鋰-匹羅卡品顳葉癲癇大鼠的早期死亡行為

氯化鋁-多酚魯酯的點燃大鼠癲癇模型具有相似的人類癲癇可持續狀態（se）或葉癲癇的特征。病理學研究證實匹羅卡品致癇能誘發海馬門區神經元死亡及苔蘚出芽,類似于人類顳葉癲癇的臨床及病理特征,是理想的顳葉癲癇模型,適用于探討顳葉癲癇形成機理及篩選抗癲癇藥物,用于SE及復雜部分性發作的分子生物學和電生理等多方面研究。我們對這一模型制作的穩定性、重復性及致癇大鼠早期死亡原因,作了進一步的探討及研究。數據和方法1.實驗前適應飼養SPF級健康成年雄性Wistar大鼠60只,體重170～200g,由南方醫科大學實驗動物中心提供(合格證號0050669),由廣州軍區廣州總醫院動物實驗中心飼養。實驗前適應性飼養一周,觀察無自發性癲癇發作入選。所有大鼠隨意飲水、進食,保持12h白晝及12h黑夜的周期環境。2.水、糖、甲醛等為酰氯醛、五%葡萄糖鈉溶液氯化鋰(溶于生理鹽水,美國Sigma公司)、匹羅卡品(溶于生理鹽水,日本WakoPureChemican)、硫酸阿托品(1ml∶0.5mg)、地西泮注射液(2ml∶10mg)、10%水合氯醛、5%葡萄糖氯化鈉溶液;多功能神經電生理監測儀(美國AXON)、電子分析天平等。3.小鼠癲癇發作試驗根據SPSS統計軟件產生隨機數字后,將60只大鼠隨機分為生理鹽水對照組10只、癲癇模型組50只。氯化鋰127mg/kg腹腔注射,18～24小時后給予硫酸阿托品1mg/kg腹腔注射,30min后首劑腹腔注射匹羅卡品30mg/kg,30分鐘后如無Ⅳ級以上發作,可每隔15分鐘注射10mg/kg追加劑量,直至出現Ⅳ級以上無明顯間歇的SE,每只大鼠總量不超過50mg/kg。SE后l小時,腹腔注射地西泮10mg/kg終止SE以降低死亡率,如效果不佳可于30min后再注射1次。對照組予以相同體積的生理鹽水腹腔注射。大鼠癲癇發作癥狀采用Racine(1972年)分級標準:0級:無任何反應;Ⅰ級:面部陣攣,包括眨眼、動須、節奏性咀嚼等;Ⅱ級:Ⅰ級加節律性點頭;Ⅲ級:Ⅱ級加前肢肌陣攣,但無后肢直立位;Ⅳ級:Ⅲ級加后肢直立位;Ⅴ級:全面性強直-陣攣發作,并失去體位控制。點燃出現RacineⅣ級以上并存活者入組。SE后1周內,每天給予5%葡萄糖氯化鈉3～5ml腹腔注射,2次/天,加強能量供給。結果1.racine模型腹腔注射氯化鋰未見RacineⅢ級或以上癲癇發作癥狀。首次注射匹羅卡品30mg/kg未出現RacineⅣ級或以上者12只(24%);第一次追加匹羅卡品10mg/kg,上訴未達標中5只出現RacineⅣ級或以上癲癇發作癥狀;第二次追加匹羅卡品10mg/kg,剩余未達標中3只出現RacineⅣ級或以上癲癇發作癥狀。造模過程中癥狀Racine分級統計,其中Ⅰ級3只(3/50),Ⅱ級4只(4/50),Ⅲ級5只(5/50),Ⅳ級16只(16/50),Ⅴ級22只(22/50)。癲癇模型組點燃最后出現RacineⅣ級以上者46只(92%)。生理鹽水對照組動物無任何抽搐發作跡象。造模時模型組的38只大鼠在注射皮羅卡品后5min左右開始出現動作僵硬及刻板等,10min左右出現“洗臉”、點頭、“濕狗樣”抖動等面部動作,15～20min逐漸出現直立、跌倒、豎尾,甚至跳躍,發作逐漸由上肢延及下肢,以至于全身的強直陣攣發作,最終在30min左右導致SE產生。另有流涎、流淚、結膜充血、大汗、瞳孔縮小、腹瀉等外周膽堿能興奮表現,4～7天后所有入組未死亡大鼠均出現自發性癲發作。SE后l小時,所有致癇大鼠均給予腹腔注射地西泮10mg/kg,其中25只終止SE,余致癇大鼠30min后再次給予腹腔注射地西泮10mg/kg,仍有2只未終止SE并于第二個30min內死亡。2.模型大鼠沙棘波的發放生理鹽水對照組為正常EEG,頻率為16.25～27.86Hz,波幅15.3～50μV,無性波發放。造模時注射皮羅卡品后,癥狀未出現SE或評分未達RacineⅣ～Ⅴ級的大鼠EEG也無性波發放,但腦電波普遍慢化,波幅增高。模型組大鼠棘波發放在SE后25.64±9.07min左右出現,最大頻率28Hz,最高波幅150μV;SE停止后,EEG的高頻率、高波幅棘波仍可持續8.54±0.68h左右,點燃SE后的第1、3天EEG未發現癇性波,但背景波頻率變慢,第1天的波幅較高,第7天后EEG監測均出現周期性樣放電。