顱腦損傷患者血清fas、fasl與細胞功能抑制的關系

腦損傷患者的免疫功能下降是引起晚發性感染和多器官功能障礙的主要原因之一。近年來研究發現免疫細胞凋亡是誘導傷后免疫抑制的重要原因之一。其中Fas系統介導的T細胞凋亡和調控作用可能在發病過程中占重要地位,而關于顱腦損傷后外周血T細胞凋亡情況文獻報道較少。作者對顱腦損傷患者血中Fas、FasL、白介素-2(IL-2)、CD4及CD8等進行動態研究,旨在探討Fas/FasL在腦損傷中的作用及對T細胞的影響。進一步了解傷后T細胞免疫功能抑制的分子機制,為臨床治療提供理論依據。1腦衰裂傷及t細胞亞群檢測1.1一般資料選擇急診入院顱腦損傷患者38例。男20例,女18例,年齡15~67歲,平均37歲。納入條件:顱腦損傷后24h內入院,無嚴重多發傷,并經頭顱CT檢查確診;近期無感染,未行化療或放療,既往無免疫系統和內分泌系統疾病史。致傷原因均為車禍傷。損傷類型:硬膜外血腫7例,硬膜下血腫19例,腦挫裂傷16例。所有患者入院時均行頭顱CT檢查證實有腦挫裂傷,并進行GCS評分(均為中重型)。對照組30例,男19例,女11例,年齡18~60歲,平均36歲。均為本院健康體檢者。1.2方法分別于傷后第1、3、7、14天抽取顱腦損傷患者外周靜脈血,分離血清,置-70℃下保存,成批檢測。采用SAP法檢測T細胞亞群,試劑盒內主要試劑均為美國Zymed公司產品;采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清FasL、sFas,試劑盒為法國Diaclone公司產品;采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清IL-2,試劑盒由深圳晶美公司提供。1.3統計學方法數據均以ˉx±s表示,采用SPSS10.0統計軟件,兩組數據比較采用t檢驗,兩組數據關系采用相關分析。2結果2.1周左右恢復傷后第1天CD4水平均下降,第3天左右下降至最低值,后逐漸升高,至2周左右有恢復趨勢;CD8水平傷后第1天均升高,第3天左右達到高峰,后逐漸下降,第14天左右接近對照組水平(表1)。2.2第3天左右下降至最低值傷后第1天IL-2水平下降[(26.46±7.25)μg/L],第3天左右下降至最低值[(22.38±4.78)μg/L],后逐漸升高,傷后第7天為(27.56±6.86)μg/L,傷后第14天基本恢復正常[(31.86±7.25)μg/L]。2.3as、asl變化傷后第1天sFas、sFasL水平均升高,第3天左右達到高峰,后逐漸下降,第14天左右接近對照組水平(表2)。2.4相關分析sFas、sFasL與CD4呈負相關(r分別為-0.64、-0.65,P<0.01)。3免疫細胞參與試驗嚴重創傷可致機體免疫功能紊亂,其中T細胞介導的細胞免疫功能受抑現象尤為突出,且這一變化同傷后感染及預后密切相關,但免疫抑制的原因目前仍不十分明了。因此有關創傷后T細胞的研究正成為創傷免疫領域中的研究熱點。多數研究認為創傷后免疫抑制是機體神經-內分泌-免疫網絡紊亂、血清中免疫抑制作用物質的存在等導致T細胞不能增殖,也不能生成某些刺激性細胞因子(如IL-2等)所致。近年來隨著細胞凋亡理論研究的深入,發現免疫細胞凋亡是誘導傷后免疫抑制重要原因之一。急性損傷后淋巴組織和器官最容易發生細胞凋亡,這可能是導致損傷后機體免疫功能低下的直接原因。