固相萃取-高效液相色譜法測定水中的抗生素

1不同藥物類的土霉素類和四環素類的殘留20世紀60年代，抗生素被用作家禽飼料添加劑。近年來隨著養殖業的迅速發展,為了治療、預防動物疾病和促進其機體生長,飼養者盲目地使用抗生素。過量的抗生素進入環境中,會形成持續性的污染,導致病菌耐藥性的產生。這不僅影響到養殖業的生產,更威脅著人類的健康與生存環境。分屬于氯霉素類的氯霉素(CAP),以及分屬于四環素類的土霉素(OTC)、四環素(TC)和金霉素(CTC)是養殖業常用的抗生素類藥物。以前的研究大多關注的是這些藥物在食品中的殘留。從20世紀90年代,國際上開始關注其在地表環境(水、沉積物和土壤)中的行為,如四環素類在水體中的殘留,磺胺類藥物在土壤中的殘留和遷移,以及四環素類、大環內酯類和硫胺類藥物在土壤中的殘留等,但對環境中氯霉素殘留的研究卻較少。由于氯霉素和四環素類抗生素在養殖業中被廣泛使用,因此建立同時測定環境中兩類抗生素的方法是亟待解決的問題。環境中抗生素的前處理最常用的是固相萃取法(SPE),但單一萃取柱的固相萃取法不能完全去除天然有機質(如腐殖酸),從而影響了色譜分離的效果。針對這些問題,本實驗采用SAX-HLB聯用-丙酮(含10%甲醇)洗脫的前處理方法,并采用等度淋洗的高效液相色譜法測定氯霉素和3種四環素。結果表明,SAX和丙酮(含10%甲醇)的使用有效地減少了水、沉積物和土壤中有機雜質的影響。采用乙腈和0.01mol/L草酸溶液作為流動相等度洗脫,8min內簡捷快速地分離4種抗生素。2實驗部分2.1陰離子交換柱saxAgilentHP1100高效液相色譜儀(紫外檢測器);KS-2康氏振蕩器(上海浦東物理光學儀器廠);OASISHLB固相萃取柱(3mL/60mg,Waters公司);強陰離子交換柱(SAX)(3mL/500mg,Agilent公司);0.7μmGF/F玻璃纖維濾膜(Whatman公司)。氯霉素、土霉素、四環素和金霉素均為Fluka公司產品;甲醇、乙腈均為色譜純(美國Dikma公司);Na2HPO4、檸檬酸、Na2EDTA、NaOH為分析純;草酸為優級純;超純水(18.2MΩcm,Millipore)。2.2u3000添加na2edta和na2hpo4對標液的配制準確稱取0.01g的CAP、OTC、TC和CTC標準品,加入少量甲醇溶解,然后轉移到100mL棕色容量瓶中,用甲醇稀釋到刻度,配制成100mg/L的標準儲備液,保存在4℃冰箱中(不超過3個月)。稱取一定量的Na2EDTA、Na2HPO4和檸檬酸,分別配制成0.1、0.2和0.4mol/L的溶液。按照3∶2的比例混合Na2HPO4和檸檬酸,配制成McIlvaine溶液。將0.1mol/LEDTA溶液與McIlvaine緩沖溶液按照1∶1的比例混合,配制成EDTA-McIlvaine提取液(混合后pH值約為4)。2.3sax-hlb柱及洗脫溶液的制備取500mL水樣,加入50mLEDTA-McIlvaine緩沖溶液,混勻,靜置片刻后用玻璃纖維濾膜過濾,再通過SAX-HLB串聯小柱(SAX和HLB均用2mL丙酮,2mL甲醇,2mL超純水預處理)。萃取完成后,移去SAX柱,用2mL15%的甲醇沖洗HLB柱(以去除部分有機雜質),再用3mL丙酮(含10%甲醇)洗脫抗生素。洗脫液裝于4mL棕色樣品瓶中。洗脫液經高純Ar氣吹干后,再用250μL甲醇定容,密封冷藏于4℃待測。2.4edta-mcilva系統提取液g/lma將沉積物或土壤樣品冷凍干燥后碎至0.30mm粒徑,稱取4g放入錐形瓶中,加入20mLEDTA-McIlvaine緩沖溶液,振蕩30min,取上層提取液。反復提取3次后,合并3次提取液,并用玻璃纖維濾膜過濾。其余步驟同上。2.5流動相、柱溫度色譜柱:HypersilODS(200mm×4.6mm,5μm);流動相:0.01mol/L的草酸水溶液和乙腈(60∶40,V/V);流速:1.0mL/min;進樣環體積:20μL;柱溫:25℃;檢測波長:278nm。3結果與討論3.1ph值對cs萃取的影響四環素類抗生素(TCs)的吸附性很強,而且易與金屬離子螯合,而氯霉素的吸附性比TCs弱。因此在提取時,首先考慮適合TCs的提取液。EDTA-McIlvaine緩沖溶液作為TCs的提取液,在食品和環境樣品中都有應用,但McIlvaine溶液的pH值卻不盡相同。根據TCs的性質可以看出,酸性溶液比較適合對TCs的萃取,但是當pH<2時,TCs容易分解。經過實驗比較,本實驗選擇了pH4的McIlvaine緩沖液與0.1mol/LEDTA緩沖液混合作為TCs的提取液。實驗結果證明EDTA-McIlvaine對于CAP的萃取效果同樣很好。