小麥條銹病抗性的超微結構研究

國內外廣泛實踐證明，利用品種抗病性防治小麥銹病是最經濟有效的措施之一。進行麥類銹菌與其寄主互作關系的研究,可闡明寄主植物的抗銹機制及病菌的致病機理,從而為抗銹品種的選育與合理利用提供科學依據,并為抗銹生理生化、分子生物學研究奠定基礎。這一研究領域涉及遺傳學、組織學、細胞學、生物化學和分子生物學等學科,而互作關系中組織學和超微結構則是該研究領域的一個重要組成部分。在小麥的3種銹病中,國外學者已從組織學和細胞學方面對稈銹菌、葉銹菌與小麥的互作關系開展了系統深入的研究,然而,小麥條銹病未受到應有的重視。近年來,筆者利用生物電鏡技術就小麥與條銹菌的親和組合和非親和組合的細胞學特征進行了系統研究,發現小麥條銹菌的一些主要超微結構特征明顯不同于其它2種小麥銹菌。并對小麥條銹菌在親和組合中的侵染及寄主反應的細胞學時間順序進行了報道。筆者又以低反應型抗性小麥為試材,報道非親和組合中小麥與條銹菌相互關系的組織學和細胞學特征。1材料和方法1.1種cy29、323供試小麥品種天選882、牛朱特、雜種46、輝縣紅,小麥條銹菌條中28號小種(CY28)、29號小種(CY29)由西北農林科技大學植物病理研究所提供。天選882小麥品種與CY29組成免疫組合;小麥品種雜種46和牛朱特分別與條中CY29、CY28構成近免疫組合;輝縣紅與CY28構成感病對照組合。1.2麥條銹菌的繁殖小麥幼苗材料按康振生等介紹的方法在植物生長箱中培養,當小麥第一葉展平時,即用于接種試驗。小麥條銹菌菌種按常規方法在感病小麥品種輝縣紅上繁殖。接種時,將新收取的病菌夏孢子與滑石粉混合,用毛筆蘸取并均勻地輕涂于葉表,經噴霧、保濕24h后,接種幼苗繼續在生長箱中培養。根據試驗觀察需要,分別于接種后24、36、48、72、96、120h取樣,用于不同的染色處理。1.3熒光顯微鏡觀察將接種小麥葉片切成2cm長葉段,按康振生等介紹的熒光染色法(染色劑為CalcoflourWhite)處理后制片,然后用OlympusH2-F熒光顯微鏡和OlympusBH-2微分干涉顯微鏡觀察、測定和記載。每處理隨機檢查30個侵染點,統計觀測指標包括菌絲長度、菌絲分枝數,吸器母細胞數及寄主細胞壞死情況。1.4微生物的干涉接種小麥葉片的整葉透明處理按魏國榮等介紹的方法進行,葉段于甲醇-氯仿液中處理6h后,在乳酚油-乙醇液中煮沸1.5min,放置過夜后,轉至飽和水合氯醛中,3d后在微分干涉顯微鏡下觀察。每處理隨機檢查30個侵染點,觀測統計吸器數目。1.5葉片的預處理接種小麥葉片透射電鏡樣品的加工處理按康振生介紹的方法進行。將葉片切成小塊,經3%戊二醛和1%鋨酸雙固定,用系列丙酮脫水、Epon812樹膠包埋。樣品超薄切片經醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后,于Philips420型透射電鏡觀察。2結果與分析2.1葉片組織型感病品種輝縣紅接種CY28后呈典型的4型反應,夏孢子堆大而多,破裂呈粉狀,周圍組織無枯死反應,早期無失綠現象,屬高度感病型;雜種46接種CY29、牛朱特接種CY28后呈0;型反應,即近免疫反應型,葉片呈失綠、枯死斑反應,無夏孢子堆產生;天選882接種CY29后不產生任何可見癥狀,葉色正常,為0型反應,屬免疫型。