川貝母4種基源種的種內、種間化學成分比較

川貝母甜、苦、苦。具有清熱、潤肺、祛痰、止咳的功效。主要治療肺熱干旱、排泄粘液和胸悶。目前發現的貝母屬植物有60種、45變種和5變型。2005年版《中國藥典》收載的川貝母的4個基源種為百合科植物卷葉貝母FritillariacirrhosaD.Don、暗紫貝母FritillariaunibratataHsiaoetK.C.Hsia、甘肅貝母FritillariaprzewalskiiMaxim和梭砂貝母FritillariadelavayiFranch的干燥鱗莖。前三者按性狀不同分別習稱為松貝、青貝,后者為爐貝。松貝的植物種源主要為川貝母,品質最優;青貝的主要為暗紫貝母,品質亦優;爐貝的一般為梭砂貝母,品質次于松貝、青貝。川貝母中主要有效成分為生物堿,4個基源種川貝母的共有有效成分為貝母辛。文獻采用雙相滴定法測定了《中國藥典》收載的4基源種17個不同產地的川貝母生物堿的含量,測得17個不同產地的川貝母中總生物堿的含量以卷葉貝母較高、暗紫貝母偏低。但川貝母的成分并不僅限于生物堿類,單以生物堿類成分判斷其品質的優劣有失偏頗,因此,研究采集了主產區4個基源種的川貝母,采用氫核磁共振技術結合模式識別(1HNMR-PR)法對樣品進行了比較研究,以此說明4種基源種川貝母樣品間主要代謝物的差異,為更合理地使用川貝母提供參考。1實驗部分1.1藥物學系鑒定核磁用BrukerAVII-600MHz核磁共振儀測定。卷葉貝母FritillariacirrhosaD.Don、暗紫貝母FritillariaunibratataHsiaoetK.C.Hsia、甘肅貝母FritillariaprzewalskiiMaxim和梭砂貝母FritillariadelavayiFranch基源種均經鑒定,所有樣品現均保存于四川大學華西藥學院天然藥物學系;甲醇為分析純;數據分析軟件為MestRe-C4.7、SIMCA-P11.0。1.2方法和結果1.2.1樣品溶液的制備稱取約1.2g研碎的川貝母樣品(過80目篩),加入15mL甲醇,稱重,于55℃水浴中回流90min,冷卻后稱重,并補足重量,過濾;棄去初濾液,取10mL續濾液,減壓濃縮至干,真空干燥30min;殘渣用0.5mLDMSO-d6溶解,轉入5mm核磁管中,即得樣品溶液。依法制得24份川貝母的樣品溶液。1.2.2建立預飽和脈沖序列和數據矩陣將所有待測樣品于296K恒溫在核磁共振儀中,以DMSO-d6為內鎖,每個圖譜掃描64次,采樣時間域為64k,譜寬為12.34kHz,采樣時間為2.66s,脈沖間隔D1為3.00s,采用標準的預飽和脈沖序列(zgpr)壓制水峰信號。獲得各樣品的自由衰減(FID)信號。將各樣品的FID信號導入Mestre-C軟件進行傅立葉轉換,經修整基線、調整象限后,以DMSO-d6信號峰的化學位移值δ2.50為標準校正圖譜。每張圖譜的δ10.00～0.00化學位移區間,按每0.05化學位移值單位進行分段積分,即得到化學位移值段與積分值一一對應的數據矩陣(200×24)。該矩陣的行代表不同的化學位移段,列代表對應于化學位移值段的積分值。將該數據矩陣導入Excel軟件,進行歸一化處理后,獲得新數據矩陣。將新數據矩陣導入SPSS或SIMCA-P軟件,調用聚類分析或主成分分析程序,進行聚類分析或主成分分析。1.2.3各種川貝母間的圖譜4種川貝母基源種樣本的1HNMR圖譜見圖1。直觀地比較這4張圖譜均相似,很難發現彼此存在的明顯差異。圖譜僅是每種各1個樣品的圖譜,存在的細微差異可能源于樣品本身或樣品處理、測定過程中的差異,因此,以單張圖譜并不能判斷4種川貝母間存在的明顯差異。