巨噬細胞凋亡后,其提呈抗原、細胞吞噬及介質合成等功能喪失將導致嚴重免疫功能障礙。許多動物實驗和臨床研究證實創傷后SIRS或膿毒血癥中淋巴器官和外周血T細胞凋亡增強,直接導致免疫反應能力下降。重型顱腦損傷是神經外科常見病和多發病,已成為嚴重威脅人們生命和健康的常見創傷性疾病。重型顱腦損傷后免疫功能受抑制,極易造成感染及膿毒血癥,使病情急劇惡化。而免疫系統的不適當和彌漫性激活又可導致全身炎癥反應綜合征及神經元繼發性損傷。許多度過原發損傷的危重癥患者,卻未能避免因嚴重感染而帶來的多器官功能衰竭導致的死亡。T細胞不僅是細胞免疫效應細胞,而且是重要的免疫調節細胞。其中CD4和CD8細胞在機體的細胞免疫和體液免疫功能中均發揮重要調節作用。CD4代表輔助性T細胞,CD8代表抑制或殺傷性T細胞。在正常機體中各T細胞亞群相互作用,維持著機體的正常免疫功能,當不同T細胞亞群數量和功能發生異常時,機體就可導致免疫紊亂并發生疾病。IL-2主要由T細胞產生,IL-2是在免疫應答及調節中占重要地位的淋巴因子,它可促使Th細胞生成并產生CK,促進NK細胞的胞毒活性及產生CK,也可促使活化B細胞增生產生抗體,并能激活單核/巨噬細胞,因此其數值高低能夠間接反映T細胞功能。本研究結果證實腦外傷本身可引起T細胞亞群改變,IL-2、CD4于傷后第1天顯著下降,傷后第14天呈回升趨勢;CD8水平傷后第1天顯著升高,第14天趨于降低。近年來研究認為重型顱腦損傷患者早期細胞免疫受到極大影響,主要表現為在循環中的T細胞、Th細胞、Ts細胞及NK細胞數量顯著減少,并且有學者認為細胞免疫所參與早期反應的殺菌能力降低。重型顱腦損傷后在72h內迅速發生明顯免疫缺陷,雖然吞噬細胞免疫抵抗能力和體液免疫抵抗能力均明顯降低,但受影響最大的仍是細胞免疫。Smrcka等研究發現顱腦損傷患者T細胞免役功能下降最明顯。本研究結果同國內外學者研究結果相類似,說明顱腦損傷后早期體內細胞免疫功能損害,并且與重型顱腦損傷患者病情發展基本一致。Fas(Apo-1,CD95)抗原是一種分子量為(40~50)×103的Ⅰ型跨膜糖蛋白,其廣泛存在于多種組織細胞中,但主要表達于免疫細胞;而其天然配體FasL屬Ⅱ型跨膜糖蛋白,其分子量約為40×103,主要表達于被激活T細胞和B細胞上,且Th1克隆的表達比Th2克隆的表達更高。Fas和FasL均可分泌或脫落至細胞外,成為可溶性功能活動分子,即可溶性Fas(sFas)和可溶性FasL(sFasL)。Fas/FasL系統對維持細胞自身穩定和免疫平衡以及調控免疫應答與外周耐受起重要作用。sFas和sFasL存在于血清中,sFas和sFasL由基質金屬蛋白酶水解膜Fas和FasL而產生,血清sFas和sFasL濃度可反映FasmRNA、FasLmRNA活化程度和膜Fas、FasL表達水平,可表明Fas/FasL系統功能。本研究發現患者傷后早期血漿中Fas、FasL均有不同程度升高,傷后第3天達到高峰,損傷程度越重,Fas、FasL數值升高越明顯,隨著顱腦損傷的恢復,Fas濃度逐漸下降接近正常值。創傷后細胞凋亡的發生在機體內是一種普通現象,而且這種凋亡發生很早,其中淋巴組織和器官包括胸腺、脾臟、骨髓、淋巴結及全身散在淋巴組織等易發生細胞凋亡。文獻報道腫瘤、自身免疫性疾病、外傷患者血清中Fas和sFasL濃度均可反映病情嚴重程度及預測預后。