2.2氣孔紅氣濕性測定條銹菌夏孢子在小麥葉表萌發后產生芽管,芽管經擴展而由氣孔伸入葉組織內,并相應產生初生菌絲、初生吸器母細胞、初生吸器及次生菌絲和吸器。在小麥品種與條銹菌的不同組合中,病菌的生長發育及寄主的反應表現出明顯的差異。2.2.1近免疫組合檢測菌落生長規律接種后48h內,不同抗性組合中的病菌均以初生菌絲形態存在,未形成典型的分支,菌絲線性生長與感病對照相似。接種后48h觀察,只有感病對照產生次生菌絲,其線性長度大于其它抗性組合。近免疫組合在接種后96h病菌出現簡單分支,免疫組合則在整個采樣過程中一直未產生次生菌絲、無菌落形成。與之相對應,菌落的線性長度與分支數變化規律相似,在接種后48h內,各組合間菌落線性長度幾乎沒有差異,從接種后48h開始,完全免疫組合和近免疫組合中菌落擴展非常緩慢。到接種后96h,近免疫組合和免疫組合菌落線性長度都遠遠小于感病對照,而免疫組合的菌落線性長度也小于近免疫組合(表1)。2.2.2近免疫組合中吸器母細胞和吸器的變化接種后24h所有組合中病菌都產生了初生吸器母細胞和初生吸器,每侵染點吸器母細胞和吸器數目在接種后48h內增加緩慢,各組合間差異很小。近免疫組合中從接種后48h開始吸器母細胞和吸器形成明顯受抑,到接種后96h,吸器母細胞和吸器的數量僅有感病對照的9%～11%。免疫組合從接種后48h開始吸器母細胞和吸器的數目明顯少于感病對照,同時也少于相應的近免疫組合,在整個采樣期幾乎無明顯增長(表2)。2.2.3肝胰腺組織病理變化寄主細胞壞死是不同抗性組合接種后所表現出的一種普遍現象(表3)。接種后24h就可觀察到散生于侵染點周圍壞死的葉肉細胞,而且免疫組合中含壞死葉肉細胞的侵染點比率明顯高于近免疫組合。近免疫組合中,葉肉細胞壞死面積大,發生頻率及程度高;侵染點周圍,與侵染菌絲接觸或不接觸的寄主葉肉細胞均可大面積壞死,病菌的侵染結構常常被包圍在其中。完全免疫組合中寄主葉肉壞死面積并不大,多數壞死細胞為初生吸器母細胞所接觸或入侵的細胞,少數為鄰近未受侵染的細胞。觀察發現條銹菌菌絲生長受抑與寄主細胞壞死密切相關,菌落線性生長受抑與寄主細胞壞死同步發生或寄主壞死后12h發生。在不同抗性組合中,含壞死細胞的菌落平均線性長度明顯小于無壞死細胞的菌落,這表明寄主細胞壞死對抑制病原菌的生長有重要作用。2.3病原菌胞間細菌感染級電鏡觀察發現在抗病品種上病菌不僅生長發育受抑,而且病菌的胞間菌絲、吸器母細胞、吸器在形態和結構上也發生了一系列的變化,同時寄主細胞也產生了相應的結構防衛反應。2.3.1由細菌細胞膜轉化為細胞細胞器在接種初期(接種后48h),胞間菌絲的形態基本正常,但菌絲細胞原生質的電子致密度加深,液泡增多,同時出現大量泡狀物(圖版Ⅰ-1～4)。隨后菌絲內液泡增大,泡狀物與菌絲細胞質膜融和而沉積到菌絲壁上,使得菌絲細胞壁加厚,同時菌絲細胞質開始紊亂,線粒體腫脹,菌絲質膜和細胞核膜染色加深,細胞器部分解體。到寄主癥狀明顯時(接種后4～5d),菌絲細胞壞死畸形(圖版Ⅱ-1～3),細胞質完全解體或凝聚變黑,菌絲細胞壁不規則增厚,并且發現大量電子致密度的物質從菌絲細胞滲出。