轉錄。③MCS與pUC18的完全一樣。2.pGEM-4Z：與pGEM-3Z相同，只是T7啟動子和SP6啟動子的位置互換。（1）pGEM-3Z的特點：10/18/202385GEHBGULAM3.穿梭質粒載體（1）穿梭質粒載體的結構人工構建的、具有兩種不同復制起點和選擇標記、可以在兩種不同的寄主細胞中存活和復制的質粒載體。（shuttleplasmidvectors）10/18/202386GEHBGULAMYeast復制起點E.coli復制起點E.coli選擇標記Yeast選擇標記MCS大腸桿菌

枯草桿菌穿梭載體大腸桿菌

釀酒酵母穿梭載體

大腸桿菌

動物細胞穿梭載體（2）常用的穿梭質粒載體10/18/202387GEHBGULAM（3）穿梭載體的優點②也能利用其它細胞系統（酵母、枯草桿菌、哺乳動物細胞等）進行基因表達。③可以自如地在兩種不同寄主細胞之間來回轉移基因?？寺?、構建表達E.coliAnimalcell①

利用大腸桿菌進行基因克隆、表達10/18/202388GEHBGULAM10/18/202389GEHBGULAM10/18/202390GEHBGULAM七、質粒載體的不穩定性1.質粒穩定遺傳必須的兩個條件：（1）每個世代、每個質粒至少要復制一次（2）在細胞分裂時，復制過的質粒必須分

配到兩個子細胞中。10/18/202391GEHBGULAM有主動分配和隨機分配兩種假說。（1）主動分配天然質粒。2.質粒分配方式具有一個控制質?？截惙峙涞墓δ軈^（Par），能以主動分配的方式確保質粒能正確分配到兩個子細胞中。10/18/202392GEHBGULAM人工構建的質粒載體缺失了par區，只能以隨機分配方式分到子細胞中。人工質粒。（一般情況下也能保證質粒的穩定遺傳）（2）隨機分配但在一定條件下會出現質粒丟失的現象。10/18/202393GEHBGULAM在寄主菌細胞分裂的過程中，有一個細胞沒有獲得質粒拷貝，并最終繁殖成無質粒的優勢群體。3.分離的不穩定性（segregationinstability）10/18/202394GEHBGULAM4.結構的不穩定性（structuralinstability）寄主基因組的IS序列插入質粒、質粒間的同源重組等都會使質粒發生插入或缺失。ISdimer重組10/18/202395GEHBGULAM（1）新陳代謝負荷：5.影響質粒載體穩定性的主要因素使寄主細胞生長減緩：質粒載體使寄主的世代時間延長約15%。①復制負荷減緩的程度與質粒的分子量成正比。②轉錄和翻譯負荷丟失質粒的細胞反而會成為優勢群體！10/18/202396GEHBGULAM每個菌體中所擁有的質?？截悢挡煌耆嗤?，稱差度。（2）質粒載體的拷貝數低拷貝數的質粒的差度小，遺傳穩定。差度（variance）：是產生無質粒細胞的重要原因。高拷貝數的質粒載體差度大，擁有少量拷貝數的菌體多，發生丟失的可能性大。10/18/202397GEHBGULAM野生型E.coli中，質粒在寄主的重組酶作用下會發生重組形成二聚體質粒。（3）寄主菌的重組體系二聚體災難（dimercatastrophe）：含有大分子量插入片斷的質粒載體普遍能形成質粒寡聚體。二聚體質粒的復制速度是單體的二倍！導致質粒失控。10/18/202398GEHBGULAM第二節