因此本實驗選擇EDTA-McIlvaine(pH4)緩沖溶液同時萃取TCs和CAP。3.2柱、丙酮的提取在水、沉積物和土壤中,天然有機質(主要為腐殖酸)含量常常很高,對HPLC檢測有很大的影響。處理樣品時,如果只用HLB小柱純化和富集,HLB小柱在吸附抗生素的同時也會吸附大量的有機質。在用甲醇洗脫時,由于甲醇的洗脫性很強,在完全洗脫抗生素的同時,也會洗脫大量的其它有機物,導致色譜分離時,有機質的峰很高,并形成拖尾,對CAP的影響很大。于是采用兩個步驟消除有機質的干擾:(1)在HLB柱之前串聯SAX柱。在酸性的EDTA-McIlvaine提取液中,腐殖酸類有機質都以陰離子形式存在,在通過SAX柱時可以被去除,而抗生素可以通過SAX柱;(2)用丙酮(含10%的甲醇)洗脫抗生素。甲醇是常用的洗脫液,其洗脫性強是因為極性強。丙酮的極性比甲醇弱,對腐殖酸的溶解性也較小,代替甲醇作為洗脫液可以減少大部分有機質的洗脫。考慮到純丙酮不能完全洗脫HLB柱上的抗生素,因此在丙酮中加入適量甲醇混合使用,以期能結合二者優點。經過實驗證明甲醇和丙酮的比例為1∶9(V/V)時,可以完全洗脫HLB柱上的抗生素,同時也能有效地減少對有機質的洗脫,取得良好的效果。為了證明SAX柱和丙酮作為洗脫液的效果,將相同的加標沉積物分為等量的S1、S2和S3三組,用EDTA-McIlvaine緩沖溶液提取后分別采用3種純化富集的方法,即:HLB-甲醇洗脫、SAX-HLB串聯-甲醇洗脫和SAX-HLB串聯-丙酮(含10%的甲醇)洗脫。在HPLC檢測時,S2的有機質峰高比S1的有機質峰高減小50%,但抗生素的出峰無明顯變化;S3比S2有機質峰高降低30%,抗生素的出峰無明顯變化。以上實驗結果說明,使用SAX和丙酮(含10%的甲醇),既可以減少有機質的影響,又不會影響回收率(表1)。因此,本實驗選擇SAX-HLB聯用純化富集-丙酮(含10%甲醇)洗脫作為沉積物、土壤中抗生素檢測的前處理方法。3.3流動相和檢測波長的選擇TCs的結構使其能夠和金屬離子螯合,導致在色譜分離時的峰形會形成明顯的拖尾。在流動相中添加草酸溶液能夠很好地消除拖尾現象。實驗證明當草酸的濃度為0.01mol/L,草酸和乙腈比例為60∶40(V/V)時,不僅TCs出峰尖銳無拖尾,而且CAP的出峰同樣良好(圖1為超純水配制的1mg/L的標準溶液色譜圖,用河水和湖水配制的標準溶液分離效果沒有差別)。因此選擇乙腈和0.01mol/L的草酸溶液作為流動相。TCs的紫外檢測波長一般在250～400nm之間,因此在此區間選擇TCs和CAP共同的最優檢測波長。選擇254、270、300、340和355nm進行比較,結果證明,當檢測波長超過300nm以后,CAP的峰很低,而在270nm時4種抗生素的峰都很高。在260～280nm的范圍內進一步實驗比較,最后選擇278nm為4種抗生素的共同檢測波長。3.4檢測限和回收率標準的線性、重現性、檢出限和加標樣品的回收率結果見表2和表3。將標準儲備液用超純水稀釋,配制成0.2、0.5、1、2、5、10和25mg/L的混合標準系列溶液,得標準系列的相關系數(r)為0.9987～0.9999,重現性好于1.7%。以3倍信噪比求得CAP、OTC、TC和CTC的檢測限分別為23、18、20和32μg/L。在空白河水、沉積物和土壤(3種基質經實驗證明不含抗生素)中添加標準溶液,采用前述方法富集測定,求出回收率。結果表明:(1)同一種抗生素在不同的介質中回收率不同。這是因為不同介質中抗生素的吸附性不同,進而導致回收率的差異可以看出,對于同一種抗生素,水樣的回收率最高,土壤其次,而沉積物最低。文獻[2,10,11]報道,OTC、TC和CTC在地表水中的回收率為76%～99%、86%～98%和87%～90%,在土壤中的回收率為27%～85%、33%～41%和57%～76%(沉積物尚缺乏TCs的結果,而CAP無對比結果),與本實驗結果基本處于相同范圍;(2)不同的抗生素在同一介質中回收率不同。由于TCs的吸附性比CAP強,因此TCs的回收率比CAP低。3.5樣品的測定結果在貴陽市的阿哈湖水庫、烏江渡水庫和南明河采集水樣、沉積物。阿哈湖是貴陽市飲用水源(但過去養魚網箱較多,為了保證水質,到采樣時已全部拆除)。在岸邊的釣魚場附近采集水樣2個(阿哈湖1、2),在湖心采集水樣1個(阿哈湖3);烏江渡水庫位于烏江中上游,沿兩岸分布很多養魚網箱。從上游往下的養魚區分別采集水樣2個(烏江渡1、2)、沉積物2個(烏江渡3、4),在遠離養魚區的下游約1500m處(靠近大壩)采集沉積物1個(烏江渡5)。南明河是貫穿貴陽市的一條河流,在流經貴陽城區后有南北兩個排污口排出的城市污水匯入。在兩個排污口分別采集水樣(南北排污口),于排污口上游約200m處采集水樣(南明河)