Fukuzuka等報道燒傷會造成淋巴器官內Casepase-3依賴的細胞凋亡增加,胸腺中超過35%T細胞出現凋亡。Ayala等發現盲腸結扎穿孔動物模型胸腺、骨髓和脾中成熟和不成熟淋巴細胞凋亡均明顯增加。Hotchkiss等報道死于膿毒癥患者存在明顯低淋巴細胞血癥,淋巴器官(脾和淋巴結)中淋巴細胞凋亡明顯增加,而且凋亡細胞以CD4T細胞為主。Ertel等檢測了18例腦外傷患者腦脊液,發現FasL濃度明顯升高,且與外傷嚴重程度一致,推測Fas系統可能在腦外傷后繼發性腦損傷中起作用,Fas可能參與了急性顱腦損傷的病理生理過程。本研究結果與Lenzlinger等研究結果相似。因此監測Fas、FasL可輔助臨床對腦外傷的早期診斷,了解病程的發展與轉歸及對預后進行評估,對臨床診治有一定指導意義。本研究提示顱腦損傷患者血清Fas、FasL水平與傷后T細胞功能呈負相關。sFas、sFasL與顱腦損傷病情嚴重程度和并發癥的發生有關;表明顱腦損傷后Fas/FasL系統可能參與傷后神經組織細胞凋亡及免疫應答的調控。有研究顯示傷者sFasL水平與sFas水平呈正相關,說明一旦發生細胞凋亡失衡,機體則存在較強的凋亡調節作用來維持平衡。本組3例死亡者sFasL水平明顯上升,可能與機體復雜的細胞因子級聯以及凋亡調控網絡失控有關。感染組sFas、sFasL水平部分時相高于非感染組,表明抗感染治療過程中抗生素誘導細菌釋放內毒素,可引起機體Fas/FasL表達增強。Papathanassoglou等采用流式細胞技術檢測了35例多器官功能不全患者外周血單核細胞,結果發現患者T細胞數目顯著降低,外周血單核細胞Fas、FasL表達均顯著增加,并與多器官功能不全嚴重程度和病死率呈顯著正相關,表明Fas/FasL系統調節紊亂導致的免疫和炎癥細胞凋亡信號改變可能是SIRS和多器官功能不全發生的重要機制。該項實驗結果提示淋巴細胞凋亡在外科術后危重病患者中也起作用。大量研究證明人類顱腦損傷即刻組織標本中已檢測出有凋亡細胞的存在,通過動物實驗研究認為神經元凋亡與Caspase家族半胱氨酸蛋白酶激活、細胞內氧自由基和鈣離子升高等因素有關。另外有研究證實顱腦損傷患者腦脊液中有大量凋亡白細胞。因此可以推測顱腦損傷后Fas、Fas是導致T細胞功能受抑的重要因素之一。關于創傷性腦損傷后血清中FasL、sFas增多的機制目前沒有明確定論。1999年Choi等認為FasL、sFas于創傷性腦損傷后過表達在于前炎性細胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6及IFN-γ刺激星形膠質細胞所致;Rosenbaum等認為顱腦損傷后局部腦血流障礙-腦梗塞是FasL表達的一個誘因。有研究證實TNF-α可誘導細胞凋亡的發生。TNF-α是一種重要的促炎細胞因子,嚴重創傷、感染等膿毒癥中可以觀測到TNF-α水平明顯升高。TNF-α生物學效應包括促進炎癥和誘導細胞凋亡等。Kato等發現大劑量LPS注射可造成胸腺細胞明顯凋亡,阻斷TNF-α作用可減輕LPS造成胸腺細胞凋亡。進一步研究發現TNF-α不但可直接通過與腫瘤壞死因子受體Ⅰ(TNFRⅠ)和TNFRⅡ結合而誘導細胞凋亡,還可通過促進Fas/FasL表達上調而影響凋亡。嚴重創傷早期在Fas/FasL表達較低時,IL-2作為T細胞的重要生長因子其產生減少可誘導大量T細胞凋亡,從而使機體對膿毒癥的易感性明顯增強,同時也揭示了在膿毒癥早期T細胞數目明顯減少的原因。