噬菌體載體

噬菌體是一類細菌病毒（Bacteriophage）。一、噬菌體的一般特性結構：蛋白質外殼內包裹著DNA（雙鏈、單鏈、線性、環狀等）。10/18/202399GEHBGULAM10/18/2023100GEHBGULAMsinglelinearDNA(about182,000bp)T2GenomicDNA10/18/2023101GEHBGULAMT4Bacteriophage10/18/2023102GEHBGULAM分為兩種：1.溶菌周期二、噬菌體的生活周期感染細菌后立即在菌體內復制和合成蛋白質外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導致細菌細胞解體，釋放出大量子代噬菌體。烈性噬菌體（virulentphage)10/18/2023103GEHBGULAM10/18/2023104GEHBGULAM10/18/2023105GEHBGULAM2.溶原周期感染細菌后，將自己的DNA整合到細菌的染色體DNA中。形成這一過程稱為溶源化（lysogenization)。整合到細菌染色體的噬菌體DNA稱為原噬菌體，隨細菌的染色體復制而復制。溫和噬菌體（temperatephage)原噬菌體（prophage)：10/18/2023106GEHBGULAM10/18/2023107GEHBGULAM三、單鏈噬菌體載體

M13、f1、fd噬菌體單鏈環狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：M13噬菌體10/18/2023108GEHBGULAM（2）復制型（RF）是雙鏈環狀DNA。1.單鏈DNA噬菌體的特點（3）RFDNA和ssDNA都能轉染感受態

大腸桿菌。并產生噬菌斑。（5）可產生大量的含有外源DNA插入片

斷的單鏈分子，便于作探針或測序。（1）+DNA。（ssDNA）（4）不存在包裝限制。10/18/2023109GEHBGULAM2.M13噬菌體RFdsDNA在寄主細胞內以高拷貝形式存在。成熟的噬菌體里只包裝有+DNA，也容易提取。M13噬菌體只感染雄性大腸桿菌。但M13DNA可以轉染雌性大腸桿菌。6407bp。（2）DNA長度（3）DNA提純（1）寄主10/18/2023110GEHBGULAMM13序列10/18/2023111GEHBGULAM（4）M13的生活周期雖然不導致溶菌，但使菌斑混濁（細菌生長變慢，約為正常的1/2—3/4）M13通過雄性細菌的F性須注入其+DNA+DNA合成－DNA，形成RFdsDNA－DNA轉錄mRNA、合成+DNA、翻譯形成噬菌體蛋白組裝成新的噬菌體M13，擠出寄主細胞10/18/2023112GEHBGULAM+DNA-DNAmRNAM13外殼蛋白組裝成子代M13+DNA注入大腸桿菌復制轉錄翻譯+DNA指導合成+DNA200個RFDNA每個細胞可以放出約1000個M13顆粒！10/18/2023113GEHBGULAMM13的包裝過程：RFdsDNA指導合成的+DNAM13基因V編碼單鏈DNA結合蛋白DNA-蛋白質復合物轉移到寄主的細胞膜M13外殼蛋白基因V蛋白脫落+DNA溢出細胞膜包裝（5）沒有包裝限制10/18/2023114GEHBGULAM3.M13載體的構建：M13基因組中只有基因II與基因IV之間存在一段507bp的基因間隔區。（1）克隆區域的選定①基因間隔區（intergenicregion,IG區）IG區內只有一個

BsuI切點。其余9個BsuI限制性位點分布在其它部位。②酶切位點10/18/2023115GEHBGULAMM13J.Messing證明，IG區存在M13的復制起點，但可以插入外源DNA而不影響M13噬菌體的活力。10/18/2023116GEHBGULAM在IG區內插入一個大腸桿菌的LacZ’（

-肽序列)。利用

-肽序列中的三個單一酶切位點（BglII、AvaII和

PvuI）。（2）加入酶切位點①

在IG區內加入單一內切酶位點第一個M13載體：M13mp1：10/18/2023117GEHBGULAMM13RFBsuI不完全消化各種長度的線性片斷（其中應有只在IG上切開的線性全長M13）E.coli

lac基因的HindII片斷(lacI、lacP、lacO、lacZ’）連接M13mp1JM101宿主只有在IG區插入lacZ’才能存活并在Xgal上出現互補的藍噬菌斑10/18/2023118GEHBGULAM（3）M13載體系列加上常用的酶切位點。①M13載體系列的命名M13mpn

n代表系列數字②

對M13mp1的改進B.Gronenborn和J.Messing1978年把LacZ’5’端的第13個核苷酸G突變成A，產生了一個EcoRI切點。M13mp2：10/18/2023119GEHBGULAM5’ATGACCATGATTACGGATTCA-Me用N-甲基-N-亞硝基脲