為此,選用模式識別法中的層次聚類分析(HCA)、主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)等方法從不同角度進行鑒別分析,并相互驗證分析結果的可靠性。1.2.4樹狀分類分析HCA分析是一種根據數據間的相關性對分析對象進行分類分析的方法,屬于模式識別中的非監督法。將4個基源種川貝母的24個樣本的數據導入SPSS11.5軟件,并做HCA分析,獲得樹狀分類圖(圖2)。從圖2可以看出:卷葉貝母6個樣品(jy1-6)和甘肅貝母6個樣品中的5個樣品(gs2-6)相對集中,說明卷葉貝母和甘肅貝母各有特征;梭砂貝母6個樣品中有4個樣品(ss2、3、5、6)相對集中;而暗紫貝母6個樣品中的3個樣品(az1-3)與甘肅貝母相近,另3個樣品(az4-6)則與卷葉貝母相近。說明暗紫貝母在整體成分上介于卷葉貝母和甘肅貝母之間。1.2.5各基源種川貝的得分散點分布將4個基源種川貝母的24個樣品數據導入SIMCA-P軟件,選擇PCA分析。先從原始數據矩陣中提取主成分,前6個主成分的累計貢獻率已達到85%以上,即表示前6個主成分能解釋原變量信息的85%以上。以前6個主成分的得分值分別為橫、縱坐標繪制得分散點圖,并對各圖中各樣品得分散點的分布情況進行比較分析。結果顯示:以主成分2(PC2)和主成分1(PC1)的得分值為橫、縱坐標繪制的得分散點圖(圖3)對樣品的區分效果相對更明顯。表明4個基源種川貝的區別主要集中在PC1和PC2上。由圖3的得分散點圖可以看出:4個基源種川貝母的得分點集中在95%可信區間,彼此間的差異并不大。但仔細分析,4種貝母間也存在些微差異:暗紫貝母樣品集中在t負值和t正值區,梭砂貝母的樣品集中在t零值附近和t負值區,卷葉貝母的集中在t零值附近和t正值區,而甘肅貝母的集中在t正值附近和t零值附近區。其中卷葉貝母、暗紫貝母和梭砂貝母樣品間的分散程度相對較大。1.2.6數據處理與分析為進一步了解不同基源種川貝母在成分上的細微差異,選取川貝母樣品中卷葉貝母、暗紫貝母和梭砂貝母樣品中各兩個樣品進行數據還原作圖(XObs圖)后再進行分析(圖4)。圖4中每兩個同種川貝母樣品間在整體圖譜上的信號峰數量和形態無明顯差異,但δ4.0～0.8信號峰的高低卻有較大差異。據文獻可知:川貝母的主要有效成分甾體類生物堿的1HNMR信號特征為δ4.15～0.79,因此,每兩個同種川貝母樣品間的差異主要體現在樣品中主要成分的含量有差異。1.2.7特征峰位分布從圖3已知不同基源種的川貝母樣品間有一定差異,為了解這種差異具體體現在哪些化學成分上,作者任意選取4種基源中川貝母中的各1個樣品,作XObs圖(圖5)。由圖5可得:不同基源種的貝母樣本在δ4.0～0.8變量范圍內,不僅信號峰的強弱差異較明顯,且峰型和峰位(化學位移值)也有差異。如甘肅貝母樣品在化學位移δ1.06、1.78、2.52、3.14、3.18、3.42、3.64、3.56、3.58、3.78、3.88、3.90處的峰比其他3個基源種的都明顯高很多;其中,δ1.06為貝母乙素的特征峰之一,因此,推測甘肅貝母中含貝母乙素的量可能比其他3個基源種貝母都高;梭砂貝母在對應位移的峰除δ0.86、1.24、1.45、2.18外,都比甘肅貝母低,但比暗紫貝母和卷葉貝母高;而暗紫貝母與卷葉貝母則差異較小。上述分析說明,不同基源種川貝母在所含化合物成分的種類和量上都存在一定差異。2川貝母樣品點4種基源種川貝母樣品點均相對集中在95%可信區間內,說明4種川貝母樣品在整體成分上比較相近;即使在可信區間內,各川貝母樣品點也相對分離,說明各