基礎研究已經證實創傷后小鼠外周血淋巴細胞存在凋亡異常與Fas抗原、Caspase-3、Bel-2、TFN-α等抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白有關。細胞凋亡相關基因有凋亡誘導基因如p53、Fas、ICE、rpr、Bcl-xs、Bax、Bak、Bad、bid及bik等,凋亡抑制基因如Bcl-2、IAP家族(生存素)、Bcl-xl、Al、Bcl-w、Mcl、BAG-1等。Hotchkiss等發現膿毒癥患者中各種淋巴細胞亞群(包括CD4、CD8T細胞等)均出現凋亡增強,且伴有顯著Bcl-2水平下降。Bcl-2是一種細胞凋亡抑制劑,可抑制經線粒體途徑介導的細胞凋亡,其水平下降可引起過度細胞凋亡。外科創傷引起淋巴細胞總數減少的機制為細胞凋亡因子和抗凋亡因子失衡。Delogu等發現手術后24hCD4+和CD8+細胞凋亡率以及Fas、FasL和Caspase-1的表達較術前顯著增高,同時Bcl-2等抗凋亡因子表達下調。CD8+細胞凋亡率與術后感染發生相關。從機體受到創傷作用開始到損傷愈合、功能恢復整個病程的發生發展都與免疫系統功能狀態密切相關。創傷后機體免疫功能紊亂或失調,尤其是T細胞介導的細胞免疫功能受到顯著抑制,使機體防御能力下降,機體傾向于感染及全身衰竭。這種機體的變化單純依靠自身因素糾正是困難的,需要外在因素的介入。但由于目前對創傷免疫紊亂的發生機制尚未澄清,明確有效有針對性的糾正和改善創傷后免疫紊亂的治療策略也就難以提出。因此關于創傷免疫的研究日益受到國內外學者們的極大關注。外科創傷導致的免疫抑制、免疫細胞凋亡和免疫調節治療是目前創傷研究的熱點之一。創傷后過度炎性反應和免疫抑制往往同時發生,所以免疫調節治療旨在恢復免疫應答功能,同時下調而不是阻斷應激性炎性反應,有針對性地抑制免疫細胞過度凋亡,保護淋巴細胞、巨噬細胞、粒細胞和內皮細胞,使之免于過度激活或功能衰竭。抗凋亡治療主要手段有刺激抗凋亡蛋白分子表達和(或)抑制凋亡蛋白分子表達。胸腺肽是一種體內正常生理物質,其不但可以抑制促胸腺細胞凋亡基因蛋白表達、抑制Caspase激活,還可以誘導T細胞分化和成熟,增加CD+T細胞IFN-γ表達和釋放。Krautwald等通過阻斷凋亡信號路徑及效應分子作用,如天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑、內源性Bcl-2在細胞內的強制過度表達等方法,防止淋巴器官、肝臟和小腸等器官細胞凋亡增加,降低實驗小鼠多器官功能不全的發生,提高生存率。基礎研究發現抑制淋巴細胞異常凋亡可明顯改善膿毒癥預后。Chung等報道Fasgld缺陷膿毒癥模型鼠黏膜B細胞凋亡減少且生存率高,Hotchkiss等發現使用凋亡抑制劑抑制淋巴細胞凋亡可明顯改善膿毒癥預后,過表達凋亡抑制蛋白Bcl-2也可提高膿毒癥生存率。因此糾正淋巴細胞異常凋亡應成為治療膿毒癥新的著眼點。Licht等研究也證實rhIFN-γ具有對手術后免疫抑制的調節作用,rhIFN-γ可促進患者術后離體淋巴細胞IL-2、IL-2R分泌,下調IL-4生成,但不影響IL-10的釋放和淋巴細胞增殖。調節傷后免疫狀態的治療還包括給予增強免疫的營養治療以及某些藥物,如補