把G甲基化

5’ATGACCATGATTACGGATTCA-轉染E.coli。mG與T配對，復制兩次后5’ATGACCATGATTACGAATTCA-EcoRI切點用EcoRI切M13mp1M13mp2選擇能切開的

線性分子再環化M13mp110/18/2023120GEHBGULAM③

對M13mp2的進一步改進在M13mp2的LacZ’的5’端加上一段人工合成的多克隆位點（MCS）。M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19對應有相同MCS的pUC系列載體：pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19成為M13mp系列載體：10/18/2023121GEHBGULAM10/18/2023122GEHBGULAM10/18/2023123GEHBGULAM與pUC18相同M13mp18的多克隆位點10/18/2023124GEHBGULAM4.M13系列載體的優點（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段（2）Xgal顯色反應，可供直接選擇（3）無包裝限制，克隆能力大（4）可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈子代M13噬菌體中包含的是單連+DNA。10/18/2023125GEHBGULAMMCS+-+-+-編碼鏈非編碼鏈外源DNA不同的酶切不同的酶切插入M13vector10/18/2023126GEHBGULAMM13RF+-+-+-外源DNA轉染E.coli成熟的子代M13中++10/18/2023127GEHBGULAMPhageM13replicationinthehostcell:+RNApolDNApolIII±RFNickedbygene2protein+ss-Rollingcirclereplication,thencutandligateCoatedwithgene5proteinGene5proteinisreplacedbygene8proteinect.LinearM13phagereleasedfromthecell.10/18/2023128GEHBGULAM①

插入外源DNA后，遺傳穩定性顯著下降②實際克隆能力小于1500bp。雖無包裝限制，并非無限包裝！5.M13載體的缺點10/18/2023129GEHBGULAM6.噬菌粒載體（phagemidvectors）由質粒載體與單鏈噬菌體載體的復制起點結合而成的新型載體系列。MCS噬菌體ori質粒oriAmprlacZ’

lacI10/18/2023130GEHBGULAM約3000bp（比M13?。诳寺∧芰Υ竽懿迦?0kb的外源DNA。③兩種復制形式①分子量?。?）噬菌粒載體的特點既具有質粒的復制起點，又具有噬菌體的復制起點。既能在大腸桿菌中以質粒的形式雙鏈復制，又能在噬菌體內進行單鏈復制。10/18/2023131GEHBGULAM（2）常見的噬菌粒載體噬菌粒載體質粒部分單鏈噬菌體部分輔助噬菌體大腸桿菌寄主pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101

VXM13M13變異株XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL1-Blue輔助噬菌體用來復制和包裝噬菌粒載體。10/18/2023132GEHBGULAM（3）pUC118/pUC119①構成1）M13的基因間隔區（IG）2）pUC18/pUC19質粒載體：帶有M13復制起點。質粒復制起點Ampr

lacZ’

MCS10/18/2023133GEHBGULAMMCSpUC18/pUC19oriAmprlacZ’

lacIM13ori3.2kbpUC118/11910/18/2023134GEHBGULAM②pUC118/119的復制模式兩種不同的復制模式1）雙鏈質粒復制模式受pUC本身的復制起點（來源于ColE1）的控制。每個細胞能達到500個拷貝。10/18/2023135GEHBGULAM來源于M13的復制起點被輔助噬菌體的基因II產物控制。2）單鏈滾環噬菌體復制模式外殼蛋白復制蛋白輔助M13包裝當寄主細胞被輔助噬菌體M13感染后。10/18/2023136GEHBGULAM③噬菌粒載體的包裝1）輔助噬菌體：自身的復制起點發生了突變，復制效率低下，但感染細菌后能表達出外殼蛋白和復制蛋白，幫助噬菌粒載體復制。如M13K07等。2）包裝：輔助噬菌體外殼蛋白和復制蛋白噬菌粒載體ssDNA噬菌體10/18/2023137GEHBGULAM（4）pBluescript噬菌粒載體（pBS）Stratagene公司發展的一類噬菌粒載體。由pUC質粒載體、f1噬菌體的復制起點和T3、T7噬菌體的啟動子組成。②特點①組成MCS兩側分別加上T3和T7噬菌體的啟動子。加入適當的噬菌體RNA聚合酶，就可以定向體外轉錄。1）定向體外轉錄10/18/2023138GEHBGULAM2）兩種復制模式既能以質粒的形式復制，又能以噬菌體的形式復制包裝。3）選擇方便有Ampr和lacZ’，可以進行Amp抗性選擇和Xgal-IPTG藍白斑選擇。4）插入方便18個單一酶切位點的MCS10/18/2023139GEHBGULAMSK：表示lacZ’的轉錄方向是沿MCS上的

