重組甘露醇-1-磷酸脫氫酶的分離純化和鑒定

ppt演講：ppt制作：組員：目錄實驗目的實驗背景和主要原理實驗試劑實驗步驟預期結果實驗目的了解包涵體內蛋白質分離純化的基本原理和操作學習親和層析的基本原理和操作方法學習蛋白質含量的測定方法學習酶活性的測定方法和操作實驗背景和主要原理甘露醇-1-磷酸脫氫酶(MTLD)是甘露醇類滲透保護劑的生物合成關鍵酶。我們組在之前的《基因工程實驗技術》課程中構建了甘露醇-1-磷酸脫氫酶表達菌。成功構建重組表達質粒pET-28a(+)/MTLD，并轉化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)感受態細胞，已獲得能大量表達生甘露醇-1-磷酸脫氫酶的重組體克隆。本實驗項目為自選課題，主要內容為重組甘露醇-1-磷酸脫氫酶的分離純化、鑒定和活性測定。Fructose-6-phosphate(F6P)Mannitol-1-phosphate(M1P)MannitolATPFructoseHexokinase(HK)Mannitol-2-dehydrogenase(M2DH)NAD(P)+Mannitol-1-phosphatephosphatase(M1Pase)Mannitol-1-phosphatedehydrogenase

(M1PDH)ADPNAD(P)HPiNAD+NADH滲透保護劑細胞內蛋白質分離的基本步驟是：清洗細胞、裂解細胞、離心去除膜組分等獲得可溶性蛋白質，然后通過鹽析、層析等方法進行分離純化，以獲得蛋白產物。分離純化的情況可用SDS電泳檢測。如果目標產物表達后形成包涵體，包涵體蛋白的分離需要經過細胞破碎、收集包涵體、洗滌包涵體（去除吸附在蛋白質表面的不溶性雜蛋白和其它雜質）、包涵體變性溶解和變性蛋白質的復性等步驟，再進行與一般蛋白質相同的分離純化。用pET-28a質粒載體構建的蛋白表達產物中，目標蛋白與載體上設計的組氨酸標簽融合表達，可以用鎳柱進行金屬離子親和純化。金屬離子親和層析是利用金屬離子的絡合物或形成螯合物的能力（如鎳）吸附蛋白質的分離系統。金屬鏊合介質預裝柱（鎳柱）

鎳柱分離蛋白原理圖材料、試劑1實驗材料重組甘露醇-1-磷酸脫氫酶甘油菌（載體pET-28a，受體菌E.coliBL21）2實驗試劑咪唑、卡那霉素（Kan）、IPTG（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）、去垢劑TritonX-100、低分子量蛋白質Marker總提取路線

甘露醇-1-磷酸脫氫酶的誘導表達

細胞超聲破碎

包涵體的清洗包涵體的變性溶解

鎳柱純化LDH洗脫條件優化鎳柱純化LDH

檢測方法

蛋白含量測定

酶活性測定

SDS電泳鑒定

甘露醇-1-磷酸脫氫酶的誘導表達甘油菌

LB液體培養基中培養活化6h

按1：100接入錐形瓶中培養IPTG

誘導4h

SDS電泳卡那霉素細胞超聲破碎

離心15min

蒸餾水清洗3次

收集菌體

BufferI懸浮超聲破碎40min

離心10minSDS電泳去上清上清沉淀目的蛋白的存在部位包涵體的清洗超聲波破碎液

離心10min

沉淀

BufferⅠ清洗

BufferⅡ清洗

沉淀振蕩0.5h

（37℃）離心10min

沉淀

BufferII清洗

沉淀

蒸餾水清洗

沉淀

注：包涵體變性前必須通過

清洗盡可能去除雜質去上清

包涵體的變性溶解

清洗后的包涵體沉淀用10mL尿素變性液（50mMTris-HCl，8M尿素，pH8.0）懸浮，