2.3.2吸器母細胞的發育吸器母細胞通常位于胞間菌絲的頂端,其主要功能是產生入侵栓、穿越寄主細胞壁而在寄主細胞內形成吸器(圖版Ⅰ-2)。電鏡觀察發現,吸器母細胞的發育在不同抗性組合中存在兩種類型:一部分吸器母細胞的形態結構正常,可侵入寄主細胞并產生吸器(圖版Ⅱ-4);而另一部分吸器母細胞的發育明顯受抑,吸器母細胞的原生質和細胞器發生了類似于以上胞間菌絲細胞的不正常變化,而最終變為畸形(圖版Ⅱ-5),喪失產生入侵栓結構和吸器的能力。2.3.3吸器受抑類型吸器是銹菌形成于寄主細胞內的惟一結構,其主要功能是從寄主細胞內吸取發育所需的營養物質。電鏡觀察發現,在感病品種上成熟的小麥條銹菌吸器由呈管狀的吸器頸部和呈球形的吸器體組成。在不同抗性組合上,小麥條銹菌病菌所形成的吸器形態異常、發育受抑。根據吸器發育受抑的程度和吸器畸形的特點,可將吸器受抑的類型分為兩類。第一類為吸器發育早期受抑型,吸器體一般不能正常膨大,僅產生一些不規則的分枝而呈畸形(圖版Ⅲ-1);第二類為吸器發育后期受抑,初形成的吸器其形態和結構正常,但隨進一步發育,吸器內出現一系列的異常變化,其中包括吸器質膜與細胞核質膜電子致密度加深、原生質內液泡增多且逐漸增大、線粒體腫大破裂、吸器外間質不規則加寬并出現致密度深的物質,吸器最終壞死而變成畸形(圖版Ⅲ-2,3)。2.3.4獨立的微生物細胞當條銹菌侵染不同抗病品種后,寄主細胞的反應較為復雜,其抗病反應主要涉及寄主細胞新的防衛結構的形成和寄主細胞的壞死過程。電鏡觀察發現,在感病小麥品種上,當條銹菌胞間菌絲在寄主細胞間擴展時,寄主細胞通常無明顯反應,其細胞器仍保持正常狀態。然而,當病菌在抗病品種上擴展時,寄主細胞通常可產生兩種防衛反應結構:第一種是在與菌絲接觸的寄主細胞內,細胞壁與質膜間沉積出一層電子致密度高的物質,即胞壁沉積物(圖版Ⅲ-4);第二種是在病菌穿過寄主細胞壁處,寄主細胞往往可分泌大量的胼胝質而形成乳突結構,同時寄主細胞可在吸器周圍形成大量電子致密度高的物質,將吸器完全包圍起來,從而使得吸器體不能正常膨大而呈畸形,并最終壞死(圖版Ⅲ-1)。寄主細胞的壞死一般都發生在受侵細胞和侵染點四周的細胞,電鏡觀察發現在寄主細胞的壞死過程中,寄主細胞的質膜、液泡膜、葉綠體外膜的染色程度首先加深,隨后細胞質致密度加深,細胞器排列紊亂、松散,最后細胞質凝集,細胞器解體,整個細胞壞死畸形(圖版Ⅲ-5)。同時壞死寄主細胞和壞死菌絲的滲出物往往也可造成相鄰寄主細胞的壞死。3．流式抗條銹菌的急性毒性反應小麥對條銹病的低反應型抗性是目前小麥生產中廣泛應用的一類抗性。筆者采用熒光顯微鏡、微分干涉顯微鏡和電鏡技術,較系統地研究了此類抗性的免疫和近免疫組合中病菌和寄主在組織學和超微水平上的一系列變化特征,所獲結果有助于對寄主的抗條銹機制有更深入的了解。研究結果表明,小麥條銹菌在感病品種和抗病品種上的發育存在明顯的差異。小麥低反應型抗性組織學表現為病菌菌絲生長受抑,菌落形成延遲或敗育,病菌吸器母細胞和吸器形成量明顯減少;電鏡觀察揭示出在抗病品種上,病菌的胞間菌絲、吸器細胞和吸器在細胞和細胞亞水平均發生了一系異常變化,其中包括原生質的電子致密度加深,細胞內液泡增多變大,菌絲細胞壁不規則增厚,細胞器排列紊亂及解體,吸器母細胞及吸器喪失其生理功能,病菌最終畸形壞死。