SacI

KpnI

+（f1+）：單鏈復制起始方向背離

lacZ’，能回收lacZ’的編碼鏈（+）pBluescriptSK（+/-）/pBluescriptKS（+/-）KS：反向（

KpnI

SacI，MCS相反）-（f1-）：能回收lacZ’的非編碼鏈（-）1）pBluescriptSK/KS（+/-）區分：③

常用的pBluescript載體10/18/2023140GEHBGULAMpBSSK+10/18/2023141GEHBGULAMpBSKS-10/18/2023142GEHBGULAM10/18/2023143GEHBGULAM10/18/2023144GEHBGULAM（5）PCR產物克隆載體T載體pCR系列載體Invitrogen公司開發的線性噬菌粒載體。①結構pUC的質粒部分、fi噬菌體ori、Kanr和Ampr抗性。MCS的中部已經切開，各有一個3’端突出的T。②特點PCR產物往往在3’端突出一個A，所以能與這個載體直接連接。10/18/2023145GEHBGULAMpCR2.110/18/2023146GEHBGULAMpCR2.1的MCS克隆的PCR產物能被兩側的EcoRI切下來回收。10/18/2023147GEHBGULAMpCR2.1-topo10/18/2023148GEHBGULAMpCR100010/18/2023149GEHBGULAMPromega公司的T載體系列pGEM-Tvector10/18/2023150GEHBGULAMpTargetvectorG418抗性可在真核生物表達外顯子捕捉10/18/2023151GEHBGULAMTvector的克隆過程——簡便！AATTTvectorPCRproductT4DNAligaseAA10/18/2023152GEHBGULAM7.噬菌體展示載體（

Phagedisplayvector）（1）噬菌體展示（Phagedisplay）將外源蛋白（多肽、酶、抗體、DNA結合蛋白）結合到噬菌體的外殼蛋白上形成融合蛋白，表達于噬菌體的外表面。G.P.Smith1985年發明。絲狀噬菌體（M13、f1等）外殼顆粒的一端，有3-5個基因Ⅲ編碼的蛋白質（g3p），在識別和吸附大腸桿菌的過程中起作用。10/18/2023153GEHBGULAMM1310/18/2023154GEHBGULAM（2）噬菌體展示載體的構建把外源DNA片斷插入基因Ⅲ的序列前端，并保持兩者的閱讀框正確，表達出融合蛋白。啟動子外源DNAM13基因ⅢoriM13displayvector外源多肽10/18/2023155GEHBGULAM四、雙鏈噬菌體載體—

載體（1）長度為48502bp；（2）雙鏈線性DNA；（3）但在兩端有cos位點，可以環化。

DNA兩端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的雙鏈區域稱為cos位點。1.

DNA分子的特點

cos位點（cohensive-endsite）10/18/2023156GEHBGULAM

DNA進入細菌體內后，可形成雙鏈環狀DNA復制型（RFDNA）。10/18/2023157GEHBGULAM

噬菌體和其DNA10/18/2023158GEHBGULAMDNA上有至少61個基因，有一半是必須的與自身的活動有關，成簇排列。其他約1/3是非必須基因（位于尾部合成至阻遏之間的區段）。2.

噬菌體的基因組特點

10/18/2023159GEHBGULAM

genome(48502bp)10/18/2023160GEHBGULAM10/18/2023161GEHBGULAM

噬菌體感染細菌的早期：雙鏈進行

型復制。3.