3.周1月至5月se期①SE期0～6小時期間內死亡6只;7～12小時期間內死亡3只;13～24小時期間內死亡1只。SE期死亡率為21.74%(10/46)。②靜默期第2天及第4天分別死亡1只。靜默期死亡率為4.35%(2/46)。③慢性期無致癇大鼠死亡。總死亡率為26.09%(12/46)。4.腦表面明顯,腦切實有張力癲癇模型組SE期致癇大鼠死亡后立即行顱腦及肺部解剖。大鼠顱腦解剖見腦脊液明顯減少,全腦組織腫脹,以前腦明顯,腦表面為灰白色,腦切面濕潤質軟。腦組織切片光鏡下所見腦血管擴張充血及輕-中度的腦水腫。肺部解剖見氣管大量分泌物,胸腔積血積液,肺組織肉眼可見肺表面濕潤,有散在出血點。病理切片見肺間質毛細血管擴張、充血,肺間質和肺泡腔內可見含蛋白液體滲出,提示肺水腫。氯化鋰-匹羅卡品致癇模型的合成鋰-匹羅卡品大鼠模型是Honchar等1983年在Science雜志上首次報道,此模型致癇鼠可出現SRS,且可導致海馬結構易損區的特異性損傷,被認為是具有與人類顳葉癲癇相似特征的致癇鼠模型,該模型使用匹羅卡品的量較大劑量匹羅卡品模型用量大大減少,降低了匹羅卡品的毒副作用所造成的高死亡率,同時增加了SE的誘發率,是近年來國外應用較多的一種公認的邊緣系統癲癇模型。鋰-匹羅卡品致癇模型的機制尚不十分清楚。Cavalheiro認為氯化鋰和匹羅卡品所致癲癇模型中,神經元損傷部位主要位于前腦,包括海馬、齒狀回、梨狀皮層等區;而在丘腦、嗅結節、新皮層、黑質、杏仁核等處也可觀察到有神經細胞的缺失。匹羅卡品是乙酰膽堿M受體激動劑,乙酰膽堿是腦內主要的興奮性神經遞質,引起持續性的全身強直-陣攣發作。Voutsinos-Porche等認為氯化鋰的作用機制是通過抑制肌醇單磷酸酶,導致循環降解產物第二信使IP3和DG可利用度降低及腦內肌醇水平,與匹羅卡品有協同作用,預先應用氯化鋰注射,可降低匹羅卡品誘發癇性發作的閾值而減少匹羅卡品劑量進而減少其毒副作用,降低致癇動物的死亡率。本研究在氯化鋰-匹羅卡品顳葉癲癇模型的基礎上對匹羅卡品的用法及致癇大鼠SE后的對癥處理做了一些改進,匹羅卡品30min后如無Ⅳ以上癇性發作,繼續給予10mgPkg匹羅卡品注射,每隔30min追加一次,自到出現SE為止。為保證實驗條件的均一性,每只大鼠總量不超過50mgPkg。在配置配置匹羅卡品溶液發現配置匹羅卡品的濃度不能過低,若濃度過低會導致匹羅卡品劑量增加,可能是由于短時間不能達到較高的血藥濃度而不能發揮其致SE的作用。SE肢體劇烈抽搐造成能量及體液消耗,以及外周膽堿能受體M樣作用所致的消化液和汗液過量分泌,使大鼠極易休克,出現對外界無反應狀態,絕食水,因而SE期后毒性階段致癇鼠死亡多因營養耗竭。因而本研究在SE后1周給予腹腔注射糖鹽加強營養,與文獻報道相比,以上改進既增加了SE誘發率又降低了死亡率。在本組實驗中,注射氯化鋰-匹羅卡品后,癲癇模型組點燃最后出現RacineⅣ級以上者46只(92%),癲癇模型點燃后總死亡率為26.09%(12/46),其中SE期死亡率為21.74%(10/46)。說明鋰-匹羅卡品顳葉癲癇模型致癇成功率高,致癇后總體死亡率不高,且主要集中于SE期。分析原因:①腹腔注射匹羅卡品前30min給予硫酸阿托品1mg/kg腹腔注射,雖然能有效地減輕匹羅卡品本身導致的外周膽堿能效應,對減少腺體分泌,緩解支氣管痙攣,改善呼吸極為重要。然而雖然地西泮靜脈注射是臨床搶救癲癇現場發作的首選藥物,而在本模型抗癲癇作用并不理想,第一次腹腔注射后終止SE率僅為54.35%(25/46),追加劑量后仍有2只致癇大鼠未能終止SE并于第二個30分鐘內死亡。就其原因除與在本模型中,地西泮采用腹腔注射,導致油劑吸收緩慢而不規則外,地西泮可能使大鼠吞咽、嗆咳反射減弱或消失,呼吸道分泌增多,加重匹羅卡品本身導致的膽堿能效應,使支氣管痙攣和腺體分泌增加,氣道阻塞進一步加重,引起肺水腫,進而導致腦缺血缺氧,引起全腦水腫,導致致癇大鼠死亡。死亡大鼠經解剖證實均存在急性肺水腫及腦水腫即是最好證明。②本研究在SE后1周給予腹腔注射糖鹽加強營養,有效地減輕毒性階段因厭倦不動、不進食物及飲水、體重減輕、脫水等導