同時,筆者還觀察到抗病品種被條銹菌侵染后,寄主細胞防衛結構如胞壁沉積物、胼胝質的形成速率及在細胞中的分布范圍遠遠高于受感染的感病品種。病菌生長受抑的這些表現無疑是與寄主抗病性的表達密切相關。小麥條銹菌與小麥非親和組合的這些組織學和細胞學特點與小麥稈銹病、燕麥冠銹病、谷子銹病及菜豆銹病體系中所報道的結果基本一致。過敏性壞死反應是典型的抗病性機制,絕大多數抗銹基因,特別是低反應型抗銹基因多是通過過敏性壞死反應來發揮作用的。各國學者多根據寄主細胞壞死和銹菌發育受抑的時間順序來評價寄主壞死的作用。筆者發現,寄主細胞壞死就是低反應型抗條銹性所表現出的一種普遍現象,接種后24h就可以觀察到侵染點周圍寄主葉肉細胞壞死的現象,并且含壞死細胞的菌落生長的受抑程度明顯高于無壞死細胞的菌落,故寄主細胞壞死對抑制病菌的生長具有重要作用,這表明在小麥條銹菌與小麥這一體系中,寄主過敏性壞死反應是小麥抗條銹性的重要機制之一。關于導致過敏性反應的時間順序在不同的寄主-病菌體系中存在不同的觀點。Harder等、Heath曾分別研究了小麥與小麥稈銹菌、菜豆與菜豆銹菌非親和組合的超微結構,指出寄主的壞死與銹菌吸器的壞死幾乎是同時發生;Skipp等、Rohringer等通過小麥抗銹近等基因系與小麥稈銹菌互作的組織學和超微結構研究,認為受侵寄主細胞的壞死往往先于銹菌吸器的壞死。然而,筆者通過對不同抗條銹性組合中的細胞學觀察,發現吸器受抑或壞死時,受侵寄主細胞大都基本正常,未觀察到吸器正常而寄主細胞壞死的情況,故在小麥與條銹菌非親和組合中寄主細胞壞死晚于吸器壞死,而吸器的壞死可能是寄主細胞生理或生化代謝影響的結果。Prushy等從定性和定量方面分析了燕麥冠銹菌與寄主間的互作關系,發現寄主細胞的壞死遲于吸器的壞死,這一結果與小麥條銹病的系統相類似。因此,在銹菌與其寄主的互作過程中,就寄主細胞與病菌吸器壞死間的順序關系因病菌—寄主、及寄主所含抗性基因的不同而存在較大的差異。那么,寄主細胞過敏性壞死反應的分子機制是否存在類似的差異值得進一步探索。植物細胞受病原物侵染時在細胞壁與質膜所沉積形成的胞壁沉積物(cellwallapposition)是植物抵御病菌侵染的重要防衛結構之一。Jacobs在研究慢銹性小麥對葉銹病的組織學抗性機制時發現,受侵小麥細胞形成的胞壁沉積物極為常見,認為胞壁沉積物的形成是小麥抗葉銹病的主要抗性機制之一。筆者觀察發現,感病品種被小麥條銹菌侵染后,很難在被侵組織中觀察到胞壁沉積物的形成,然而在被侵的低反應抗型的小麥品種上,其被侵組織中形成的胞壁沉積物不僅極普遍,而且其厚度有時遠遠大于寄主細胞壁,同時壞死的寄主細胞及病菌菌絲的滲出物也可以誘發相鄰的寄主細胞形成胞壁沉積物。最近,筆者采用細胞化學和免疫細胞化學方法就胞壁沉積物中的成分進行了定位分析,發現其內含有β-1,3-葡聚糖、纖維素和木質素等物質。抗病小麥品種受條銹菌侵染形成的胞壁沉積物,不僅可加固寄主細胞壁對病菌侵入抗性的物理作用,而且可阻礙病菌分泌的有毒物質向寄主細胞內擴散。因此,胞壁沉積物的形成可被認為是小麥抗條銹性的重要結構防衛反應之一。銹菌吸