DNA的復制

模型（1）

型復制10/18/2023162GEHBGULAM（2）滾環復制

感染的晚期：啟動滾環復制機制。形成多聯體

DAN分子。10/18/2023163GEHBGULAM這種多聯體分子必須在cos位點被切斷成單體分子才能被包裝起來。10/18/2023164GEHBGULAM（1）構建原理4.

噬菌體載體的構建（2）構建過程①在這個非必須區內制造限制酶切點②引進某些突變表型，作為選擇標記③突變某些基因，使它成為安全載體④刪除

DNA必須區段上常用的限制酶切點

噬菌體DNA上本身有5個EcoRI和7個HindIII切點！刪除

噬菌體的非必需區，留出插入空間。10/18/2023165GEHBGULAM（3）人工構建的

噬菌體載體有兩種類型①插入型載體（insertionvectors)如

gt10、

gt11、

BV2、

NM540、

NM1590、

NM6071）免疫功能失活型：插入位點位于載體合成活性阻遏物區域（cI基因）內。EcoRIcI

gt1010/18/2023166GEHBGULAM插入導致載體不能合成阻遏物，

載體DNA不能進入溶源期，受體菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。沒有外源DNA插入的

載體感染受體菌形成混濁噬菌斑。選擇標記:如

NM1149載體的兩個克隆位點（EcoRI和HindIII）都是位于cI基因內部。10/18/2023167GEHBGULAM2）

-半乳糖苷酶失活型載體在

基因組中引入了LacZ’序列。（其上含有一個EcoRI克隆位點）。感染LacZ突變的大腸桿菌，經IPTG的誘導，利用Xgal的顯色反應作選擇標記。LacZ’

EcoRICharon16A選擇標記:10/18/2023168GEHBGULAM②

替換型載體（substitutionvectors)

兩個多克隆位點區以反向重復形式分別位于

DNA的非必須區兩端。用酶切后，可以將中間的區段切下來，與用同樣酶切成的外源DNA片斷置換?？芍脫Q區MCSMCS如：

EMBL4、Charon40等。10/18/2023169GEHBGULAM1）

EMBL4

EMBL4的可置換片斷內部還有SalI酶切位點。以便于進一步消化中間片斷，防止自我連接。左臂可置換區右臂EcoRIBamHISalISalIBamHIEcoRISalISalI

EMBL410/18/2023170GEHBGULAM2）Charon40Charon40的可置換片斷是由DNA短片重復構成，片斷之間有HaeI切點。在克隆的時候，可以用HaeI酶進一步將可置換片斷切成小片斷，以防止重新與載體連接。左臂可置換區右臂MCSMCSCharon40HaeI10/18/2023171GEHBGULAM可取代片斷中如果包含LacZ’，可用Xgal顯色作篩選標記。（4）

載體的篩選標記②插入型載體根據插入所引起的表型突變。①置換型載體10/18/2023172GEHBGULAM

Virusesthatcaninfectbacteria.48.5kbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)λphageLyticphase

(Replicateandrelease)Lysogenicphase(integrateintohostgenome)10/18/2023173GEHBGULAM

載體克隆策略置換型載體10/18/2023174GEHBGULAM

DNA象質粒載體那樣直接轉化細菌時效率遠比質粒低。5.

載體的體外包裝

在試管中與

噬菌體的頭部和尾部蛋白人工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染細菌，把重組DNA注入受體菌中。必須利用噬菌體外殼的作用?。?）體外包裝10/18/2023175GEHBGULAM

10/18/2023176GEHBGULAM

的D基因的產物也是頭部蛋白，但主要與

DNA進入頭部和頭部的成熟有關（只占20%）。（2）體外包裝過程①

噬菌體外殼蛋白的合成E基因的E基因編碼頭部蛋白的主要成分（占頭部總蛋白的70%）。D基因10/18/2023177GEHBGULAME基因突變只合成尾部蛋白和包裝識別蛋白D基因突變合成頭部蛋白和尾部蛋白，但不能聚合和包裝DNA提取尾部蛋白提取頭部和尾部蛋白重組的

載體DNA體外包裝成活性噬菌體10/18/2023178GEHBGULAM外源的重組

DNA載體被誘發與內源性原

DNA發生重組。（3）體外包裝存在的問題①包裝錯誤既能包裝用于生產頭部蛋白的內源性原

DNA，也能包裝重組的

DNA載體。②重組10/18/2023179GEHBGULAM③體外包裝的容量限制必須在正常野生型容量的75%—105%（36—51kb）之間。既不能超過正常野生型容量的105%；又不能低于正常野生型容量的75%野生型

DNA的必須區是28kb，所以

載體的最大克隆容量是23kb。（實際上為15kb）。10/18/2023180GEHBGULAM比一般的質粒載體的容量大的多（4）

DNA載體的優點用在真核生物基因組文庫的建立。Sau3ABamHI10/18/2023181GEHBGULAM10/18/2023182GEHBGULAM噬菌體感染細菌形成的噬菌斑10/18/2023183GEHBGULAM1978年J.Collins和B.Hohn等人發展出cosmidvector（cossite-carryingplasmid)

DNA：4—6kb（1）大小

（2）組成

6.cosmid載體（粘粒）cos序列和控制包裝的的序列。pBR322：質粒的復制子抗藥性基因幾個限制性酶的單一位點10/18/2023184GEHBGULAM柯斯質粒pHC79系由質粒pBR322和噬菌體λ的cos位點的一段DNA構成全長4.3kb10/18/2023185GEHBGULAMCloningbyusingcosmidvectors.

(a)Inadditiontoampr,ORI,andpolylinkerasintheplasmidvector,thecosmidvectoralsocontains

aCOSsite.

(b)Aftercosmidvectorsarecleavedwithrestrictionenzyme,theyareligatedwithDNAfragments.

Thesubsequentassemblyandtransformationstepsarethesameascloningwithlphages10/18/2023186GEHBGULAM①具有

噬菌體的特性（3）cosmidvector的特點

克隆外源DNA后可以體外包裝成噬菌體顆粒。在寄主細胞內形成環化DNA（但不能形成新的噬菌體顆粒而溶菌

）。②具有質粒載體的特性大多帶有pMB1或ColE1的復制子，能象質粒一樣復制。10/18/2023187GEHBGULAM有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位點。③方便的選擇④高容量的克隆能力45kb

（最少不能低于30kb）。51kb-5kb=45kb10/18/2023188GEHBGULAM（4）部分cosmidvectorCosmid載體復制子大?。╧b)選擇標記克隆位點克隆能力（kb)c2XBpMB16.8Ampr,Kanr

BamHI,ClaI,EcoRI,HindIII,PstI,SmaI32~45pHC79pMB16.4Ampr,Tetr

EcoRI,HindIII,SalI,BamHI,PstI,CalI29~46pHS262ColE12.8Kanr

BamHI,EcoRI,HincII34~50pJC74ColE115.8Ampr

EcoRI,BamHI,BglII,SalI21~37pJC75-58ColE111.4AmprEcoRI,BamHI,BglII16~42pJC74mColE121Ampr,KanrBamHI16~32pJC720ColE17.1Elimm,Rifr

HindIII,XmaI11~2810/18/2023189GEHBGULAMCosmid載體復制子大?。╧b)選擇標記克隆位點克隆能力（kb)pJC81pMB17.1Ampr,TetrKpnI,BamHI,HindIII,SalI30~46pJB8ColE15.4Ampr

BamHI,HindIII,SalI31~47MuA-3pMB14.8TetrPstI,EcoRI,BalI,PvuI,PvuII32~48MuA-10pMB14.8TetrEcoRI,BalI,PvuI,PvuI32~48pTL5pMB15.6TetrBglII,BalI,HpaI31~47pMF7pMB15.4Ampr

EcoRI,SalI32~4810/18/2023190GEHBGULAM應用cosmid載體在大腸桿菌中克隆大片端的真核基因組DNA技術，叫“柯斯克隆”（cosmidcloning）。（5）cosmidcloning①理論依據cos位點:

噬菌體的生命周期中，會產生數百個

DNA通過cos位點連接的“多聯體”分子?！岸嗦擉w”復制：包裝識別。10/18/2023191GEHBGULAM在包裝的時候，

噬菌體具有位點特異的末端酶（terminase）體系（Ter體系），識別cos位點，把多聯體切成單個

DNA長度。兩個cos位點之間，必須保持38—45kb的DNA，Ter體系才能識別。Ter體系包裝限制10/18/2023192GEHBGULAM①用特定的核酸內切酶消化真核生物DNA（6）cosmid克隆的一般過程②用同樣的內切酶消化cosmid載體產物中將有一定比例的分子是兩端各有一個cos位點、長度40kb左右的真核DNA與載體的連接物。③連接10/18/2023193GEHBGULAM切割合適長度的雜種DNA連接物，并包裝入噬菌體頭部。注入到細菌體內的雜種DNA分子環化，并按質粒的方式復制。⑤感染大腸桿菌④Ter體系識別并切割10/18/2023194GEHBGULAM10/18/2023195GEHBGULAM10/18/2023196GEHBGULAM大質粒！10/18/2023197GEHBGULAM①載體片斷自我連接②外源DNA片斷自我連接③多個本來不在一起的外源DNA片斷連接起來同時插入載體（7）cosmid載體克隆的缺點用堿性磷酸酶除去線性質粒片斷5’端的磷酸，可防止載體自體連接?？朔d體自體連接的改良方案：10/18/2023198GEHBGULAM①Ish-Horowice—Burke改良方案1981年，D.Ish-Horowice和J.F.Burke。（8）cosmid載體的改良在BamHI位點兩側各有一個EcoRI切點。1）突出的特點：pJB8cosmid載體使克隆在BamHI上的外源DNA可被EcoRI切下來。10/18/2023199GEHBGULAM包裝識別10/18/2023200GEHBGULAM2）Ish-Horowice—Burke方案克隆過程HindIIISalISalIHindIIIBamHI10/18/2023201GEHBGULAMa.需要脫磷酸化處理。b.電泳純化載體兩臂。c.載體兩臂的最終得率少的可憐！2）Ish-Horowice—Burke方案的缺點防止載體自我連接第二次酶切后。10/18/2023202GEHBGULAM1983年P.F.Bates和R.A.Swift②Bates---Swift改良方案a.具有兩個cos位點。SmaI平端的連接效率低，阻止了載體臂的自我連接，增加了外源DNA的連接效率。1）特點：b.一個SmaI切點把兩個cos位點分開。c.BamHI克隆位點。c2XBcosmid載體10/18/2023203GEHBGULAM10/18/2023204GEHBGULAMBates---Swift克隆過程：10/18/2023205GEHBGULAM第三節

大分子DNA克隆載體A.W.Murray1983年形成基礎理論,D.T.Burke等1987年變為現實。一、酵母人工染色體1.YAC的特點（1）只能在酵母細胞中擴增（yeastartificialchromosome,YAC)（2）克隆容量大，為230kb-1700kb（3）構建原理，按染色體結構構建10/18/2023206GEHBGULAM（1）DNA復制起始點（ori）2.染色體復制和遺傳的三個基本組件TELTELCENORI（2）著絲粒（centromere，cen）（3）兩個端粒（telomeres，tel）10/18/2023207GEHBGULAMLeuARSCENLeu-Yeast后代死Leu-Yeast80%后代死Leu-Yeast后代活Leu-Yeast后代死Leu-Yeast后代活TelTel10/18/2023208GEHBGULAM（1）著絲粒區（CEN）A

AGTCACGTGTTGTTTCTGNTTTCCGAAA3.YAC的組成結構酵母染色體著絲粒區的保守序列:78-86bpIIIIII由三個區組成10/18/2023209GEHBGULAM酵母第3、4、6、11號染色體的著絲粒區序列：10/18/2023210GEHBGULAM酵母端粒保守序列是(G4T2)n

重復序列。（3）復制起點（ORI）約100bp的自主復制序列（ARS）。（2）端粒（TEL）人是TTAGGG重復序列;四膜蟲是GGGTTG重復序列。（真核生物中只有酵母菌有ARS）兩個端粒序列Tel。10/18/2023211GEHBGULAM位于

SUP4

基因內部。（4）克隆位點插入失活選擇SUP4酶失活的酵母菌落呈紅色；不失活的菌落是白色。10/18/2023212GEH